Παρόν†Τρέχουσα διεύθυνση: OX11 0DE, Ηνωμένο Βασίλειο, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Ηνωμένο Βασίλειο, Diamond Light Source Co., Ltd., Ηλεκτρονικό Κέντρο Βιολογικής Απεικόνισης.
Το σύμπλοκο συλλογής φωτός 1 του κέντρου αντίδρασης (RC-LH1) είναι το βασικό φωτοσυνθετικό συστατικό των μωβ φωτοτροφικών βακτηρίων. Εισαγάγαμε δύο δομές κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας του συμπλόκου RC-LH1 από το Rhodopseudomonas palustris. Η δομή ανάλυσης 2,65-Å του συμπλόκου RC-LH114-W αποτελείται από 14 βρόχους υπομονάδας LH1 που περιβάλλουν το RC, το οποίο διακόπτεται από την πρωτεΐνη W, ενώ το σύμπλοκο χωρίς πρωτεΐνη-W είναι πλήρως RC σύνθεση που περιβάλλεται από RC. Κλειστός βρόχος LH1 16 υπομονάδων. Η σύγκριση αυτών των δομών παρέχει πληροφορίες για τη δυναμική της κινόνης στο σύμπλοκο RC-LH1, συμπεριλαμβανομένων προηγουμένως απροσδιόριστων διαμορφωτικών αλλαγών κατά τη σύνδεση της κινόνης στη θέση QB του RC, καθώς και τη θέση των βοηθητικών θέσεων σύνδεσης κινόνης, οι οποίες βοηθούν στη μετάβασή τους στο RC. Η μοναδική δομή της πρωτεΐνης W εμποδίζει το κλείσιμο του βρόχου LH1, δημιουργώντας έτσι ένα κανάλι για την επιτάχυνση της ανταλλαγής κινόνης/κινολόνης.
Η ενέργεια που παρέχεται από τη φωτοσύνθεση μπορεί να διατηρήσει σχεδόν όλη τη ζωή στη Γη και έχει μεγάλο δυναμικό για την ηλιακή βιοτεχνολογία. Ενώ προωθούν την παγκόσμια φωτοσύνθεση, τα μωβ φωτοτροφικά βακτήρια παρουσιάζουν επίσης διάφορους ενεργειακούς τρόπους και μεταβολικές ικανότητες. Μπορούν να αποφύγουν τη φωτοσύνθεση και να αναπτυχθούν ως ετερότροφα βακτήρια στο σκοτάδι, μπορούν να δεσμεύσουν άζωτο και διοξείδιο του άνθρακα, να παράγουν υδρογόνο και να αποικοδομήσουν αρωματικές ενώσεις (1-3). Για να παρέχεται ενέργεια για αυτές τις διεργασίες, το φως πρέπει να μετατρέπεται γρήγορα και αποτελεσματικά σε χημική ενέργεια. Αυτή η διαδικασία ξεκινά όταν το σύμπλεγμα κεραίας που παγιδεύει το φως απορροφά το φως και μεταφέρει την παγιδευμένη ενέργεια στο κέντρο αντίδρασης (RC), ξεκινώντας έτσι τον διαχωρισμό φορτίου (4-7). Η βασική μονάδα φωτοσύνθεσης στα μωβ φωτοτροφικά βακτήρια αποτελείται από RC τύπου 2, που περιβάλλεται από σύμπλεγμα συλλογής φωτός 1 (LH1), σχηματίζοντας το βασικό σύμπλεγμα RC-LH1. Η LH1 σχηματίζεται από μια σειρά καμπύλων ετεροδιμερών αβ, καθένα από τα οποία δεσμεύει δύο μόρια βακτηριακής χλωροφύλλης (BChl)α και ένα ή δύο καροτενοειδή (8-12). Η απλούστερη κεραία LH1 αποτελείται από 16 ή 17 αβ ετεροδιμερή που περιβάλλουν την RC (9-13) σε έναν κλειστό βρόχο, αλλά σε άλλα πυρηνικά σύμπλοκα, τα διαμεμβρανικά πεπτίδια διακόπτουν τη συνέχεια της περιβάλλουσας LH1, προωθώντας έτσι τη διάχυση κινόλης/κινόνης μεταξύ της RC και του συμπλόκου κυτοχρώματος bc1 (11, 13-15). Το μωβ φωτοτροφικό φυτό Rhodopseudomonas (Rps.) είναι ένας οργανισμός-μοντέλο που μπορεί να κατανοήσει τη μεταφορά ενέργειας και ηλεκτρονίων που υποστηρίζει τη φωτοσύνθεση. Η πρώτη κρυσταλλική δομή της Rps. Το μοντέλο του συμπλόκου palustris RC-LH1 είναι η RC, που περιβάλλεται από 15 ετεροδιμερείς βρόχους LH1, οι οποίοι διακόπτονται από μια άγνωστη πρωτεΐνη που ονομάζεται «Πρωτεΐνη W» (14). Η πρωτεΐνη-W στη συνέχεια ταυτοποιήθηκε ως RPA4402, η οποία είναι μια μη χαρακτηρισμένη πρωτεΐνη 10,5kDa με τρεις προβλεπόμενες διαμεμβρανικές έλικες (TMH) (16). Προτείνουμε να μετονομάσουμε το γονίδιο rpa4402 που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη W σε pufW, ώστε να είναι σύμφωνο με την ονοματολογία που χρησιμοποιείται για τα γονίδια που κωδικοποιούν τις υπομονάδες RC-L, M (pufL, pufM) και LH1α, β (pufA, pufB). Είναι ενδιαφέρον ότι η πρωτεΐνη-W υπάρχει μόνο σε περίπου 10% της RC-LH1, αποκαλύπτοντας ότι το Rps. palustris παράγει δύο διαφορετικά σύμπλοκα RC-LH1. Εδώ, αναφέρουμε τις δομές υψηλής ανάλυσης κρυο-EM (cryo-EM) δύο βασικών συμπλεγμάτων, το ένα με πρωτεΐνη W και 14 αβ ετεροδιμερή, το άλλο χωρίς πρωτεΐνη W και έναν κλειστό βρόχο LH1 16 ετεροδιμερών. Η δομή μας αντιπροσωπεύει μια σταδιακή αλλαγή στην κατανόηση του συμπλόκου RC-LH1 του Rps. palustris, επειδή έχουμε αναλύσει τον ομοιογενή πληθυσμό κάθε παραλλαγής και έχουμε επαρκή ανάλυση για να αντιστοιχίσουμε με σαφήνεια κάθε πεπτίδιο και συνδεδεμένες χρωστικές και σχετικές λιπίδια και κινόνες. Η σύγκριση αυτών των δομών δείχνει ότι οι τρεις πρωτεΐνες TMH-W που δεν έχουν βρεθεί μέχρι στιγμής σε κανένα άλλο σύμπλεγμα RC-LH1 δημιουργούν ένα κανάλι κινόνης για να επιταχύνουν την ανταλλαγή κινόνης/κινολόνης. Έχουν εντοπιστεί ορισμένες διατηρημένες θέσεις δέσμευσης λιπιδίων και κινόνης και έχουμε αποκαλύψει μια νέα διαμορφωτική αλλαγή μετά τον συνδυασμό κινόνης και RC, η οποία μπορεί να είναι κατάλληλη για το φωτοσύστημα II (PSII) RC οξυγονωμένων φωτοτρόφων οργανισμών. Τα ευρήματά μας παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με την κινητική της δέσμευσης και ανταλλαγής κινόνης/κινολόνης στο βασικό σύμπλεγμα RC-LH1 των μωβ φωτοτρόφων βακτηρίων.
Προκειμένου να διευκολυνθεί η λεπτομερής μελέτη των δύο συμπλεγμάτων που βρίσκονται στο Rps. palustris, απομονώνουμε κάθε RC-LH1 με βιοχημικές μεθόδους. Το σύμπλοκο με έλλειψη πρωτεΐνης W (εφεξής αναφερόμενο ως ΔpufW) καθαρίστηκε από το στέλεχος που δεν έχει το γονίδιο pufW (16), και μπορεί να παραχθεί μόνο ένα σύμπλοκο RC-LH1. Το σύμπλοκο που περιέχει πρωτεΐνη W παράγεται από ένα στέλεχος. Η πρωτεΐνη W αυτού του στελέχους τροποποιείται με μια ετικέτα His 10x στο C-άκρο της, έτσι ώστε το σύμπλοκο που περιέχει πρωτεΐνη W να μπορεί να συνδυαστεί αποτελεσματικά με το μεγαλύτερο μέρος των συμπλεγμάτων που στερούνται πρωτεΐνης W ακινητοποιώντας το μέταλλο. Το σύμπλοκο διαχωρίζεται αποτελεσματικά (16) Χρωματογραφία Συγγένειας (IMAC).
Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, και τα δύο σύμπλοκα περιέχουν μια RC τριών υπομονάδων (RC-L, RC-M και RC-H) που περιβάλλεται από μια κεραία LH1. Η δομή 2,80-A του συμπλόκου που δεν έχει πρωτεΐνη-W εμφανίζει 16 αβ ετεροδιμερή, σχηματίζοντας έναν κλειστό βρόχο LH1 που περιβάλλει πλήρως την RC, στο εξής αναφερόμενο ως σύμπλοκο RC-LH116. Η δομή 2,65Å του συμπλόκου που περιέχει πρωτεΐνη-W έχει ένα 14-ετεροδιμερές LH1 που διακόπτεται από πρωτεΐνη-W, στο εξής αναφερόμενο ως RC-LH114-W.
(A και B) Επιφανειακή αναπαράσταση της ένωσης. (C και D) Συνδεδεμένες χρωστικές ουσίες εκφρασμένες σε ραβδία. (E και F) Τα σύμπλοκα που παρατηρούνται από την κυτταροπλασματική επιφάνεια έχουν τα πεπτίδια και τις υπομονάδες LH1 που αναπαρίστανται σε κινούμενα σχέδια και αριθμούνται δεξιόστροφα από το κενό πρωτεΐνης-W [σύμφωνα με την αρίθμηση Rba. σύμπλοκο sphaeroides (13)]. Για την LH1-α, το χρώμα της πρωτεϊνικής υπομονάδας είναι κίτρινο. για την LH1-β, το χρώμα της πρωτεϊνικής υπομονάδας είναι μπλε. για την πρωτεΐνη-W, η πρωτεΐνη είναι κόκκινο. για την RC-H, είναι κυανό. για την RC-L, είναι πορτοκαλί. για την RC-M, ματζέντα. Οι συμπαράγοντες αναπαρίστανται με ραβδία, το πράσινο αντιπροσωπεύει τα μόρια BChl και BPha, το μοβ αντιπροσωπεύει τα καροτενοειδή και το κίτρινο αντιπροσωπεύει τα μόρια UQ10. (G και H) Μεγεθυμένη όψη του κενού πρωτεΐνης-W στην ισοδύναμη περιοχή του συμπλόκου RC-LH114-W (G) και του συμπλόκου RC-LH116 (H). Οι συμπαράγοντες εμφανίζονται με τη μορφή πλήρωσης χώρου, η χηλική κινόνη εμφανίζεται με μπλε χρώμα. Το κενό πρωτεΐνης-W επισημαίνεται με μπλε διακεκομμένη γραμμή στο (G) και οι μικρές οπές όπου η κινόνη/κινολόλη διαχέεται στον δακτύλιο LH116 επισημαίνονται με μαύρη διακεκομμένη γραμμή στο (H).
