Το άρθρο αποτελεί μέρος του ερευνητικού θέματος «Προηγμένες τεχνολογίες βιοαποκατάστασης και διαδικασίες ανακύκλωσης συνθετικών οργανικών ενώσεων (SOC)». Δείτε και τα 14 άρθρα
Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (PAH) χαμηλού μοριακού βάρους, όπως το ναφθαλίνιο και τα υποκατεστημένα ναφθαλίνια (μεθυλοναφθαλίνιο, ναφθοϊκό οξύ, 1-ναφθυλ-Ν-μεθυλοκαρβαμικό, κ.λπ.), χρησιμοποιούνται ευρέως σε διάφορες βιομηχανίες και είναι γονιδιοτοξικοί, μεταλλαξιογόνοι ή/και καρκινογόνοι για τους οργανισμούς. Αυτές οι συνθετικές οργανικές ενώσεις (SOCs) ή ξενοβιοτικά θεωρούνται ρύποι προτεραιότητας και αποτελούν σοβαρή απειλή για το παγκόσμιο περιβάλλον και τη δημόσια υγεία. Η ένταση των ανθρώπινων δραστηριοτήτων (π.χ. αεριοποίηση άνθρακα, διύλιση πετρελαίου, εκπομπές οχημάτων και γεωργικές εφαρμογές) καθορίζει τη συγκέντρωση, την τύχη και τη μεταφορά αυτών των πανταχού παρόντων και επίμονων ενώσεων. Εκτός από τις μεθόδους φυσικής και χημικής επεξεργασίας/απομάκρυνσης, πράσινες και φιλικές προς το περιβάλλον τεχνολογίες, όπως η βιοαποκατάσταση, οι οποίες χρησιμοποιούν μικροοργανισμούς ικανούς να αποικοδομήσουν πλήρως τους POCs ή να τους μετατρέψουν σε μη τοξικά παραπροϊόντα, έχουν αναδειχθεί ως μια ασφαλής, οικονομικά αποδοτική και πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση. Διάφορα βακτηριακά είδη που ανήκουν στα φύλα Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia και Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus και Paenibacillus) και Actinobacteria (Rhodococcus και Arthrobacter) στο μικροβίωμα του εδάφους έχουν καταδείξει την ικανότητα να αποικοδομούν διάφορες οργανικές ενώσεις. Οι μεταβολικές μελέτες, η γονιδιωματική και η μεταγονιδιωματική ανάλυση μας βοηθούν να κατανοήσουμε την καταβολική πολυπλοκότητα και ποικιλομορφία που υπάρχει σε αυτές τις απλές μορφές ζωής, οι οποίες μπορούν να εφαρμοστούν περαιτέρω για αποτελεσματική βιοαποικοδόμηση. Η μακροχρόνια ύπαρξη των ΠΑΥ έχει οδηγήσει στην εμφάνιση νέων φαινοτύπων αποικοδόμησης μέσω οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων χρησιμοποιώντας γενετικά στοιχεία όπως πλασμίδια, τρανσποζόνια, βακτηριοφάγους, γονιδιωματικές νησίδες και ενσωματωτικά συζευκτικά στοιχεία. Η συστημική βιολογία και η γενετική μηχανική συγκεκριμένων απομονωμένων στελεχών ή μοντέλων κοινοτήτων (κοινοπραξίες) μπορούν να επιτρέψουν την ολοκληρωμένη, ταχεία και αποτελεσματική βιοαποκατάσταση αυτών των ΠΑΥ μέσω συνεργιστικών επιδράσεων. Σε αυτήν την ανασκόπηση, εστιάζουμε στις διαφορετικές μεταβολικές οδούς και ποικιλομορφία, τη γενετική σύνθεση και ποικιλομορφία, καθώς και στις κυτταρικές αποκρίσεις/προσαρμογές του ναφθαλινίου και των υποκατεστημένων βακτηρίων που αποικοδομούν το ναφθαλίνιο. Αυτό θα παρέχει οικολογικές πληροφορίες για εφαρμογές πεδίου και βελτιστοποίηση στελεχών για αποτελεσματική βιοαποκατάσταση.
Η ραγδαία ανάπτυξη των βιομηχανιών (πετροχημικά, γεωργία, φαρμακευτικά προϊόντα, χρωστικές υφασμάτων, καλλυντικά κ.λπ.) έχει συμβάλει στην παγκόσμια οικονομική ευημερία και στη βελτίωση του βιοτικού επιπέδου. Αυτή η εκθετική ανάπτυξη έχει οδηγήσει στην παραγωγή μεγάλου αριθμού συνθετικών οργανικών ενώσεων (SOCs), οι οποίες χρησιμοποιούνται για την κατασκευή διαφόρων προϊόντων. Αυτές οι ξένες ενώσεις ή SOCs περιλαμβάνουν πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες (PAHs), φυτοφάρμακα, ζιζανιοκτόνα, πλαστικοποιητές, χρωστικές ουσίες, φαρμακευτικά προϊόντα, οργανοφωσφορικά, επιβραδυντικά φλόγας, πτητικούς οργανικούς διαλύτες κ.λπ. Εκπέμπονται στην ατμόσφαιρα, στα υδάτινα και χερσαία οικοσυστήματα όπου έχουν πολυδιάστατες επιπτώσεις, προκαλώντας αρνητικές επιπτώσεις σε διάφορες βιομορφές μέσω αλλοίωσης των φυσικοχημικών ιδιοτήτων και της δομής της κοινότητας (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Πολλοί αρωματικοί ρύποι έχουν ισχυρές και καταστροφικές επιπτώσεις σε πολλά άθικτα οικοσυστήματα/θερμά σημεία βιοποικιλότητας (π.χ. κοραλλιογενείς ύφαλοι, αρκτικά/ανταρκτικά παγοκαλύμματα, λίμνες σε υψηλά βουνά, ιζήματα βαθέων υδάτων κ.λπ.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Πρόσφατες γεωμικροβιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η εναπόθεση συνθετικής οργανικής ύλης (π.χ. αρωματικοί ρύποι) και των παραγώγων τους στις επιφάνειες τεχνητών κατασκευών (δομημένο περιβάλλον) (π.χ. χώροι πολιτιστικής κληρονομιάς και μνημεία από γρανίτη, πέτρα, ξύλο και μέταλλο) επιταχύνει την υποβάθμισή τους (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Οι ανθρώπινες δραστηριότητες μπορούν να εντείνουν και να επιδεινώσουν τη βιολογική υποβάθμιση μνημείων και κτιρίων μέσω της ατμοσφαιρικής ρύπανσης και της κλιματικής αλλαγής (Liu et al. 2020). Αυτοί οι οργανικοί ρύποι αντιδρούν με τους υδρατμούς στην ατμόσφαιρα και καθιζάνουν στη δομή, προκαλώντας φυσική και χημική υποβάθμιση του υλικού. Η βιοαποικοδόμηση αναγνωρίζεται ευρέως ως ανεπιθύμητες αλλαγές στην εμφάνιση και τις ιδιότητες των υλικών που προκαλούνται από ζωντανούς οργανισμούς και επηρεάζουν τη διατήρησή τους (Pochon and Jaton, 1967). Η περαιτέρω μικροβιακή δράση (μεταβολισμός) αυτών των ενώσεων μπορεί να μειώσει τη δομική ακεραιότητα, την αποτελεσματικότητα της διατήρησης και την πολιτιστική αξία (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Από την άλλη πλευρά, σε ορισμένες περιπτώσεις, η μικροβιακή προσαρμογή και η απόκριση σε αυτές τις δομές έχει βρεθεί ότι είναι ευεργετική, καθώς σχηματίζουν βιοφίλμ και άλλες προστατευτικές κρούστες που μειώνουν τον ρυθμό φθοράς/αποσύνθεσης (Martino, 2016). Επομένως, η ανάπτυξη αποτελεσματικών μακροπρόθεσμων βιώσιμων στρατηγικών διατήρησης για πέτρινα, μεταλλικά και ξύλινα μνημεία απαιτεί πλήρη κατανόηση των