Το Σχήμα 1 (Α και Β) δείχνει το RC περιτριγυρισμένο από ανοιχτές ή κλειστές συστοιχίες ετεροδιμερών LH1αβ, καθένα από τα οποία συνδέεται με δύο BChl και ένα καροτενοειδές (Σχήμα 1, C και D). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το Rps είναι το σύμπλεγμα LH1. Στη βιοσυνθετική οδό της ξανθίνης της σπιρουλίνας, αυτά τα είδη περιέχουν μικτούς πληθυσμούς καροτενοειδών (17). Ωστόσο, η σπιροπυροξανθίνη είναι το κυρίαρχο καροτενοειδές και η πυκνότητά της είναι ικανοποιητική. Επομένως, επιλέξαμε να μοντελοποιήσουμε τη σπιροξανθίνη σε όλες τις θέσεις σύνδεσης LH1. Τα άλφα και βήτα πολυπεπτίδια είναι μεμονωμένες TMHs με βραχείες εξωτερικές περιοχές μεμβράνης (Σχήμα 1, A, B, E και F). Αν και δεν παρατηρήθηκε πυκνότητα 17 υπολειμμάτων στο C-άκρο, το άλφα πολυπεπτίδιο διασπάστηκε από Met1 σε Ala46 και στα δύο σύμπλοκα. Το β πολυπεπτίδιο αναχώρησε από Gly4 σε Tyr52 στο RC-LH116 και από Ser5 σε Tyr52 στο RC-LH114-W. Δεν παρατηρήθηκε πυκνότητα 3 ή 4 Ν-τελικών ή 13 C-τελικών υπολειμμάτων (Σχήμα S1). Η ανάλυση φασματομετρίας μάζας του μικτού συμπλόκου RC-LH1 που παρασκευάστηκε από το στέλεχος άγριου τύπου έδειξε ότι η ελλείπουσα περιοχή ήταν αποτέλεσμα ετερόλογης διάσπασης αυτών των πεπτιδίων (Σχήμα S1 και S2). Παρατηρήθηκε επίσης η Ν-τελική φορμυλίωση του α-Met1 (f). Η ανάλυση έδειξε ότι το α-πεπτίδιο αποτελείται από υπολείμματα fMet1 έως Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, και το β-πεπτίδιο αποτελείται από υπολείμματα Ser2 έως Ala53, κάτι που συμφωνεί σε μεγάλο βαθμό με τον χάρτη πυκνότητας EM χαμηλής θερμοκρασίας.
Ο συντονισμός των α-His29 και β-His36 καθιστά τα BChl αντικριστά. Κάθε ετεροδιμερές αβ συναρμολογείται με τους γείτονές του για να σχηματίσει έναν ανοιχτό βρόχο (RC-LH114-W) ή έναν κλειστό βρόχο (RC-LH116) γύρω από το RC. Η συστοιχία χρωστικών που είναι συζευγμένη με εξιτόνια (Σχήμα 1, C και D). Σε σύγκριση με τη ζώνη των 877 nm του RC-LH114-W, η μετατόπιση απορρόφησης προς το ερυθρό στα 880 nm του RC-LH116 είναι 3 nm (Σχήμα 2Α). Ωστόσο, το φάσμα κυκλικού διχρωισμού είναι σχεδόν το ίδιο (Σχήμα 2Β), υποδεικνύοντας ότι αν και υπάρχει σαφής διαφορά μεταξύ ανοιχτών και κλειστών βρόχων, το τοπικό περιβάλλον των BChl είναι πολύ παρόμοιο. Η μετατόπιση απορρόφησης προς το ερυθρό μπορεί να είναι αποτέλεσμα μειωμένης θερμικής κίνησης και αυξημένης σταθερότητας στον κλειστό βρόχο (18, 19), της αλλαγής στη σύζευξη χρωστικών που προκαλείται από τον κλειστό βρόχο (20, 21) ή ενός συνδυασμού αυτών των δύο επιδράσεων (11).
(Α) Φάσμα απορρόφησης υπεριώδους/ορατού/εγγύς υπέρυθρου, οι κορυφές του οποίου σημειώνονται με τις αντίστοιχες χρωστικές τους και ομαλοποιούνται στην κορυφή BPh στα 775 nm. (Β) Φάσμα κυκλικού διχρωισμού ομαλοποιημένο στην απορρόφηση BChl στα 805 nm. (Γ και Δ) Επιλεγμένα φάσματα ΔA από τα φάσματα απορρόφησης χρονικά διαχωρισμένης του συμπλόκου RC-LH114-W (Γ) και του συμπλόκου RC-LH116 (Δ). Για καλύτερη συγκρισιμότητα, όλα τα φάσματα ομαλοποιούνται στο ΔA του −A στα 0,2 ps. (Ε) Ο ρυθμός οξείδωσης του κυτοχρώματος c2 μετά από ακτινοβολία παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων UQ2 (βλ. Σχήμα S8 για ακατέργαστα δεδομένα). (ΣΤ) Σε κύτταρα που αναπτύσσονται υπό φως χαμηλής, μέσης ή υψηλής έντασης (10, 30 ή 300μMm-2 s-1, αντίστοιχα), οι υπομονάδες πρωτεΐνης W και RC-L στο καθαρισμένο σύμπλοκο και η αναλογία διαχωρισμένης μεμβράνης. Προσδιορίστε το επίπεδο πρωτεΐνης με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου και ανοσοδοκιμασία (βλ. Σχήμα S9 για ακατέργαστα δεδομένα). Προσδιορίστε την αναλογία σε σχέση με το καθαρισμένο σύμπλοκο RC-LH114-W. Η στοιχειομετρική αναλογία της RC-L προς την πρωτεΐνη-W του συμπλόκου είναι 1:1.
Τα BChl στη θέση 1 στον παραμορφωμένο βρόχο αβ14 του RC-LH114-W (Σχήμα 1, A, C και E) είναι πιο κοντά στον πρωτογενή δότη RC (P) κατά 6,8 Å από τα ισοδύναμα BChl στο RC-LH116 (Σχήμα 1, B, D και F, και Σχήμα S3). Ωστόσο, η κινητική της παροδικής απορρόφησης των δύο συμπλόκων δείχνει ότι για τα RC-LH114-W και RC-LH116, οι σταθερές χρόνου μεταφοράς ενέργειας διέγερσης από LH1 σε RC είναι 40 ± 4 και 44 ± 3 ps (Σχήμα 2). , C και D, Σχήμα S4 και Πίνακας S2). Δεν υπάρχει επίσης σημαντική διαφορά στην ηλεκτρονική μεταφορά εντός του RC (Σχήμα S5 και σχετικό συμπληρωματικό κείμενο). Υποψιαζόμαστε ότι η στενή αντιστοιχία του χρόνου μεταφοράς ενέργειας μεταξύ LH1 και RC-P οφείλεται στην παρόμοια απόσταση, γωνία και δυναμική ενέργεια των περισσότερων BChl στους δύο βρόχους LH1. Φαίνεται ότι η εξερεύνηση του ενεργειακού μοτίβου LH1 για την επίτευξη της ελάχιστης απόστασης δεν είναι ταχύτερη από την άμεση μεταφορά ενέργειας από μη βέλτιστες θέσεις στο RC. Ο βρόχος LH1 ανοιχτού βρόχου στο RC-LH114-W μπορεί επίσης να υποστεί ασήμαντη θερμική κίνηση υπό συνθήκες χαμηλής θερμοκρασίας για δομική ανάλυση, και υπάρχει μεγαλύτερη διαμόρφωση δακτυλίου αβ14 σε θερμοκρασία δωματίου από την απόσταση χρωματισμού των βBChls στη θέση του RC1.
Το σύμπλοκο RC-LH116 περιέχει 32 BChl και 16 καροτενοειδή, και η συνολική του διάταξη είναι η ίδια με αυτή που ελήφθη από το Thermochromatium (Tch.) piddipudum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), το στέλεχος Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) και τα πράσινα φύκια (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Μετά την ευθυγράμμιση, παρατηρήθηκαν μόνο μικρές αποκλίσεις στις θέσεις των ετεροδιμερών αβ, ειδικά των 1-5, 15 και 16 (Σχήμα S6). Η παρουσία της πρωτεΐνης-W έχει σημαντικό αντίκτυπο στη δομή της LH1. Οι τρεις TMH της συνδέονται με βραχείς βρόχους, με το Ν-τελικό άκρο στην πλευρά του αυλού του συμπλόκου και το C-τελικό άκρο στην πλευρά του κυτταροπλάσματος (Σχήματα 1Α και 3, Α έως Δ). Η πρωτεΐνη-W είναι σε μεγάλο βαθμό υδρόφοβη (Σχήμα 3Β), και οι TMH2 και TMH3 αλληλεπιδρούν με την LH1αβ-14 για να σχηματίσουν μια διαμεμβρανική επιφάνεια (Σχήμα 3, Β και Ε έως G). Η διεπαφή αποτελείται κυρίως από υπολείμματα Phe, Leu και Val στην διαμεμβρανική περιοχή. Αυτά τα υπολείμματα στοιβάζονται με υδρόφοβα αμινοξέα και χρωστικές αβ-14. Ορισμένα πολικά υπολείμματα συμβάλλουν επίσης στην αλληλεπίδραση, συμπεριλαμβανομένου του δεσμού υδρογόνου μεταξύ W-Thr68 και β-Trp42 στην επιφάνεια της σύνθετης κοιλότητας (Σχήμα 3, F και G). Στην επιφάνεια του κυτταροπλάσματος, η Gln34 γειτνιάζει με την κετοομάδα των καροτενοειδών αβ-14. Επιπλέον, το μόριο n-δωδεκυλο β-d-μαλτοζίτη (β-DDM) διαχωρίστηκε και η υδρόφοβη ουρά του επεκτάθηκε στη διεπαφή μεταξύ πρωτεΐνης-W και αβ-14, και η ουρά λιπιδίου μπορεί να βρίσκεται στο σώμα. Παρατηρήσαμε επίσης ότι οι περιοχές διαχωρισμού στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης W και της RCH είναι πολύ κοντά, αλλά όχι εντός του πεδίου εφαρμογής για τον σχηματισμό συγκεκριμένων αλληλεπιδράσεων (Σχήμα 1, Α και Ε). Ωστόσο, μπορεί να υπάρχουν αλληλεπιδράσεις στα μη διαχωρισμένα αμινοξέα στο C-τελικό άκρο αυτών των δύο πρωτεϊνών, οι οποίες μπορεί να παρέχουν έναν μηχανισμό για την πρόσληψη πρωτεΐνης-W κατά τη συναρμολόγηση του συμπλόκου RC-LH114-W.
(Α) Η πρωτεΐνη-W, η οποία βλέπει στη διεπαφή με την LH1αβ14 σε μορφή κινουμένων σχεδίων, έχει μια πλευρική αλυσίδα σε σχήμα ράβδου (κόκκινη), η οποία εμφανίζεται σε ένα μέρος του διαγράμματος ηλεκτροστατικού δυναμικού (διαφανής γκρίζα επιφάνεια με επίπεδο περιγράμματος 0,13). (Β) Η πρωτεΐνη-W αντιπροσωπεύεται από μια υδρόφοβη έγχρωμη επιφάνεια. Οι πολικές και φορτισμένες περιοχές εμφανίζονται με κυανό, οι υδρόφοβες περιοχές εμφανίζονται με λευκό και οι έντονα υδρόφοβες περιοχές εμφανίζονται με πορτοκαλί. (Γ και Δ) Η πρωτεΐνη-W αντιπροσωπεύεται με κινουμένων σχεδίων, ο προσανατολισμός της είναι ο ίδιος όπως στο (Α) (Γ) και περιστρέφεται κατά 180° (Δ). Σύμφωνα με τη θέση στην αλληλουχία, τα διακριτά υπολείμματα υιοθετούν ένα σχήμα χρωμάτων ουράνιου τόξου, όπου το Ν-τελικό άκρο είναι μπλε και το C-τελικό άκρο είναι κόκκινο. (Ε) Η πρωτεΐνη-W στην ίδια όψη όπως στο (Α), και τα υπολείμματα στη διεπαφή της πρωτεΐνης-W:LH1 αντιπροσωπεύονται από ράβδους με προσαρτημένα σημάδια. (F) Η πρωτεΐνη-W περιστρέφεται κατά 90° σε σχέση με την (E) και την LH1αβ14 στην αναπαράσταση με κινούμενα σχέδια, και σε σχέση με τα υπολείμματα διεπαφής στην αναπαράσταση με ράβδους. Τα προεξέχοντα υπολείμματα από το βήτα πολυπεπτίδιο είναι επισημασμένα. Ο συμπαράγοντας εμφανίζεται ως ράβδος που ταιριάζει με το χρώμα του Σχήματος 1, το αποσυντεθειμένο β-DDM εμφανίζεται με γκρι χρώμα και το οξυγόνο εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα. (G) Η όψη στο (F) περιστρέφεται κατά 180°, με τα εμφανή υπολείμματα του επισημασμένου άλφα πολυπεπτιδίου.
Η πρωτεΐνη-W αντικαθιστά ένα ετεροδιμερές αβ (το 15ο στο Σχήμα 1F), αποτρέποντας έτσι το κλείσιμο της θηλιάς και την κλίση των τριών πρώτων ετεροδιμερών αβ. Παρατηρήθηκε ότι η μέγιστη γωνία κλίσης του πρώτου ετεροδιμερούς αβ-1 σε σχέση με την κάθετο της μεμβράνης ήταν 25° έως 29° (Σχήμα 1, Α και Ε), η οποία σχηματίστηκε από την κλίση 2° έως 8° της αβ-1 στο RC A σε έντονη αντίθεση-LH116 (Σχήμα 1, Β και ΣΤ). Το δεύτερο και το τρίτο ετεροδιμερές έχουν κλίση 12° έως 22° και 5° έως 10°, αντίστοιχα. Λόγω της στερεοχημικής παρεμπόδισης του RC, η κλίση της αβ-1 δεν περιλαμβάνει το δεύτερο ζεύγος αβ (το οποίο αντιστοιχεί στο 16ο αβ στο Σχήμα 1F), σχηματίζοντας έτσι ένα σαφές κενό στον δακτύλιο LH1 (Σχήμα 1, Α και Ε). Λόγω της έλλειψης δύο ετεροδιμερών αβ, συνοδευόμενης από την απώλεια τεσσάρων BChl και δύο καροτενοειδών, κανένα από τα καροτενοειδή δεν συνδέεται με την στριμμένη υπομονάδα αβ-1, με αποτέλεσμα έναν δακτύλιο LH114-W που περιέχει 13 καροτενοειδή Vegetarian και 28 BChl. Οι εκτιμήσεις τοπικής ανάλυσης των δύο συμπλεγμάτων στις περιοχές αβ1 έως 7 είναι χαμηλότερες από εκείνες του υπόλοιπου βρόχου LH1, γεγονός που μπορεί να αντανακλά την εγγενή πλαστικότητα της υπομονάδας LH1 δίπλα στη θέση RC QB (Σχήμα 4).
Οι εικόνες των RC-LH114-W (A και B) και RC-LH116 (C και D) εμφανίζονται από την ίδια κάτοψη/πλάγια όψη (A και B) (A και C) και την ίδια επιφάνεια κοιλότητας του Σχήματος 1. (B και D). Τα χρωματιστά πλήκτρα εμφανίζονται στα δεξιά.
Το μόνο άλλο χαρακτηριστικό σύμπλοκο πυρήνα με στοιχειομετρική αναλογία 1:14 είναι το διμερές Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Ωστόσο, η πρωτεΐνη W και η PufX δεν έχουν εμφανή ομολογία και έχουν σημαντικό αντίκτυπο στις αντίστοιχες δομές LH1 τους. Η PufX είναι μια μονή TMH με μια Ν-τελική κυτταροπλασματική περιοχή που αλληλεπιδρά με την κυτταροπλασματική πλευρά της υπομονάδας RC-H (13) σε μια θέση που αντιστοιχεί στο Rps. palustris LH116αβ-16. Η PufX δημιουργεί ένα κανάλι για την ανταλλαγή κινόνης/κινολόνης μεταξύ RC-LH1 και του συμπλόκου κυτοχρώματος bcl και υπάρχει σε όλο το σύμπλοκο πυρήνα Rba. sphaeroides (13). Αν και η διεπαφή μονομερούς-μονομερούς βρίσκεται στο Rba. Το διμερές sphaeroides RC-LH1-PufX βρίσκεται στη θέση σύνδεσης της πρωτεΐνης W στην RC-LH114-W, και το κενό που προκαλείται από την PufX και την πρωτεΐνη-W βρίσκεται σε ισοδύναμη θέση (Σχήμα S7A). Το κενό στην RC-LH114-W είναι επίσης ευθυγραμμισμένο με το υποθετικό κανάλι κινόνης (8) της Pseudomonas rosea LH1, το οποίο σχηματίζεται από πεπτίδια που δεν σχετίζονται με την πρωτεΐνη W ή την PufX (Σχήμα S7B). Επιπλέον, το κανάλι κινόνης στο Blc. Η σμαραγδένια πράσινη LH1 που σχηματίζεται εξαιρώντας μία γ υπομονάδα (7) βρίσκεται σε παρόμοια θέση (Σχήμα S7C). Αν και προκαλείται από διαφορετικές πρωτεΐνες, η εμφάνιση αυτών των καναλιών κινόνης/κινολόλης σε κοινή θέση στο σύμπλεγμα RC-LH1 φαίνεται να αποτελεί παράδειγμα συγκλίνουσας εξέλιξης, υποδεικνύοντας ότι το κενό που δημιουργείται από την πρωτεΐνη W μπορεί να λειτουργεί ως κανάλι κινόνης.
Το κενό στον βρόχο LH114-W επιτρέπει τον σχηματισμό μιας συνεχούς περιοχής μεμβράνης μεταξύ του εσωτερικού χώρου του συμπλόκου RC-LH114-W και της κύριας μεμβράνης (Σχήμα 1G), αντί να συνδέει τους δύο τομείς μέσω ενός πόρου πρωτεΐνης όπως στις πρωτεΐνες. Το σύμπλοκο RC-LH116 είναι παρόμοιο με ένα κλειστό σύμπλοκο Tch. Needle-like (22) (Σχήμα 1H). Δεδομένου ότι η διάχυση της κινόνης μέσω της μεμβράνης είναι ταχύτερη από τη διάχυση μέσω του στενού καναλιού πρωτεΐνης, ο ανοιχτός βρόχος LH114-W μπορεί να επιτρέψει ταχύτερη ανακύκλωση του RC από τον κλειστό βρόχο LH116, και η διάχυση της κινόνης στο RC μπορεί να είναι πιο περιορισμένη. Προκειμένου να ελεγχθεί εάν η πρωτεΐνη W επηρεάζει τη μετατροπή των κινονών μέσω του RC, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία οξείδωσης κυτοχρώματος σε μια ορισμένη συγκέντρωση ουβικινόνης 2 (UQ2) (ένα ανάλογο του φυσικού UQ10 με μικρότερη ουρά ισοπρενίου) (Σχήμα 2E). Αν και η παρουσία χηλικής κινόνης εμποδίζει τον ακριβή προσδιορισμό της φαινομενικής σταθεράς Michaelis (τα RC-LH114-W και RC-LH116 είναι κατάλληλα για 0,2±0,1μM και 0,5±0,2μM, αντίστοιχα), ο μέγιστος ρυθμός του RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) είναι 28±5% μεγαλύτερος από τον RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Αρχικά εκτιμήσαμε ότι η πρωτεΐνη-W υπάρχει σε περίπου 10% του κεντρικού συμπλέγματος (16). Εδώ, τα ποσοστά πληρότητας των κυττάρων ανάπτυξης χαμηλού, μεσαίου και υψηλού φωτισμού είναι 15±0,6%, 11±1% και 0,9±0,5% αντίστοιχα (Σχήμα 2F). Η ποσοτική σύγκριση της φασματομετρίας μάζας έδειξε ότι η προσθήκη ετικέτας ιστιδίνης δεν μείωσε τη σχετική αφθονία της πρωτεΐνης-W σε σύγκριση με τα στελέχη άγριου τύπου (P = 0,59), επομένως αυτά τα επίπεδα δεν αποτελούν τεχνούργημα της τροποποιημένης πρωτεΐνης-W (Σχήμα S10). Ωστόσο, αυτή η χαμηλή πληρότητα πρωτεΐνης-W στο σύμπλεγμα RC-LH1 μπορεί να επιτρέψει σε ορισμένα RCs να αναστρέφονται με επιταχυνόμενο ρυθμό, μετριάζοντας έτσι την πιο αργή ανταλλαγή κινόνης/κινολόνης στο σύμπλεγμα RC-LH116. Παρατηρήσαμε ότι ο υψηλός ρυθμός πληρότητας φωτός είναι ασυμβίβαστος με τα πρόσφατα δεδομένα μεταγραφωμικής, γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση του γονιδίου pufW αυξάνεται υπό ισχυρό φως (Σχήμα S11) (23). Η διαφορά μεταξύ της μεταγραφής pufW και της ενσωμάτωσης πρωτεΐνης-W στο σύμπλεγμα RC-LH1 είναι συγκεχυμένη και μπορεί να αντανακλά τη σύνθετη ρύθμιση της πρωτεΐνης.
Στο RC-LH114-W, 6 καρδιολιπίνες (CDL), 7 φωσφατιδυλοχολίνη (POPC), 1 φωσφατιδυλογλυκερόλη (POPG) και 29 μόρια β-DDM κατανέμονται και μοντελοποιούνται σε αυτό 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs και 12 βDDMs. RC-LH116 (Σχήμα 5, Α και Β). Σε αυτές τις δύο δομές, το CDL βρίσκεται σχεδόν στην κυτταροπλασματική πλευρά του συμπλόκου, ενώ τα POPC, POPG και β-DDM βρίσκονται κυρίως στην αυλική πλευρά. Δύο μόρια λιπιδίων και απορρυπαντικών απομονώθηκαν στην περιοχή αβ-1 έως αβ-6 του συμπλόκου RC-LH114-W (Σχήμα 5Α) και πέντε απομονώθηκαν στην ισοδύναμη περιοχή του RC-LH116 (Σχήμα 5Β). Περισσότερα λιπίδια βρέθηκαν στην άλλη πλευρά του συμπλόκου, κυρίως CDL, συσσωρευμένα μεταξύ RC και αβ-7 έως αβ-13 (Σχήμα 5, Α και Β). Άλλα δομικά διαχωρισμένα λιπίδια και απορρυπαντικά βρίσκονται έξω από τον δακτύλιο LH1, και καλά διαχωρισμένες ακυλο αλυσίδες εκτείνονται μεταξύ των υπομονάδων LH1, που ονομάζονται προσωρινά β-DDM στο RC-LH114-W, και ορίζονται ως β-DDM στο RC. Ένα μείγμα β-DDM και POPC-LH116. Οι παρόμοιες θέσεις των χηλικών λιπιδίων και των απορρυπαντικών στη δομή μας υποδεικνύουν ότι είναι φυσιολογικά σχετικές θέσεις σύνδεσης (Σχήμα S12A). Οι θέσεις των ισοδύναμων μορίων στο Tch έχουν επίσης καλή συνοχή. Gentle και Trv. Το στέλεχος 970 RC-LH1s (Σχήμα S12, Β έως Ε) (9, 12) και τα υπολείμματα δεσμών υδρογόνου της ομάδας κεφαλής λιπιδίων έδειξαν αρκετά καλή διατήρηση στην ευθυγράμμιση αλληλουχίας (Σχήμα S13), υποδεικνύοντας ότι διατηρείται το CDL που συνδέεται με το RC (24), αυτές οι θέσεις μπορεί να είναι διατηρημένες στο σύμπλεγμα RC-LH1.
(A και B) Τα πεπτίδια RC-LH114-W (A) και RC-LH116 (B) αναπαρίστανται με κινούμενα σχέδια και οι χρωστικές αναπαρίστανται με ράβδους, χρησιμοποιώντας το χρωματικό σχήμα στο Σχήμα 1. Τα λιπίδια εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα και τα απορρυπαντικά εμφανίζονται με γκρι χρώμα. Το UQ που συνδέεται με τις θέσεις RC QA και QB είναι κίτρινο, ενώ το απομονωμένο UQ είναι μπλε. (C και D) Οι ίδιες όψεις με τα (A) και (B), με παράλειψη των λιπιδίων. (E έως G) Μεγεθυμένη όψη των Q1(E), Q2(F) και Q3(G) από το RC-LH116, με πλευρικές αλυσίδες που επηρεάζουν η μία την άλλη. Οι δεσμοί υδρογόνου εμφανίζονται ως μαύρες διακεκομμένες γραμμές.