βασικών διεργασιών που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία. Σε σύγκριση με τις φυσικές διεργασίες (γεωλογικές διεργασίες, δασικές πυρκαγιές, ηφαιστειακές εκρήξεις, φυτικές και βακτηριακές αντιδράσεις), οι ανθρώπινες δραστηριότητες έχουν ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση μεγάλων όγκων πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (ΠΑΥ) και άλλου οργανικού άνθρακα (ΟΑ) στα οικοσυστήματα. Πολλοί ΠΑΥ που χρησιμοποιούνται στη γεωργία (εντομοκτόνα και φυτοφάρμακα όπως DDT, ατραζίνη, καρβαρύλιο, πενταχλωροφαινόλη κ.λπ.), στη βιομηχανία (αργό πετρέλαιο, λάσπη/απόβλητα πετρελαίου, πλαστικά που προέρχονται από πετρέλαιο, PCB, πλαστικοποιητές, απορρυπαντικά, απολυμαντικά, καπνιστικά, αρώματα και συντηρητικά), σε προϊόντα προσωπικής φροντίδας (αντηλιακά, απολυμαντικά, εντομοαπωθητικά και πολυκυκλικά μόσχα) και σε πυρομαχικά (εκρηκτικά όπως 2,4,6-TNT) είναι πιθανά ξενοβιοτικά που μπορεί να επηρεάσουν την πλανητική υγεία (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna and Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Αυτή η λίστα μπορεί να επεκταθεί ώστε να περιλαμβάνει ενώσεις που προέρχονται από πετρέλαιο (καύσιμα έλαια, λιπαντικά, ασφαλτένια), βιοπλαστικά υψηλού μοριακού βάρους και ιοντικά υγρά (Amde et al., 2015). Ο Πίνακας 1 παραθέτει διάφορους αρωματικούς ρύπους και τις εφαρμογές τους σε διάφορες βιομηχανίες. Τα τελευταία χρόνια, οι ανθρωπογενείς εκπομπές πτητικών οργανικών ενώσεων, καθώς και διοξειδίου του άνθρακα και άλλων αερίων του θερμοκηπίου, έχουν αρχίσει να αυξάνονται (Dvorak et al., 2017). Ωστόσο, οι ανθρωπογενείς επιπτώσεις υπερβαίνουν σημαντικά τις φυσικές. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι ορισμένες SOCs επιμένουν σε πολλά περιβαλλοντικά περιβάλλοντα και έχουν αναγνωριστεί ως αναδυόμενοι ρύποι με δυσμενείς επιπτώσεις στα βιοσυστήματα (Σχήμα 1). Περιβαλλοντικοί οργανισμοί όπως η Υπηρεσία Προστασίας του Περιβάλλοντος των Ηνωμένων Πολιτειών (USEPA) έχουν συμπεριλάβει πολλούς από αυτούς τους ρύπους στον κατάλογο προτεραιότητάς τους λόγω των κυτταροτοξικών, γονιδιοτοξικών, μεταλλαξιογόνων και καρκινογόνων ιδιοτήτων τους. Επομένως, απαιτούνται αυστηροί κανονισμοί διάθεσης και αποτελεσματικές στρατηγικές για την επεξεργασία/απομάκρυνση αποβλήτων από μολυσμένα οικοσυστήματα. Διάφορες φυσικές και χημικές μέθοδοι επεξεργασίας, όπως η πυρόλυση, η οξειδωτική θερμική επεξεργασία, ο αερισμός του αέρα, η υγειονομική ταφή, η αποτέφρωση κ.