Στο RC-LH116, τόσο το RC QA όσο και το QB UQ, τα οποία συμμετέχουν στη μεταφορά ηλεκτρονίων στη διαδικασία διαχωρισμού φορτίου, αποσυντίθενται στις θέσεις σύνδεσής τους. Ωστόσο, στο RC-LH114-W, η κινόνη QB δεν έχει διακριθεί και θα συζητηθεί λεπτομερώς παρακάτω. Εκτός από τις κινόνες QA και QB, δύο χηλικοποιημένα μόρια UQ (που βρίσκονται μεταξύ των δακτυλίων RC και LH1) κατανέμονται στη δομή RC-LH114-W σύμφωνα με τις καλά διακριτές ομάδες κεφαλής τους (που βρίσκονται στο Q1 και στο Q2, αντίστοιχα). διάστημα). Σχήμα 5C). Δύο μονάδες ισοπρενίου αντιστοιχίζονται στο Q1 και ο χάρτης πυκνότητας διακρίνει τις πλήρεις 10 ουρές ισοπρενίου του Q2. Στη δομή του RC-LH116, διαχωρίστηκαν τρία χηλικοποιημένα μόρια UQ10 (Q1 έως Q3, Σχήμα 5D) και όλα τα μόρια έχουν σαφή πυκνότητα σε όλη την ουρά (Σχήμα 5, D έως G). Στις δύο δομές, οι θέσεις των ομάδων κεφαλής κινόνης των Q1 και Q2 έχουν εξαιρετική συνοχή (Σχήμα S12F) και αλληλεπιδρούν μόνο με το RC. Το Q1 βρίσκεται στην είσοδο του κενού W του RC-LH114-W (Σχήμα 1G και 5, C, D και E) και το Q2 βρίσκεται κοντά στη θέση σύνδεσης QB (Σχήμα 5, C, D) και F). Τα συντηρημένα υπολείμματα L-Trp143 και L-Trp269 βρίσκονται πολύ κοντά στα Q1 και Q2 και παρέχουν πιθανές αλληλεπιδράσεις π-στοίβαξης (Σχήμα 5, E και F, και Σχήμα S12). Το L-Gln88, 3,0 Å από το περιφερικό οξυγόνο του Q1, παρέχει έναν ισχυρό δεσμό υδρογόνου (Σχήμα 5E). αυτό το υπόλειμμα είναι συντηρημένο σε όλα τα RC εκτός από την πιο απομακρυσμένη σχέση (Σχήμα S13). Η L-Ser91 υποκαθιστά συντηρητικά την Thr στις περισσότερες άλλες RCs (Σχήμα S13), απέχει 3,8 Angstroms από το μεθυλικό οξυγόνο του Q1 και μπορεί να παρέχει ασθενείς δεσμούς υδρογόνου (Σχήμα 5Ε). Το Q3 δεν φαίνεται να έχει συγκεκριμένη αλληλεπίδραση, αλλά βρίσκεται στην υδρόφοβη περιοχή μεταξύ της υπομονάδας RC-M και της υπομονάδας LH1-α 5 έως 6 (Σχήμα 5, D και G). Τα Q1, Q2 και Q3 ή κοντινές χηλικές κινόνες έχουν επίσης διακριθεί σε Tch. Gentle, Trv. Στέλεχος 970 και Blc. Η δομή της ίριδας (9, 10, 12) υποδεικνύει μια διατηρημένη βοηθητική θέση σύνδεσης κινόνης στο σύμπλεγμα RC-LH1 (Σχήμα S12G). Τα πέντε αποσυντεθειμένα UQs στο RC-LH116 συμφωνούν καλά με το 5,8 ± 0,7 κάθε συμπλόκου που προσδιορίστηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), ενώ τα τρία αποσυντεθειμένα UQs στο RC-LH114-W είναι χαμηλότερα από το . Η μετρούμενη τιμή 6,2 ± 0,3 (Σχήμα S14) υποδεικνύει ότι υπάρχουν μη διαλυμένα μόρια UQ στη δομή.
Τα ψευδοσυμμετρικά πολυπεπτίδια L και M περιέχουν το καθένα πέντε TMHs και σχηματίζουν ένα ετεροδιμερές που συνδυάζει ένα διμερές BChl, δύο μονομερή BChl, δύο μονομερή βακτηριοφάγου (BPh) και έναν μη αιμικό σίδηρο και ένα ή δύο μόρια UQ10. Μέσω της παρουσίας δεσμών υδρογόνου στην τελική κετονική ομάδα και της γνωστής συσσώρευσής της στο Rps, τα καροτενοειδή ενσωματώνονται στην Μ-υπομονάδα, η οποία ονομάζεται cis-3,4-δεϋδροοροδοπίνη. Είδη (25). Η εξωτερική μεμβρανική περιοχή του RC-H είναι αγκυρωμένη στη μεμβράνη από μία μόνο TMH. Η συνολική δομή RC είναι παρόμοια με την τριών υπομονάδων RC συγγενών ειδών (όπως το Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Οι μακροκύκλοι των BChl και BPh, η ραχοκοκαλιά των καροτενοειδών και ο μη αιμικός σίδηρος επικαλύπτονται εντός του εύρους ανάλυσης αυτών των δομών, όπως και η επικεφαλής ομάδα UQ10 στη θέση QA και η κινόνη QB στο RC-LH116 (Σχήμα S15).
Η διαθεσιμότητα δύο δομών RC με διαφορετικούς ρυθμούς κατάληψης θέσης QB παρέχει μια νέα ευκαιρία να εξεταστούν οι συνεπείς διαμορφωτικές αλλαγές που συνοδεύουν τη σύνδεση της κινόνης QB. Στο σύμπλοκο RC-LH116, η κινόνη QB βρίσκεται στην πλήρως συνδεδεμένη «εγγύς» θέση (26), αλλά ο διαχωρισμός του RC-LH114-W δεν έχει κινόνη QB. Δεν υπάρχει κινόνη QB στο RC-LH114-W, κάτι που προκαλεί έκπληξη επειδή το σύμπλοκο είναι ενεργό, περισσότερο από το σύμπλοκο RC-LH116 με δομικά διαχωρισμένη κινόνη QB. Αν και οι δύο δακτύλιοι LH1 σχηματίζουν χηλική ένωση περίπου έξι κινόνες, πέντε διαχωρίζονται δομικά στον κλειστό δακτύλιο RC-LH116, ενώ μόνο τρεις είναι δομικά περιορισμένοι στον ανοιχτό δακτύλιο RC-LH114-W. Αυτή η αυξημένη δομική διαταραχή μπορεί να αντανακλά την ταχύτερη αντικατάσταση των θέσεων QB RC-LH114-W, την ταχύτερη κινητική της κινόνης στο σύμπλοκο και την αυξημένη πιθανότητα διασταύρωσης του βρόχου LH1. Προτείνουμε ότι η έλλειψη UQ στη θέση RC QB του RC-LH114-W μπορεί να είναι το αποτέλεσμα ενός πιο σύνθετου και πιο ενεργού συμπλόκου, και η θέση QB του RC-LH114-W έχει παγώσει αμέσως στην ανακύκλωση UQ. Το συγκεκριμένο στάδιο (η είσοδος στη θέση QB έχει κλείσει) αντικατοπτρίζει τη διαμόρφωση αυτής της δραστηριότητας.
Χωρίς QB, η συνοδευτική περιστροφή της L-Phe217 σε μια θέση που είναι ασύμβατη με τη σύνδεση UQ10, επειδή θα προκαλέσει χωρική σύγκρουση με την πρώτη ισοπρενική μονάδα της ουράς (Σχήμα 6Α). Επιπλέον, οι προφανείς κύριες αλλαγές διαμόρφωσης είναι προφανείς, ειδικά η έλικα de (μικρή έλικα στον βρόχο μεταξύ TMH D και E) όπου η L-Phe217 μετατοπίζεται προς την θήκη σύνδεσης QB και η περιστροφή της L-Tyr223 (Σχήμα 6Α) για να σπάσει τον δεσμό υδρογόνου με το πλαίσιο M-Asp45 και να κλείσει την είσοδο της θέσης σύνδεσης QB (Σχήμα 6Β). Η έλικα de περιστρέφεται στη βάση της, το Ca του L-Ser209 μετατοπίζεται κατά 0,33 Å, ενώ το L-Val221Cα μετατοπίζεται κατά 3,52 Å. Δεν υπάρχουν παρατηρήσιμες αλλαγές στις TMH D και E, οι οποίες είναι υπερτιθέμενες και στις δύο δομές (Σχήμα 6Α). Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη δομή στο φυσικό RC που κλείνει την θέση QB. Μια σύγκριση με την πλήρη (συνδεδεμένη με QB) δομή δείχνει ότι πριν αναχθεί η κινόνη, απαιτείται μια αλλαγή διαμόρφωσης για να εισέλθει στην κινόνη. Η L-Phe217 περιστρέφεται για να σχηματίσει μια αλληλεπίδραση π-στοίβαξης με την ομάδα κεφαλής της κινόνης και η έλικα μετατοπίζεται προς τα έξω, επιτρέποντας στον σκελετό της L-Gly222 και στην πλευρική αλυσίδα της L-Tyr223 να σχηματίσουν ένα δίκτυο δεσμών υδρογόνου με σταθερή δομή δεσμών υδρογόνου (Σχήμα 6, Α και Γ).
(Α) Επικαλυπτόμενο σχέδιο ολογράμματος (αλυσίδα L, πορτοκαλί/αλυσίδα M, ματζέντα) και δομής apo (γκρι), στο οποίο τα βασικά υπολείμματα εμφανίζονται με τη μορφή ραβδοειδούς αναπαράστασης. Το UQ10 αναπαρίσταται με μια κίτρινη ράβδο. Η διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει τους δεσμούς υδρογόνου που σχηματίζονται σε ολόκληρη τη δομή. (Β και Γ) Η επιφανειακή αναπαράσταση της απολιποπρωτεΐνης και ολόκληρης της δομής του δακτυλίου, που επισημαίνει το οξυγόνο της πλευρικής αλυσίδας της L-Phe217 με μπλε χρώμα και της L-Tyr223 με κόκκινο χρώμα, αντίστοιχα. Η υπομονάδα L είναι πορτοκαλί. οι υπομονάδες M και H δεν είναι χρωματισμένες. (Δ και Ε) Απολιποπρωτεΐνη (D) και ολόκληρες (Ε) θέσεις RC QB [χρωματισμός με (Α) αντίστοιχα] και Thermophilus thermophilus PSII (πράσινο, μπλε με πλαστική κινόνη· PDB ID: 3WU2) Ευθυγράμμιση (58).
Απροσδόκητα, παρόλο που είναι διαθέσιμες αρκετές δομές RCs με έλλειψη QB χωρίς LH1, οι αλλαγές διαμόρφωσης που παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη δεν έχουν αναφερθεί προηγουμένως. Αυτές περιλαμβάνουν τη δομή εξάντλησης QB από Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) και Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), οι οποίες είναι σχεδόν ίδιες με τη συνολική δομή QB τους. Η προσεκτική εξέταση του 3PRC αποκάλυψε ότι τα μόρια απορρυπαντικού LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) συνδέονται στην είσοδο της θέσης QB, γεγονός που μπορεί να αποτρέψει την αναδιάταξη σε κλειστή διαμόρφωση. Αν και το LDAO δεν αποσυντίθεται στην ίδια θέση στο 1EYS ή στο 1OGV, αυτά τα RCs παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας το ίδιο απορρυπαντικό και επομένως μπορεί να παράγουν το ίδιο αποτέλεσμα. Η κρυσταλλική δομή του Rba. Το Sphaeroides RC που συν-κρυσταλλώθηκε με κυτόχρωμα c2 (PDB ID: 1L9B) φαίνεται επίσης να έχει μια κλειστή θέση QB. Ωστόσο, σε αυτήν την περίπτωση, η Ν-τελική περιοχή του πολυπεπτιδίου RC-M (που αλληλεπιδρά με τη θέση σύνδεσης QB μέσω του δεσμού Η του υπολείμματος Tyr στην έλικα Q) υιοθετεί μια αφύσικη διαμόρφωση και η αλλαγή διαμόρφωσης του QB δεν διερευνάται περαιτέρω (30). Αυτό που είναι καθησυχαστικό είναι ότι δεν έχουμε δει αυτό το είδος παραμόρφωσης του πολυπεπτιδίου Μ στη δομή RC-LH114-W, η οποία είναι σχεδόν η ίδια με την Ν-τελική περιοχή του RC-LH116 RC. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι μετά την εξάλειψη της κεραίας LH1 με βάση το απορρυπαντικό, τα RC απολιποπρωτεΐνης στο PDB διαχωρίστηκαν, γεγονός που εξάλειψε τις εσωτερικές δεξαμενές κινόνης και τα λιπίδια στο κενό μεταξύ του RC και της εσωτερικής επιφάνειας του περιβάλλοντος δακτυλίου LH1 (31, 32). Το RC παραμένει λειτουργικό επειδή διατηρεί όλους τους συμπαράγοντες, εκτός από την αποσυντιθέμενη κινόνη QB, η οποία είναι λιγότερο σταθερή και συχνά χάνεται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας παρασκευής (33). Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η απομάκρυνση της LH1 και των φυσικών κυκλικών λιπιδίων από το RC μπορεί να έχει αντίκτυπο σε λειτουργίες, όπως η μειωμένη διάρκεια ζωής της κατάστασης P+QB με διαχωρισμό φορτίου (31, 34, 35). Επομένως, εικάζουμε ότι η ύπαρξη του τοπικού δακτυλίου LH1 που περιβάλλει το RC μπορεί να διατηρεί την «κλειστή» θέση QB, διατηρώντας έτσι το τοπικό περιβάλλον κοντά στο QB.