λπ., είναι αναποτελεσματικές και δαπανηρές και παράγουν διαβρωτικά, τοξικά και δύσκολα στην επεξεργασία παραπροϊόντα. Με την αυξανόμενη παγκόσμια περιβαλλοντική ευαισθητοποίηση, οι μικροοργανισμοί που είναι ικανοί να αποικοδομήσουν αυτούς τους ρύπους και τα παράγωγά τους (όπως αλογονωμένοι, νίτρο, αλκυλικοί ή/και μεθυλικοί) προσελκύουν ολοένα και μεγαλύτερη προσοχή (Fennell et al., 2004; Haritash and Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Η χρήση αυτών των ιθαγενών υποψήφιων μικροοργανισμών μόνοι τους ή σε μικτές καλλιέργειες (αποικίες) για την απομάκρυνση αρωματικών ρύπων έχει πλεονεκτήματα όσον αφορά την περιβαλλοντική ασφάλεια, το κόστος, την αποδοτικότητα, την αποτελεσματικότητα και τη βιωσιμότητα. Οι ερευνητές διερευνούν επίσης την ενσωμάτωση μικροβιακών διεργασιών με ηλεκτροχημικές οξειδοαναγωγικές μεθόδους, δηλαδή βιοηλεκτροχημικά συστήματα (BES), ως μια πολλά υποσχόμενη τεχνολογία για την επεξεργασία/αφαίρεση ρύπων (Huang et al., 2011). Η τεχνολογία BES έχει προσελκύσει αυξανόμενη προσοχή λόγω της υψηλής απόδοσης, του χαμηλού κόστους, της περιβαλλοντικής ασφάλειας, της λειτουργίας σε θερμοκρασία δωματίου, των βιοσυμβατών υλικών και της ικανότητας ανάκτησης πολύτιμων υποπροϊόντων (π.χ. ηλεκτρική ενέργεια, καύσιμα και χημικά) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Η εμφάνιση εργαλείων/μεθόδων αλληλούχισης γονιδιώματος υψηλής απόδοσης και ομικής έχει παράσχει πληθώρα νέων πληροφοριών σχετικά με τη γενετική ρύθμιση, την πρωτεωμική και τη ροομική των αντιδράσεων διαφόρων μικροοργανισμών αποικοδόμησης. Ο συνδυασμός αυτών των εργαλείων με τη συστημική βιολογία έχει ενισχύσει περαιτέρω την κατανόησή μας για την επιλογή και τη βελτίωση των καταβολικών οδών-στόχων σε μικροοργανισμούς (δηλαδή, μεταβολικό σχεδιασμό) για την επίτευξη αποτελεσματικής και αποδοτικής βιοαποικοδόμησης. Για να σχεδιάσουμε αποτελεσματικές στρατηγικές βιοαποκατάστασης χρησιμοποιώντας κατάλληλους υποψήφιους μικροοργανισμούς, πρέπει να κατανοήσουμε το βιοχημικό δυναμικό, τη μεταβολική ποικιλομορφία, τη γενετική σύνθεση και την οικολογία (αυτοοικολογία/συνεκολογία) των μικροοργανισμών.
Σχήμα 1. Πηγές και οδοί PAH χαμηλού μοριακού βάρους μέσω διαφόρων περιβαλλοντικών περιβαλλόντων και διαφόρων παραγόντων που επηρεάζουν τον βιόκοσμο. Οι διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των στοιχείων του οικοσυστήματος.
Σε αυτήν την ανασκόπηση, επιχειρήσαμε να συνοψίσουμε τα δεδομένα σχετικά με την αποικοδόμηση απλών ΠΑΥ όπως το ναφθαλίνιο και τα υποκατεστημένα ναφθαλίνια από διάφορα απομονωμένα βακτηριακά στελέχη, καλύπτοντας μεταβολικές οδούς και ποικιλομορφία, ένζυμα που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση, σύνθεση/περιεχόμενο και ποικιλομορφία γονιδίων, κυτταρικές αποκρίσεις και διάφορες πτυχές της βιοαποκατάστασης. Η κατανόηση των βιοχημικών και μοριακών επιπέδων θα βοηθήσει στον εντοπισμό κατάλληλων στελεχών ξενιστών και στην περαιτέρω γενετική τους μηχανική για αποτελεσματική βιοαποκατάσταση τέτοιων ρύπων προτεραιότητας. Αυτό θα βοηθήσει στην ανάπτυξη στρατηγικών για τη δημιουργία βακτηριακών κοινοπραξιών ειδικών για την αποτελεσματική βιοαποκατάσταση.