Αν και η απολιποπρωτεΐνη (χωρίς κινόνη QB) και η πλήρης δομή αντιπροσωπεύουν μόνο δύο στιγμιότυπα της ανακύκλωσης της θέσης QB, αντί για μια σειρά γεγονότων, υπάρχουν ενδείξεις ότι η σύνδεση μπορεί να ελεγχθεί για να αποτραπεί η επανασύνδεση από την υδροκινόνη για την αναστολή της αναστολής του υποστρώματος. Η αλληλεπίδραση της κινολόλης και της κινόνης κοντά στη θέση QB της απολιποπρωτεΐνης μπορεί να είναι διαφορετική, γεγονός που οδηγεί στην απόρριψή της από το RC. Έχει προταθεί εδώ και καιρό ότι οι διαμορφωτικές αλλαγές παίζουν ρόλο στη σύνδεση και τη μείωση των κινονών. Η ικανότητα των κατεψυγμένων RC να ανάγουν τις κινόνες μετά την προσαρμογή στο σκοτάδι είναι μειωμένη (36). Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ δείχνει ότι αυτή η βλάβη οφείλεται στο ότι οι κινόνες QB παγιδεύονται σε μια «απευθείας» διαμόρφωση περίπου 4,5 Å από την ενεργή εγγύς θέση (26), 37). Προτείνουμε ότι αυτή η απώτερη διαμόρφωση σύνδεσης είναι ένα στιγμιότυπο της ενδιάμεσης κατάστασης μεταξύ της απολιποπρωτεΐνης και της πλήρους δομής του δακτυλίου, η οποία ακολουθεί την αρχική αλληλεπίδραση με την κινόνη και το άνοιγμα της θέσης QB.
Το RC τύπου II που βρίσκεται στο σύμπλεγμα PSII ορισμένων φωτοτροφικών βακτηρίων και κυανοβακτηρίων, φυκιών και φυτών έχει δομική και λειτουργική διατήρηση (38). Η δομική ευθυγράμμιση που φαίνεται στο Σχήμα 6 (D και E) τονίζει την ομοιότητα μεταξύ των RC PSII και της θέσης QB του βακτηριακού συμπλόκου RC. Αυτή η σύγκριση αποτελεί εδώ και καιρό ένα μοντέλο για τη μελέτη των στενά συγγενών συστημάτων δέσμευσης και αναγωγής κινόνης. Προηγούμενες δημοσιεύσεις υποδεικνύουν ότι οι διαμορφωτικές αλλαγές συνοδεύονται από αναγωγή κινονών από PSII (39, 40). Επομένως, λαμβάνοντας υπόψη την εξελικτική διατήρηση του RC, αυτός ο προηγουμένως μη παρατηρημένος μηχανισμός δέσμευσης μπορεί επίσης να εφαρμοστεί στη θέση QB του RC PSII σε οξυγονωμένα φωτοτροφικά φυτά.
Στελέχη Rps ΔpufW (μη επισημασμένη διαγραφή pufW) και PufW-His (C-τελική 10x His-tagged πρωτεΐνη-W που εκφράζεται από τον φυσικό τόπο pufW). Το palustris CGA009 περιγράφηκε στην προηγούμενη εργασία μας (16). Αυτά τα στελέχη και ο ισογονικός άγριου τύπου γονέας ανακτήθηκαν από την κατάψυξη με γραμμώσεις ενός μικρού αριθμού κυττάρων σε πλάκα PYE (κάθε 5 g λίτρου -1) (αποθηκευμένη σε LB στους -80 °C, που περιέχει 50% (w/v) γλυκερόλη), πρωτεΐνη, εκχύλισμα ζύμης και ηλεκτρικό) άγαρ [1,5% (w/v)]. Η πλάκα επωάστηκε όλη τη νύχτα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου υπό αναερόβιες συνθήκες και στη συνέχεια φωτίστηκε με λευκό φως (~50 μmolm-2 s-1) που παρείχαν λαμπτήρες αλογόνου OSRAM 116-W (RS Components, Ηνωμένο Βασίλειο) για 3 έως 5 ημέρες μέχρι να εμφανιστεί μία μόνο αποικία. Μία μόνο αποικία χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό 10 ml μέσου M22+ (41) συμπληρωμένου με 0,1% (w/v) καζαμινοξέα (εφεξής αναφερόμενα ως M22). Η καλλιέργεια αναπτύχθηκε υπό συνθήκες χαμηλού οξυγόνου στο σκοτάδι στους 34°C με ανακίνηση στις 180 rpm για 48 ώρες και στη συνέχεια 70 ml της καλλιέργειας εμβολιάστηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες για 24 ώρες. Μια ημι-αερόβια καλλιέργεια με όγκο 1 ml χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό 30 ml μέσου M22 σε ένα διαφανές γυάλινο μπουκάλι γενικής χρήσης με βιδωτό καπάκι των 30 ml και ακτινοβολήθηκε με ανάδευση (~50μmolm-2 s-1) για 48 ώρες με αποστειρωμένη μαγνητική ράβδο ανάδευσης. Στη συνέχεια, 30 ml της καλλιέργειας εμβολιάστηκαν με περίπου 1 λίτρο καλλιέργειας υπό τις ίδιες συνθήκες, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό περίπου 9 λίτρων καλλιέργειας που φωτίστηκε στα ~200 μmolm-2 s-1 για 72 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στους 7132 RCF για 30 λεπτά, επαναιωρήθηκαν σε ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0) και αποθηκεύτηκαν στους -20°C μέχρι να χρειαστούν.
Μετά την απόψυξη, προσθέστε μερικούς κρυστάλλους δεοξυριβονουκλεάσης Ι (Merck, Ηνωμένο Βασίλειο), λυσοζύμη (Merck, Ηνωμένο Βασίλειο) και δύο δισκία αναστολέα πρωτεάσης ολοενζύμου Roche (Merck, Ηνωμένο Βασίλειο) στα επαναιωρημένα κύτταρα. Σε ένα γαλλικό κελί πίεσης 20.000 psi (Aminco, ΗΠΑ), τα κύτταρα διασπάστηκαν 8 έως 12 φορές. Μετά την αφαίρεση των άθικτων κυττάρων και των αδιάλυτων υπολειμμάτων με φυγοκέντρηση στους 18.500 RCF για 15 λεπτά στους 4°C, η μεμβράνη καθιζάνει από το χρωματισμένο λύμα με φυγοκέντρηση στους 113.000 RCF για 2 ώρες στους 43.000°C. Απορρίψτε το διαλυτό κλάσμα και επαναιωρήστε την έγχρωμη μεμβράνη σε 100 έως 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0) και ομογενοποιήστε μέχρι να μην υπάρχουν ορατά συσσωματώματα. Η αιωρούμενη μεμβράνη επωάστηκε σε 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, ΗΠΑ) που περιείχε 2% (w/v) β-DDM για 1 ώρα στο σκοτάδι στους 4°C με απαλή ανάδευση. Στη συνέχεια, φυγοκεντρήθηκε στους 70°C για να διαλυθούν 150.000 RCF στους 4°C για 1 ώρα και να απομακρυνθούν τα υπολειμματικά αδιάλυτα.
Η μεμβράνη διαλυτοποίησης από το στέλεχος ΔpufW εφαρμόστηκε σε μια στήλη ανταλλαγής ιόντων DEAE Sepharose των 50 ml με τρεις όγκους στήλης (CV) ρυθμιστικού διαλύματος σύνδεσης [20 mM tris-HCl (pH 8,0) που περιείχε 0,03% (w/v) β-DDM]. Πλύνετε τη στήλη με δύο ρυθμιστικά διαλύματα σύνδεσης CV και στη συνέχεια πλύνετε τη στήλη με δύο ρυθμιστικά διαλύματα σύνδεσης που περιείχαν 50 mM NaCl. Το σύμπλοκο RC-LH116 εκλούστηκε με γραμμική διαβάθμιση 150 έως 300 mM NaCl (σε ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης) σε 1,75 CV και το υπόλοιπο σύμπλοκο σύνδεσης εκλούστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης που περιείχε 300 mM NaCl σε 0,5 CV. Συλλέξτε το φάσμα απορρόφησης μεταξύ 250 και 1000 nm, διατηρήστε το κλάσμα με λόγο απορρόφησης (A880/A280) μεγαλύτερο από 1 στα 880 έως 280 nm, αραιώστε το δύο φορές στο ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης και χρησιμοποιήστε ξανά την ίδια διαδικασία στη στήλη DEAE. Κατά τον καθαρισμό, αραιώστε τα κλάσματα με λόγους A880/A280 μεγαλύτερους από 1,7 και λόγους A880/A805 μεγαλύτερους από 3,0, εκτελέστε τον τρίτο γύρο ιοντοανταλλαγής και διατηρήστε τα κλάσματα με λόγους A880/A280 μεγαλύτερους από 2,2 και λόγους A880/A805 μεγαλύτερους από 5,0. Το μερικώς καθαρισμένο σύμπλοκο συμπυκνώθηκε σε ~2 ml σε φυγοκεντρικό φίλτρο Amicon μοριακού βάρους αποκοπής 100.000 (MWCO) (Merck, Ηνωμένο Βασίλειο) και φορτώθηκε σε στήλη αποκλεισμού μεγέθους Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, ΗΠΑ) που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα NaCl 200 mM και στη συνέχεια εκλούστηκε στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα στα 1,5 CV. Συλλέξτε τα φάσματα απορρόφησης του κλάσματος αποκλεισμού μεγέθους και συμπυκνώστε τα φάσματα απορρόφησης με αναλογίες A880/A280 σε αναλογία 2,4 και A880/A805 σε αναλογία 5,8 έως 100 A880 και χρησιμοποιήστε τα αμέσως για την προετοιμασία ή την αποθήκευση πλέγματος κρυο-TEM. Διατηρήστε τα στους -80°C μέχρι να χρειαστούν.
Η μεμβράνη διαλυτοποίησης από το στέλεχος PufW-His εφαρμόστηκε σε στήλη HisPrep FF Ni-NTA Sepharose των 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) που περιείχε 200 mM NaCl και 0,03% (w/w)) σε ρυθμιστικό διάλυμα IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Η στήλη πλύθηκε με πέντε CVs ρυθμιστικού διαλύματος IMAC και στη συνέχεια με πέντε CVs ρυθμιστικού διαλύματος IMAC που περιείχε 10 mM ιστιδίνη. Το κεντρικό σύμπλοκο εκλούστηκε από τη στήλη με πέντε ρυθμιστικά διαλύματα IMAC που περιείχαν 100 mM ιστιδίνη. Το κλάσμα που περιείχε το σύμπλοκο RC-LH114-W συμπυκνώνεται σε ~10 ml σε αναδευόμενη δεξαμενή εξοπλισμένη με φίλτρο Amicon 100.000 MWCO (Merck, UK), αραιώνεται 20 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης και στη συνέχεια προστίθεται σε 25 ml. Στη στήλη DEAE Sepharose, χρησιμοποιούνται εκ των προτέρων τέσσερις CVs δεσμευμένες στο ρυθμιστικό διάλυμα. Πλύνετε τη στήλη με τέσσερα ρυθμιστικά διαλύματα σύνδεσης CV και στη συνέχεια εκλούστε το σύμπλοκο σε οκτώ CV σε γραμμική κλίση από 0 έως 100 mM NaCl (σε ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης) και τα υπόλοιπα τέσσερα CV περιείχαν ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης 100 mM. Τα υπολειμματικά σύμπλοκα που εκλούστηκαν στο χλωριούχο νάτριο σε συνδυασμό με τα κλάσματα A880/A280 υψηλότερη από 2,4 και την αναλογία A880/A805 υψηλότερη από 4,6 συμπυκνώθηκαν σε ~2 ml σε φυγοκεντρικό φίλτρο Amicon 100.000 MWCO και γεμίστηκαν με 1,5 CV IMAC εκ των προτέρων. Εξισορροπημένη με ρυθμιστικό διάλυμα στήλη αποκλεισμού μεγέθους Superdex 200 16/600 και στη συνέχεια εκλούθηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα σε 1,5 CV. Συλλέξτε τα φάσματα απορρόφησης των κλασμάτων αποκλεισμού μεγέθους και συμπυκνώστε τα φάσματα απορρόφησης με λόγους A880/A280 σε 2,1 και λόγους A880/A805 σε 4,6 έως 100 A880, τα οποία χρησιμοποιούνται αμέσως για την παρασκευή κατεψυγμένου πλέγματος TEM ή αποθηκεύονται στους -80°C μέχρι να χρειαστούν.
Για την παρασκευή πλεγμάτων TEM χαμηλής θερμοκρασίας χρησιμοποιήθηκε καταψύκτης Leica EM GP. Το σύμπλοκο αραιώθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα IMAC σε συγκέντρωση A880 50 και στη συνέχεια 5 μl φορτώθηκαν σε ένα πρόσφατα εκπεμπόμενο με λάμψη πλέγμα χαλκού QUANTIFOIL 1.2/1.3 επικαλυμμένο με άνθρακα (Agar Scientific, UK). Επωάστε το πλέγμα στους 20°C και σχετική υγρασία 60% για 30 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια στεγνώστε το για 3 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια ψύξτε το σε υγρό αιθάνιο στους -176°C.
Τα δεδομένα του συμπλόκου RC-LH114-W καταγράφηκαν στο eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) με μικροσκόπιο Titan Krios, το οποίο λειτουργεί με τάση επιτάχυνσης 300kV, με ονομαστική μεγέθυνση 130.000× και ενέργεια 20 eV. Επιλέξτε ένα κενό 20 eV. Χρησιμοποιήθηκε ένας Gatan 968 GIF Quantum με ανιχνευτή κορυφής K2 για την καταγραφή εικόνων σε λειτουργία μέτρησης για τη συλλογή δεδομένων. Το βαθμονομημένο μέγεθος pixel είναι 1,048 Å και ο ρυθμός δόσης είναι 3,83 e-Å-2s-1. Η ταινία συλλέχθηκε σε 11 δευτερόλεπτα και διαιρέθηκε σε 40 μέρη. Χρησιμοποιήστε την περιοχή με επικάλυψη άνθρακα για να εστιάσετε ξανά το μικροσκόπιο και στη συνέχεια συλλέξτε τρεις ταινίες ανά οπή. Συνολικά, συλλέχθηκαν 3130 ταινίες, με τιμές αποεστίασης μεταξύ -1 και -3μm.
Τα δεδομένα για το σύμπλεγμα RC-LH116 συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το ίδιο μικροσκόπιο στο Εργαστήριο Βιοδομής Asterbury (Πανεπιστήμιο του Leeds, Ηνωμένο Βασίλειο). Τα δεδομένα συλλέχθηκαν σε λειτουργία μέτρησης με μεγέθυνση 130 k και το μέγεθος των pixel βαθμονομήθηκε στα 1,065 Å με δόση 4,6 e-Å-2s-1. Η ταινία καταγράφηκε σε 12 δευτερόλεπτα και χωρίστηκε σε 48 μέρη. Συνολικά, συλλέχθηκαν 3359 φιλμ, με τιμές αποεστίασης μεταξύ -1 και -3μm.
Όλη η επεξεργασία δεδομένων πραγματοποιείται στον αγωγό Relion 3.0 (42). Χρησιμοποιήστε το Motioncorr 2 (43) για να διορθώσετε την κίνηση της δέσμης με στάθμιση δόσης και, στη συνέχεια, χρησιμοποιήστε το CTFFIND 4.1 (44) για να προσδιορίσετε την παράμετρο CTF (συνάρτηση μεταφοράς αντίθεσης). Τυπικές φωτομικρογραφίες μετά από αυτά τα αρχικά στάδια επεξεργασίας φαίνονται στο Σχήμα 2. S16. Το πρότυπο αυτόματης επιλογής δημιουργείται επιλέγοντας χειροκίνητα περίπου 250 pixel από 1000 σωματίδια σε ένα πλαίσιο 250 pixel και χωρίς ταξινόμηση αναφοράς δισδιάστατης (2D), απορρίπτοντας έτσι εκείνες τις ταξινομήσεις που πληρούν τις προϋποθέσεις μόλυνσης δείγματος ή δεν έχουν διακριτά χαρακτηριστικά. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε αυτόματη επιλογή σε όλες τις μικροφωτογραφίες και το RC-LH114-W ήταν 849.359 σωματίδια και το σύμπλοκο RC-LH116 ήταν 476.547 σωματίδια. Όλα τα επιλεγμένα σωματίδια έχουν υποβληθεί σε δύο γύρους ταξινόμησης 2D χωρίς αναφορά και, μετά από κάθε εκτέλεση, τα σωματίδια που πληρούν την περιοχή άνθρακα, τη μόλυνση του δείγματος, την απουσία εμφανών χαρακτηριστικών ή τα έντονα επικαλυπτόμενα σωματίδια απορρίπτονται, με αποτέλεσμα 772.033 (90,9%) και 359.678 (75,5%) σωματίδια να χρησιμοποιούνται για την τρισδιάστατη ταξινόμηση των RC-LH114-W και RC-LH116 αντίστοιχα. Το αρχικό τρισδιάστατο μοντέλο αναφοράς δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο στοχαστικής καθόδου κλίσης. Χρησιμοποιώντας το αρχικό μοντέλο ως αναφορά, τα επιλεγμένα σωματίδια ταξινομούνται σε τέσσερις κατηγορίες σε 3D. Χρησιμοποιώντας το μοντέλο αυτής της κατηγορίας ως αναφορά, εκτελέστε τρισδιάστατη βελτίωση στα σωματίδια της μεγαλύτερης κατηγορίας και, στη συνέχεια, χρησιμοποιήστε το αρχικό φίλτρο χαμηλής διέλευσης 15 Å για να καλύψετε την περιοχή του διαλύτη, προσθέστε 6 pixel μαλακών ακμών και μετα-επεξεργαστείτε τα pixel για να διορθώσετε τη συνάρτηση μεταφοράς διαμόρφωσης κορυφής Gatan K2 του κορυφαίου ανιχνευτή. Για το σύνολο δεδομένων RC-LH114-W, αυτό το αρχικό μοντέλο τροποποιήθηκε αφαιρώντας την ισχυρή πυκνότητα στις άκρες της μάσκας (αποσυνδεδεμένη από την πυκνότητα του συμπλόκου πυρήνα στο UCSF Chimera). Τα μοντέλα που προέκυψαν (οι αναλύσεις των RC-LH114-W και RC-LH116 είναι 3,91 και 4,16 Å, αντίστοιχα) χρησιμοποιούνται ως αναφορά για τον δεύτερο γύρο τρισδιάστατης ταξινόμησης. Τα σωματίδια που χρησιμοποιήθηκαν ομαδοποιούνται στην αρχική τρισδιάστατη κατηγορία και δεν περιέχουν ισχυρή συσχέτιση με τη γειτονιά. Επικάλυψη ή έλλειψη εμφανών δομικών χαρακτηριστικών. Μετά τον δεύτερο γύρο τρισδιάστατης ταξινόμησης, επιλέχθηκε η κατηγορία με την υψηλότερη ανάλυση [Για το RC-LH114-W, η μία κατηγορία είναι 377.703 σωματίδια (44,5%), για το RC-LH116, υπάρχουν δύο κατηγορίες, συνολικά 260.752 σωματίδια (54,7%), όπου είναι τα ίδια μόνο όταν ευθυγραμμίζονται μετά την αρχική περιστροφή με μια μικρή διαφορά]. Τα επιλεγμένα σωματίδια επανεκχυλίζονται σε ένα κουτί 400 pixel και ραφινάρονται με τρισδιάστατη ραφινάρισμα. Η μάσκα διαλύτη δημιουργείται χρησιμοποιώντας το αρχικό φίλτρο χαμηλής διέλευσης 15Å, την επέκταση χάρτη 3 pixel και την απαλή μάσκα 3 pixel. Χρησιμοποιώντας τη ραφινάρισμα CTF ανά σωματίδιο, τη διόρθωση κίνησης ανά σωματίδιο και τον δεύτερο γύρο ραφιναρίσματος CTF ανά σωματίδιο, η τρισδιάστατη ραφινάρισμα, η κάλυψη διαλύτη και η μετεπεξεργασία εκτελούνται μετά από κάθε βήμα για την περαιτέρω ραφινάρισμα της προκύπτουσας υφής. Χρησιμοποιώντας την τιμή αποκοπής FSC (Συντελεστής Συσχέτισης Φλοιού Fourier) 0,143, οι αναλύσεις των τελικών μοντέλων RC-LH114-W και RC-LH116 είναι 2,65 και 2,80Å, αντίστοιχα. Η καμπύλη FSC του τελικού μοντέλου φαίνεται στο Σχήμα 2. S17.
Όλες οι αλληλουχίες πρωτεϊνών λαμβάνονται από την UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Το SWISS-MODEL (45) χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή ενός μοντέλου ομολογίας του RC, το οποίο περιέχει τις αλληλουχίες πρωτεϊνών των RC-L, RC-M και RC-H και η κρυσταλλική δομή του Rba.sphaeroides RC χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο (PDB ID: 5LSE) (46). Χρησιμοποιήστε το εργαλείο «fit map» στο UCSF Chimera για να προσαρμόσετε το παραγόμενο μοντέλο στον χάρτη (47), να βελτιώσετε τη δομή της πρωτεΐνης και να προσθέσετε συμπαράγοντα [4×BChl a (όνομα υπολειμμάτων βιβλιοθήκης μονομερών = BCL), 2×BPh a (BPH), ένα ή δύο είδη UQ10 (U10), έναν μη αιμικό σίδηρο (Fe) και μία 3,4-διυδροεξακαρβονυλχολίνη (QAK)]. Εφόσον το QAK δεν είναι διαθέσιμο στη βιβλιοθήκη μονομερών, παραμετροποιήθηκε χρησιμοποιώντας το εργαλείο eLOW στο PHENIX (49).
Στη συνέχεια, κατασκευάστηκε η υπομονάδα LH1. Αρχικά, το εργαλείο αυτόματης κατασκευής στο PHENIX (49) χρησιμοποιήθηκε για την αυτόματη κατασκευή μέρους της αλληλουχίας LH1 χρησιμοποιώντας τον χάρτη και τις αλληλουχίες πρωτεϊνών LH1-α και LH1-β ως είσοδο. Επιλέξτε την πιο ολοκληρωμένη υπομονάδα LH1, εξαγάγετε την και φορτώστε την στο Coot, προσθέστε χειροκίνητα την αλληλουχία που λείπει σε αυτήν και βελτιώστε χειροκίνητα ολόκληρη τη δομή πριν προσθέσετε δύο BCls a (BCL) και μια σπιριλοξανθίνη (CRT) [σύμφωνα με την σχετική πυκνότητα Rps του συμπλόκου LH1 και την γνωστή περιεκτικότητα σε καροτενοειδή. Είδη (17)]. Αντιγράψτε την πλήρη υπομονάδα LH1 και χρησιμοποιήστε το "Docking Map Tool" του UCSF Chimera για να προσαρτήσετε στην παρακείμενη περιοχή μη μοντέλου πυκνότητας LH1 και, στη συνέχεια, βελτιώστε την στο Coot. Επαναλάβετε τη διαδικασία μέχρι να μοντελοποιηθούν όλες οι υπομονάδες LH1. Για τη δομή RC-LH114-W, εξάγοντας την μη κατανεμημένη πυκνότητα στο Coot, η πρωτεΐνη διαχωρίζεται από τα υπόλοιπα μη πρωτεϊνικά συστατικά στον χάρτη USCF Chimera και το εργαλείο Autobuild χρησιμοποιείται για τη δημιουργία του αρχικού μοντέλου και τη μοντελοποίηση των υπόλοιπων υπομονάδων (πρωτεΐνη-W). Στο PHENIX (49). Προσθέστε τυχόν ελλείπουσες αλληλουχίες στο προκύπτον μοντέλο στο Coot (48) και, στη συνέχεια, βελτιώστε χειροκίνητα ολόκληρη την υπομονάδα. Η υπόλοιπη μη κατανεμημένη πυκνότητα ταιριάζει στον συνδυασμό λιπιδίων (ID βιβλιοθήκης μονομερών PDB CDL = CDL, POPC = 6PL και POPG = PGT), απορρυπαντικού β-DDM (LMT) και μορίων UQ10 (U10). Χρησιμοποιήστε τη βελτιστοποίηση PHENIX (49) και τη χειροκίνητη βελτιστοποίηση στο Coot (48) για να τελειοποιήσετε ολόκληρο το αρχικό μοντέλο μέχρι τα στατιστικά στοιχεία του μοντέλου και η οπτική ποιότητα της προσαρμογής να μην μπορούν να βελτιωθούν περαιτέρω. Τέλος, χρησιμοποιήστε το LocScale (50) για να βελτιώσετε τον τοπικό χάρτη και, στη συνέχεια, εκτελέστε αρκετούς άλλους κύκλους μοντελοποίησης της μη κατανεμημένης πυκνότητας και αυτόματης και χειροκίνητης βελτιστοποίησης.
Τα αντίστοιχα πεπτίδια, συμπαράγοντες και άλλα λιπίδια και κινόνες που συνδέονται εντός των αντίστοιχων πυκνοτήτων τους παρουσιάζονται στα Σχήματα 1 και 2. S18 έως S23. Οι στατιστικές πληροφορίες του τελικού μοντέλου παρουσιάζονται στον Πίνακα S1.
Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, τα φάσματα απορρόφησης UV/Vis/NIR συλλέχθηκαν σε φασματοφωτόμετρο Cary60 (Agilent, ΗΠΑ) σε διαστήματα 1 nm από 250 nm έως 1000 nm και χρόνο ολοκλήρωσης 0,1s.
Αραιώστε το δείγμα σε μια κυψελίδα χαλαζία με διαδρομή 2 mm προς A880 ίση με 1 και συλλέξτε το φάσμα απορρόφησης μεταξύ 400 και 1000 nm. Τα κυκλικά διχρωϊκά φάσματα συλλέχθηκαν σε φασματοπολαριόμετρο Jasco 810 (Jasco, Ιαπωνία) σε διαστήματα 1 nm μεταξύ 400 nm και 950 nm με ρυθμό σάρωσης 20 nm min-1.
Ο μοριακός συντελεστής απόσβεσης προσδιορίζεται με αραίωση του συμπλόκου πυρήνα σε A880 περίπου 50. Αραιώστε τον όγκο των 10 μl σε 990 μl ρυθμιστικού διαλύματος σύνδεσης ή μεθανόλης και συλλέξτε αμέσως το φάσμα απορρόφησης για να ελαχιστοποιήσετε την αποικοδόμηση του BChl. Η περιεκτικότητα σε BChl κάθε δείγματος μεθανόλης υπολογίστηκε από τον συντελεστή απόσβεσης στα 771 nm των 54,8 mM-1 cm-1 και προσδιορίστηκε ο συντελεστής απόσβεσης (51). Διαιρέστε τη μετρούμενη συγκέντρωση BChl με το 32 (RC-LH114-W) ή το 36 (RC-LH116) για να προσδιορίσετε τη συγκέντρωση του συμπλόκου πυρήνα, η οποία στη συνέχεια χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του φάσματος απορρόφησης του ίδιου δείγματος που συλλέχθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα. Συντελεστής απόσβεσης. παράλληλα. Ελήφθησαν τρεις επαναλαμβανόμενες μετρήσεις για κάθε δείγμα και η μέση απορρόφηση του μέγιστου BChl Qy χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό. Ο συντελεστής απόσβεσης του RC-LH114-W μετρούμενος στα 878 nm είναι 3280±140 mM-1 cm-1, ενώ ο συντελεστής απόσβεσης του RC-LH116 μετρούμενος στα 880 nm είναι 3800±30 mM-1 cm-1.
Η UQ10 ποσοτικοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο στο (52). Εν ολίγοις, πραγματοποιήθηκε HPLC αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) χρησιμοποιώντας το σύστημα HPLC Agilent 1200. Διαλύστε περίπου 0,02 nmol RC-LH116 ή RC-LH114-W σε 50 μl μεθανόλης:χλωροφορμίου 50:50 που περιέχει 0,02% (w/v) χλωριούχου σιδήρου και εγχύστε το προ-ισορροπημένο Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm. Διαλύστε σε 1 ml-1 min-1 στους 40°C σε διαλύτη HPLC (80:20 μεθανόλη:2-προπανόλη) σε στήλη ×25 cm. Πραγματοποιήστε ισοκρατική έκλουση σε διαλύτη HPLC για να παρακολουθήσετε την απορρόφηση στα 275 nm (UQ10), 450 nm (καροτενοειδή) και 780 nm (BChl) για 1 ώρα. Η κορυφή στο χρωματογράφημα των 275 nm στα 25,5 λεπτά ήταν ολοκληρωμένη, η οποία δεν περιείχε άλλες ανιχνεύσιμες ενώσεις. Η ολοκληρωμένη περιοχή χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της μοριακής ποσότητας του UQ10 που εκχυλίστηκε με αναφορά στην καμπύλη βαθμονόμησης που υπολογίστηκε από την έγχυση καθαρών προτύπων από 0 έως 5,8 nmol (Σχήμα S14). Κάθε δείγμα αναλύθηκε σε τρία αντίγραφα και το αναφερόμενο σφάλμα αντιστοιχεί στην τυπική απόκλιση (SD) του μέσου όρου.
Ένα διάλυμα που περιείχε το σύμπλοκο RC-LH1 με μέγιστη απορρόφηση Qy 0,1 παρασκευάστηκε με 30 μM αναγμένο κυτόχρωμα c2 καρδιάς αλόγου (Merck, Ηνωμένο Βασίλειο) και 0 έως 50 μMUQ2 (Merck, Ηνωμένο Βασίλειο). Τρία δείγματα του 1 ml παρασκευάστηκαν σε κάθε συγκέντρωση UQ2 και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στο σκοτάδι στους 4°C για να διασφαλιστεί η πλήρης προσαρμογή στο σκοτάδι πριν από τη μέτρηση. Το διάλυμα φορτώθηκε σε ένα αρθρωτό φασματοφωτόμετρο OLIS RSM1000 εξοπλισμένο με πλέγμα φλόγας/γραμμής 300 nm/500, είσοδο 1,24 mm, μέση 0,12 mm και σχισμές εξόδου 0,6 mm. Ένα φίλτρο διέλευσης μήκους 600 nm τοποθετήθηκε στην είσοδο του φωτοσωλήνα δείγματος και του φωτοπολλαπλασιαστή αναφοράς για να αποκλειστεί το φως διέγερσης. Η απορρόφηση παρακολουθήθηκε στα 550 nm με χρόνο ολοκλήρωσης 0,15 s. Το φως διέγερσης εκπέμπεται από το LED (Light Emitting Diode) M880F2 των 880 nm (Thorlabs Ltd., Ηνωμένο Βασίλειο) μέσω καλωδίου οπτικών ινών σε ένταση 90% μέσω ελεγκτή DC2200 (Thorlabs Ltd., Ηνωμένο Βασίλειο) και εκπέμπεται στην πηγή φωτός υπό γωνία 90°. Η δέσμη μέτρησης είναι απέναντι από τον καθρέφτη για να επιστρέψει οποιοδήποτε φως που δεν απορροφήθηκε αρχικά από το δείγμα. Παρακολουθήστε την απορρόφηση 10 δευτερόλεπτα πριν από την ένταση φωτισμού των 50 δευτερολέπτων. Στη συνέχεια, η απορρόφηση παρακολουθήθηκε περαιτέρω για 60 δευτερόλεπτα στο σκοτάδι για να αξιολογηθεί ο βαθμός στον οποίο η κινολόλη μειώνει αυθόρμητα το κυτόχρωμα c23+ (βλ. Σχήμα S8 για ακατέργαστα δεδομένα).
Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία προσαρμόζοντας έναν γραμμικό αρχικό ρυθμό εντός 0,5 έως 10 δευτερολέπτων (ανάλογα με τη συγκέντρωση UQ2) και υπολογίζοντας τον μέσο όρο των ρυθμών και των τριών δειγμάτων σε κάθε συγκέντρωση UQ2. Η συγκέντρωση RC-LH1 που υπολογίστηκε από τον αντίστοιχο συντελεστή απόσβεσης χρησιμοποιήθηκε για τη μετατροπή του ρυθμού στην καταλυτική απόδοση, η οποία απεικονίστηκε γραφικά στο Origin Pro 2019 (OriginLab, ΗΠΑ) και προσαρμόστηκε στο μοντέλο Michaelis-Menten για τον προσδιορισμό των φαινομενικών τιμών Km και Kcat.
Για μετρήσεις παροδικής απορρόφησης, το δείγμα RC-LH1 αραιώθηκε σε ~2μM σε ρυθμιστικό διάλυμα IMAC που περιείχε 50 mM ασκορβικό νάτριο (Merck, ΗΠΑ) και 0,4 mM τερβουτίνη (Merck, ΗΠΑ). Το ασκορβικό οξύ χρησιμοποιείται ως δότης ηλεκτρονίων θυσίας και η tert-βουτακλοφαίνη χρησιμοποιείται ως αναστολέας QB για να διασφαλιστεί ότι ο κύριος δότης RC παραμένει μειωμένος (δηλαδή, όχι φωτοοξειδωμένος) καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας μέτρησης. Περίπου 3 ml δείγματος προστίθενται σε ένα ειδικά περιστρεφόμενο κελί (διαμέτρου περίπου 0,1 m, 350 RPM) με μήκος οπτικής διαδρομής 2 mm για να διασφαλιστεί ότι το δείγμα στη διαδρομή λέιζερ έχει αρκετό χρόνο για προσαρμογή στο σκοτάδι μεταξύ των παλμών διέγερσης. Χρησιμοποιήστε παλμούς λέιζερ ~100-fs για να ενισχύσετε το σύστημα λέιζερ Ti: Sapphire (Spectra Physics, ΗΠΑ) για να διεγείρετε το δείγμα στα 880 nm με ρυθμό επανάληψης 1 kHz (20 nJ για NIR ή 100 nJ για Vis). Πριν από τη συλλογή δεδομένων, εκθέστε το δείγμα σε φως διέγερσης για περίπου 30 λεπτά. Η έκθεση θα προκαλέσει απενεργοποίηση της διασφάλισης ποιότητας (πιθανώς μειώνοντας την διασφάλιση ποιότητας μία ή δύο φορές). Ωστόσο, λάβετε υπόψη ότι αυτή η διαδικασία είναι αναστρέψιμη επειδή μετά από μια μακρά περίοδο προσαρμογής στο σκοτάδι, το RC θα επιστρέψει αργά στη δραστηριότητα διασφάλισης ποιότητας. Χρησιμοποιήθηκε φασματόμετρο Helios (Ultrafast Systems, ΗΠΑ) για τη μέτρηση παροδικών φασμάτων με χρόνο καθυστέρησης από -10 έως 7000 ps. Χρησιμοποιήστε το λογισμικό Surface Xplorer (Ultrafast Systems, ΗΠΑ) για να αποομαδοποιήσετε τα σύνολα δεδομένων και, στη συνέχεια, να τα συγχωνεύσετε και να τα τυποποιήσετε. Χρησιμοποιήστε το πακέτο λογισμικού CarpetView (Light Conversion Ltd., Λιθουανία) για να χρησιμοποιήσετε το συνδυασμένο σύνολο δεδομένων για να λάβετε διαφορικά φάσματα που σχετίζονται με την αποσύνθεση ή χρησιμοποιήστε μια συνάρτηση που συνενώνει πολλαπλούς εκθέτες με την απόκριση του οργάνου για να ταιριάζει με την φασματική εξέλιξη ενός μήκους κύματος στο Origin (OriginLab, ΗΠΑ).
Όπως αναφέρθηκε παραπάνω (53), παρασκευάστηκε μια φωτοσυνθετική μεμβράνη που περιείχε σύμπλοκο LH1 που δεν είχε ούτε RC ούτε περιφερειακή κεραία LH2. Η μεμβράνη αραιώθηκε σε 20 mM tris (pH 8,0) και στη συνέχεια φορτώθηκε σε κυψελίδα χαλαζία με οπτική διαδρομή 2 mm. Χρησιμοποιήθηκε ένας παλμός λέιζερ 30nJ για τη διέγερση του δείγματος στα 540 nm με χρόνο καθυστέρησης από -10 έως 7000 ps. Επεξεργαστείτε το σύνολο δεδομένων όπως περιγράφεται για το δείγμα Rps.pal.
Η μεμβράνη σφαιροποιήθηκε με φυγοκέντρηση στις 150.000 RCF για 2 ώρες στους 4°C και στη συνέχεια η απορρόφησή της στα 880 nm επαναιωρήθηκε σε 20 mM tris-HCl (pH 8,0) και 200 ​​mM NaCl. Διαλύστε τη μεμβράνη αναδεύοντας αργά σε 2% (w/v) β-DDM για 1 ώρα στο σκοτάδι στους 4°C. Το δείγμα αραιώθηκε σε 100 mM ανθρακικό τριαιθυλαμμώνιο (pH 8,0) (TEAB· Merck, Ηνωμένο Βασίλειο) σε συγκέντρωση πρωτεΐνης 2,5 mg ml-1 (ανάλυση Bio-Rad). Περαιτέρω επεξεργασία πραγματοποιήθηκε με την προηγουμένως δημοσιευμένη μέθοδο (54), ξεκινώντας με την αραίωση 50 μg πρωτεΐνης σε συνολικά 50 μl TEAB που περιείχε 1% (w/v) λαυρικό νάτριο (Merck, Ηνωμένο Βασίλειο). Μετά από υπερηχητική επεξεργασία για 60 δευτερόλεπτα, ανήχθηκε με 5 mM τρις(2-καρβοξυαιθυλ)φωσφίνη (Merck, UK) στους 37°C για 30 λεπτά. Για S-αλκυλίωση, επωάστε το δείγμα με 10 mM μεθυλο-S-μεθυλοθειομεθανοσουλφονικό (Merck, UK) και προσθέστε το από ένα διάλυμα ισοπροπανόλης 200 mM για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η πρωτεολυτική πέψη πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη 2 μg μείγματος τρυψίνης/ενδοπρωτεϊνάσης Lys-C (Promega UK) και επωάστηκε στους 37°C για 3 ώρες. Το λαυρικό επιφανειοδραστικό εκχυλίστηκε με την προσθήκη 50 μl οξικού αιθυλεστέρα και 10 μl τριφθοροοξικού οξέος 10% (v/v) LC βαθμού (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) και ανακίνηση με στροβιλισμό για 60 δευτερόλεπτα. Ο διαχωρισμός φάσεων προωθήθηκε με φυγοκέντρηση στους 15.700 RCF για 5 λεπτά. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, χρησιμοποιήθηκε μια στήλη spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Ηνωμένο Βασίλειο) για την προσεκτική αναρρόφηση και αφαλάτωση της κατώτερης φάσης που περιείχε το πεπτίδιο. Μετά από ξήρανση με φυγοκέντρηση κενού, το δείγμα διαλύθηκε σε 0,5% TFA και 3% ακετονιτρίλιο, και 500 ng αναλύθηκαν με χρωματογραφία νανοροής RP σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας χρησιμοποιώντας τις παραμέτρους του συστήματος που περιγράφηκαν προηγουμένως.
Χρησιμοποιήστε το MaxQuant v.1.5.3.30 (56) για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών για την αναζήτηση της βάσης δεδομένων πρωτεωμάτων Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Τα δεδομένα πρωτεωμικής φασματομετρίας μάζας έχουν κατατεθεί στη Συμμαχία ProteomeXchange μέσω του αποθετηρίου συνεργατών PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) με το αναγνωριστικό συνόλου δεδομένων PXD020402.
Για ανάλυση με RPLC σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας ιονισμού ηλεκτροψεκασμού, το σύμπλοκο RC-LH1 παρασκευάστηκε από Rps άγριου τύπου. Χρησιμοποιώντας την προηγουμένως δημοσιευμένη μέθοδο (16), η συγκέντρωση πρωτεΐνης που παρήχθη σε κύτταρα palustris ήταν 2 mg ml-1 σε 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl και 0,03% (w/v) β- (ανάλυση Bio-Rad) ) DDM. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, χρησιμοποιήστε κιτ καθαρισμού 2D (GE Healthcare, USA) για την εξαγωγή 10 μg πρωτεΐνης με τη μέθοδο καθίζησης και διαλύστε το ίζημα σε 20 μl 60% (v/v) μυρμηκικού οξέος (FA), 20% (v/v) ακετονιτριλίου και 20% (v/v) νερού. Πέντε μικρολίτρα αναλύθηκαν με RPLC (Dionex RSLC) σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (Maxis UHR-TOF, Bruker). Χρησιμοποιήστε στήλη MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Ηνωμένο Βασίλειο) για διαχωρισμό στους 60°C και 100μlmin-1, με διαβάθμιση 85% (v/v) διαλύτη Α [0,1% (v/v) λιπαρά οξέα και 0,02% (V/v) TFA υδατικού διαλύματος] προς 85% (v/v) διαλύτη Β [0,1% (v/v) λιπαρά οξέα και 0,02% (v/v) σε 90% (v/v) ακετονιτρίλιο TFA]. Χρησιμοποιώντας τυπική πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού και προεπιλεγμένες παραμέτρους για περισσότερο από 60 λεπτά, το φασματόμετρο μάζας λαμβάνει 100 έως 2750 m/z (λόγος μάζας προς φορτίο). Με τη βοήθεια του εργαλείου FindPept (https://web.expasy.org/findpept/) της πύλης βιοπληροφορικής ExPASy, χαρτογραφήστε το φάσμα μάζας στις υπομονάδες του συμπλόκου.
Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 72 ώρες υπό 100 ml NF-χαμηλής (10μMm-2 s-1), μέσης (30μMm-2 s-1) ή υψηλής (300μMm-2 s-1) έντασης φωτός. Μέσο M22 (μέσο M22 στο οποίο παραλείπεται το θειικό αμμώνιο και το ηλεκτρικό νάτριο αντικαθίσταται από οξικό νάτριο) σε φιάλη των 100 ml με βιδωτό καπάκι (23). Σε πέντε κύκλους των 30 δευτερολέπτων, γυάλινες χάντρες 0,1 μικρών σχηματίστηκαν με αναλογία όγκου 1:1 για να λυθούν τα κύτταρα και ψύχθηκαν σε πάγο για 5 λεπτά. Η αδιάλυτη ύλη, τα άθραυστα κύτταρα και οι γυάλινες χάντρες απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στις 16.000 RCF για 10 λεπτά σε μικροφυγόκεντρο πάγκου. Η μεμβράνη διαχωρίστηκε σε ρότορα Ti 70.1 με 100.000 RCF σε 20 mM tris-HCl (pH 8.0) με βαθμίδωση σακχαρόζης 40/15% (w/w) για 10 ώρες.
Όπως περιγράφηκε στην προηγούμενη εργασία μας, ανοσοανίχνευση της ετικέτας His σε PufW (16). Εν ολίγοις, το καθαρισμένο σύμπλοκο πυρήνα (11,8 nM) ή η μεμβράνη που περιέχει την ίδια συγκέντρωση RC (που προσδιορίστηκε με οξείδωση αφαιρώντας το φάσμα μειωμένης διαφοράς και αντιστοιχίζοντας το φορτίο στο χρωματισμένο πήκτωμα) σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης 2x SDS (Merck, UK) αραιώθηκε δύο φορές. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε ένα αντίγραφο πήκτωμα NuPage 12% bis-tris (Thermo Fisher Scientific, UK). Ένα πήκτωμα χρωματίστηκε με Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) για να φορτωθεί και να απεικονιστεί η υπομονάδα RC-L. Η πρωτεΐνη στο δεύτερο πήκτωμα μεταφέρθηκε σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) με ενεργοποίηση με μεθανόλη (Thermo Fisher Scientific, UK) για ανοσοδοκιμασία. Η μεμβράνη PVDF μπλοκαρίστηκε σε 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 και 5% (w/v) σκόνη άπαχου γάλακτος και στη συνέχεια επωάστηκε με το πρωτογενές αντίσωμα κατά του His (σε αραίωση του ρυθμιστικού διαλύματος αντισώματος [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl και 0,05% (v/v) Tween-20] σε 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) για 4 ώρες. Μετά από 3 πλύσεις για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα αντισωμάτων, η μεμβράνη συνδυάστηκε με δευτερογενές αντίσωμα κατά ποντικού υπεροξειδάσης χρένου (Sigma-Aldrich, Ηνωμένο Βασίλειο) (αραιωμένο 1:10.000 σε ρυθμιστικό διάλυμα αντισωμάτων). Επωάστηκε για να επιτραπεί η ανίχνευση (5 λεπτά μετά από 3 πλύσεις σε ρυθμιστικό διάλυμα αντισωμάτων) χρησιμοποιώντας υπόστρωμα χημειοφωταύγειας WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Ιταλία) και Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Ηνωμένο Βασίλειο).
Σχεδιάζοντας την κατανομή έντασης κάθε χρωματισμένης γέλης ή λωρίδας ανοσοδοκιμασίας, ενσωματώνοντας την περιοχή κάτω από την κορυφή και υπολογίζοντας την αναλογία έντασης της RC-L (χρωματισμένη γέλη) και της Πρωτεΐνης-W (ανοσοδοκιμασία), στο ImageJ (57), επεξεργαστείτε την εικόνα. Αυτές οι αναλογίες μετατράπηκαν σε μοριακές αναλογίες υποθέτοντας ότι η αναλογία της RC-L προς την πρωτεΐνη-W στο καθαρό δείγμα RC-LH114-W ήταν 1:1 και ομαλοποιώντας ολόκληρο το σύνολο δεδομένων ανάλογα.
Για συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο, ανατρέξτε στη διεύθυνση http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης που διανέμεται σύμφωνα με τους όρους της Άδειας Creative Commons Attribution. Το άρθρο επιτρέπει την απεριόριστη χρήση, διανομή και αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​υπό την προϋπόθεση ότι το πρωτότυπο έργο αναφέρεται σωστά.
Σημείωση: Σας ζητάμε μόνο να δώσετε τη διεύθυνση email σας, ώστε το άτομο που προτείνετε στη σελίδα να γνωρίζει ότι θέλετε να δει το email και ότι δεν είναι ανεπιθύμητο. Δεν θα καταγράψουμε καμία διεύθυνση email.
Αυτή η ερώτηση χρησιμοποιείται για να ελεγχθεί εάν είστε επισκέπτης και να αποτραπεί η αυτόματη υποβολή ανεπιθύμητων μηνυμάτων.
Ντέιβιντ Τζ. Κ. Σουέινσμπερι, Παρκ Τσιάν, Φίλιπ Τζ. Τζάκσον, Κέιτλιν Μ. Φάρις, Ντάριους Μ. Νιτζβιέντσκι, Ελίζαμπεθ Κ. Μάρτιν, Ντέιβιντ Α. Φάρμερ, Λόρνα Α. Μαλόουν, Ρεμπέκα Φ. Τόμσον, Νιλ Α. Ράνσον, Ντάνιελ Π. Κάνιφ, Μαρκ Τζ. Ντίκμαν, Ντιούι Χόλτεν, Κριστίν Κιρμάιερ, Άντριου Χίτσκοκ, Κ. Νιλ Χάντερ
Η δομή υψηλής ανάλυσης του συμπλόκου παγίδας φωτός 1 στο κέντρο αντίδρασης παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τη δυναμική της κινόνης.
Ντέιβιντ Τζ. Κ. Σουέινσμπερι, Παρκ Τσιάν, Φίλιπ Τζ. Τζάκσον, Κέιτλιν Μ. Φάρις, Ντάριους Μ. Νιτζβιέντσκι, Ελίζαμπεθ Κ. Μάρτιν, Ντέιβιντ Α. Φάρμερ, Λόρνα Α. Μαλόουν, Ρεμπέκα Φ. Τόμσον, Νιλ Α. Ράνσον, Ντάνιελ Π. Κάνιφ, Μαρκ Τζ. Ντίκμαν, Ντιούι Χόλτεν, Κριστίν Κιρμάιερ, Άντριου Χίτσκοκ, Κ. Νιλ Χάντερ
Η δομή υψηλής ανάλυσης του συμπλόκου παγίδας φωτός 1 στο κέντρο αντίδρασης παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τη δυναμική της κινόνης.
©2021 American Association for the Advancement of Science. διατηρούνται όλα τα δικαιώματα. Η AAAS είναι συνεργάτης των HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef και COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.