Η παρουσία μεγάλου αριθμού τοξικών και επικίνδυνων αρωματικών ενώσεων (που ικανοποιούν τον κανόνα Huckel 4n + 2π ηλεκτρόνια, n = 1, 2, 3, …) αποτελεί σοβαρή απειλή για διάφορα περιβαλλοντικά μέσα όπως ο αέρας, το έδαφος, τα ιζήματα και τα επιφανειακά και υπόγεια ύδατα (Puglisi et al., 2007). Αυτές οι ενώσεις έχουν απλούς βενζολικούς δακτυλίους (μονοκυκλικούς) ή πολλαπλούς βενζολικούς δακτυλίους (πολυκυκλικούς) διατεταγμένους σε γραμμική, γωνιακή ή συσταδική μορφή και εμφανίζουν σταθερότητα (σταθερότητα/αστάθεια) στο περιβάλλον λόγω της υψηλής αρνητικής ενέργειας συντονισμού και της αδράνειας (αδράνεια), η οποία μπορεί να εξηγηθεί από την υδροφοβικότητα και την ανηγμένη κατάστασή τους. Όταν ο αρωματικός δακτύλιος αντικαθίσταται περαιτέρω από μεθυλικές (-CH3), καρβοξυλικές (-COOH), υδροξυλικές (-OH) ή σουλφονικές (-HSO3) ομάδες, γίνεται πιο σταθερός, έχει ισχυρότερη συγγένεια με μακρομόρια και είναι βιοσυσσωρεύσιμος σε βιολογικά συστήματα (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Ορισμένοι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες χαμηλού μοριακού βάρους (LMWAH), όπως το ναφθαλίνιο και τα παράγωγά του [μεθυλοναφθαλίνιο, ναφθοϊκό οξύ, ναφθαλινοσουλφονικό και 1-ναφθυλ Ν-μεθυλοκαρβαμικό (καρβαρύλιο)], έχουν συμπεριληφθεί στον κατάλογο των οργανικών ρύπων προτεραιότητας από την Υπηρεσία Προστασίας του Περιβάλλοντος των ΗΠΑ ως γονιδιοτοξικοί, μεταλλαξιογόνοι ή/και καρκινογόνοι (Cerniglia, 1984). Η απελευθέρωση αυτής της κατηγορίας NM-PAH στο περιβάλλον μπορεί να οδηγήσει σε βιοσυσσώρευση αυτών των ενώσεων σε όλα τα επίπεδα της τροφικής αλυσίδας, επηρεάζοντας έτσι την υγεία των οικοσυστημάτων (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Οι πηγές και οι οδοί των ΠΑΥ προς τον βιόκοσμο είναι κυρίως μέσω της μετανάστευσης και των αλληλεπιδράσεων μεταξύ διαφορετικών συστατικών του οικοσυστήματος, όπως το έδαφος, τα υπόγεια ύδατα, τα επιφανειακά ύδατα, οι καλλιέργειες και η ατμόσφαιρα (Arey και Atkinson, 2003). Το Σχήμα 1 δείχνει τις αλληλεπιδράσεις και την κατανομή διαφορετικών ΠΑΥ χαμηλού μοριακού βάρους στα οικοσυστήματα και τις οδούς τους προς τον βιόκοσμο/την ανθρώπινη έκθεση. Οι ΠΑΥ εναποτίθενται στις επιφάνειες ως αποτέλεσμα της ατμοσφαιρικής ρύπανσης και μέσω της μετανάστευσης (μετατόπισης) των εκπομπών οχημάτων, των βιομηχανικών καυσαερίων (αεριοποίηση άνθρακα, καύση και παραγωγή οπτάνθρακα) και της εναπόθεσής τους. Βιομηχανικές δραστηριότητες όπως η κατασκευή συνθετικών υφασμάτων, βαφών και χρωμάτων· η συντήρηση ξύλου· η επεξεργασία καουτσούκ· οι δραστηριότητες παραγωγής τσιμέντου· η παραγωγή φυτοφαρμάκων· και οι γεωργικές εφαρμογές αποτελούν σημαντικές πηγές ΠΑΥ σε χερσαία και υδάτινα συστήματα (Bamforth και Singleton, 2005· Wick et al., 2011). Μελέτες έχουν δείξει ότι τα εδάφη σε προαστιακές και αστικές περιοχές, κοντά σε αυτοκινητόδρομους και σε μεγάλες πόλεις είναι πιο ευάλωτα σε πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες (ΠΑΥ) λόγω εκπομπών από σταθμούς παραγωγής ενέργειας, οικιακή θέρμανση, φορτία εναέριας κυκλοφορίας και οδικής κυκλοφορίας, καθώς και κατασκευαστικές δραστηριότητες (Suman et al., 2016). (2008) έδειξε ότι οι ΠΑΥ στο έδαφος κοντά σε δρόμους στη Νέα Ορλεάνη, Λουιζιάνα, ΗΠΑ, ήταν έως και 7189 μg/kg, ενώ σε ανοιχτό χώρο, ήταν μόνο 2404 μg/kg. Ομοίως, επίπεδα ΠΑΥ έως και 300 μg/kg έχουν αναφερθεί σε περιοχές κοντά σε εγκαταστάσεις αεριοποίησης άνθρακα σε αρκετές πόλεις των ΗΠΑ (Kanaly and Harayama, 2000· Bamforth and Singleton, 2005). Έχει αναφερθεί ότι εδάφη από διάφορες πόλεις της Ινδίας, όπως το Δελχί (Sharma et al., 2008), η Άγκρα (Dubey et al., 2014), η Βομβάη (Kulkarni and Venkataraman, 2000) και το Βισακαπατνάμ (Kulkarni et al., 2014), περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις ΠΑΥ. Οι αρωματικές ενώσεις προσροφώνται πιο εύκολα στα σωματίδια του εδάφους, στην οργανική ύλη και στα αργιλικά ορυκτά, καθιστώντας έτσι σημαντικές δεξαμενές άνθρακα στα οικοσυστήματα (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Οι κύριες πηγές ΠΑΥ στα υδάτινα οικοσυστήματα είναι οι βροχοπτώσεις (υγρή/ξηρή βροχόπτωση και υδρατμοί), η αστική απορροή, η απόρριψη λυμάτων, η επαναφόρτιση των υπόγειων υδάτων κ.λπ. (Srogi, 2007). Εκτιμάται ότι περίπου το 80% των ΠΑΥ στα θαλάσσια οικοσυστήματα προέρχεται από τις βροχοπτώσεις, την ιζηματογένεση και την απόρριψη αποβλήτων (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Υψηλότερες συγκεντρώσεις ΠΑΥ σε επιφανειακά ύδατα ή σε στραγγίσματα από χώρους διάθεσης στερεών αποβλήτων τελικά διαρρέουν στα υπόγεια ύδατα, θέτοντας σε κίνδυνο τη δημόσια υγεία, καθώς περισσότερο από το 70% του πληθυσμού στη Νότια και Νοτιοανατολική Ασία πίνει υπόγεια ύδατα (Duttagupta et al., 2019). Μια πρόσφατη μελέτη των Duttagupta et al. (2020) σε αναλύσεις ποταμών (32) και υπόγειων υδάτων (235) από τη Δυτική Βεγγάλη της Ινδίας, διαπίστωσε ότι περίπου το 53% των κατοίκων των πόλεων και το 44% των κατοίκων της υπαίθρου (συνολικά 20 εκατομμύρια κάτοικοι) ενδέχεται να εκτίθενται σε ναφθαλίνη (4,9–10,6 μg/L) και τα παράγωγά της. Τα διαφοροποιημένα πρότυπα χρήσης γης και η αυξημένη άντληση υπόγειων υδάτων θεωρούνται οι κύριοι παράγοντες που ελέγχουν την κάθετη μεταφορά (μεταφορά) ΠΑΥ χαμηλού μοριακού βάρους στο υπέδαφος. Έχει διαπιστωθεί ότι η γεωργική απορροή, οι απορρίψεις αστικών και βιομηχανικών λυμάτων και οι απορρίψεις στερεών αποβλήτων/απορριμμάτων επηρεάζονται από ΠΑΥ σε λεκάνες απορροής ποταμών και υπόγεια ιζήματα. Οι ατμοσφαιρικές βροχοπτώσεις επιδεινώνουν περαιτέρω τη ρύπανση από ΠΑΥ. Υψηλές συγκεντρώσεις ΠΑΥ και των αλκυλοπαραγώγων τους (51 συνολικά) έχουν αναφερθεί σε ποτάμια/λεκάνες απορροής παγκοσμίως, όπως ο ποταμός Fraser, ο ποταμός Louan, ο ποταμός Denso, ο ποταμός Missouri, ο ποταμός Anacostia, ο ποταμός Ebro και ο ποταμός Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Στα ιζήματα της λεκάνης απορροής του ποταμού Γάγγη, το ναφθαλίνιο και το φαινανθρένιο βρέθηκαν να είναι τα πιο σημαντικά (ανιχνεύτηκαν στο 70% των δειγμάτων) (Duttagupta et al., 2019). Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι η χλωρίωση του πόσιμου νερού μπορεί να οδηγήσει στον σχηματισμό πιο τοξικών οξυγονωμένων και χλωριωμένων ΠΑΥ (Manoli and Samara, 1999). Οι ΠΑΥ συσσωρεύονται σε δημητριακά, φρούτα και λαχανικά ως αποτέλεσμα της πρόσληψής τους από τα φυτά από μολυσμένα εδάφη, υπόγεια ύδατα και βροχοπτώσεις (Fismes et al., 2002). Πολλοί υδρόβιοι οργανισμοί όπως ψάρια, μύδια, αχιβάδες και γαρίδες μολύνονται με ΠΑΥ μέσω της κατανάλωσης μολυσμένων τροφίμων και θαλασσινού νερού, καθώς και μέσω ιστών και δέρματος (Mackay and Fraser, 2000). Οι μέθοδοι μαγειρέματος/επεξεργασίας όπως το ψήσιμο στη σχάρα, το ψήσιμο, το κάπνισμα, το τηγάνισμα, το στέγνωμα, το ψήσιμο στο φούρνο και το μαγείρεμα με κάρβουνο μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε σημαντικές ποσότητες ΠΑΥ στα τρόφιμα. Αυτό εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την επιλογή του υλικού καπνίσματος, την περιεκτικότητα σε φαινολικούς/αρωματικούς υδρογονάνθρακες, τη διαδικασία μαγειρέματος, τον τύπο θερμαντήρα, την περιεκτικότητα σε υγρασία, την παροχή οξυγόνου και τη θερμοκρασία καύσης (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (ΠΑΥ) έχουν επίσης ανιχνευθεί στο γάλα σε ποικίλες συγκεντρώσεις (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Η συσσώρευση αυτών των ΠΑΥ στα τρόφιμα εξαρτάται επίσης από τις φυσικοχημικές ιδιότητες των τροφίμων, ενώ οι τοξικές τους επιδράσεις σχετίζονται με τις φυσιολογικές λειτουργίες, τη μεταβολική δραστηριότητα, την απορρόφηση, την κατανομή και την κατανομή στον οργανισμό (Mechini et al., 2011).
Η τοξικότητα και οι βλαβερές επιπτώσεις των πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (ΠΑΥ) είναι γνωστές εδώ και πολύ καιρό (Cherniglia, 1984). Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες χαμηλού μοριακού βάρους (LMW-PAH) (δύο έως τρεις δακτύλιοι) μπορούν να συνδεθούν ομοιοπολικά με διάφορα μακρομόρια όπως DNA, RNA και πρωτεΐνες και είναι καρκινογόνοι (Santarelli et al., 2008). Λόγω της υδρόφοβης φύσης τους, διαχωρίζονται από λιπιδικές μεμβράνες. Στους ανθρώπους, οι μονοοξυγενάσες του κυτοχρώματος P450 οξειδώνουν τους ΠΑΥ σε εποξείδια, μερικά από τα οποία είναι εξαιρετικά αντιδραστικά (π.χ., εποξείδιο της βαδιόλης) και μπορούν να οδηγήσουν στον μετασχηματισμό των φυσιολογικών κυττάρων σε κακοήθη (Marston et al., 2001). Επιπλέον, τα προϊόντα μετασχηματισμού των ΠΑΥ όπως οι κινόνες, οι φαινόλες, τα εποξείδια, οι διόλες κ.λπ. είναι πιο τοξικά από τις αρχικές ενώσεις. Ορισμένοι ΠΑΥ και τα μεταβολικά τους ενδιάμεσα μπορούν να επηρεάσουν τις ορμόνες και διάφορα ένζυμα στον μεταβολισμό, επηρεάζοντας έτσι αρνητικά την ανάπτυξη, το κεντρικό νευρικό σύστημα, το αναπαραγωγικό και το ανοσοποιητικό σύστημα (Swetha and Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Η βραχυπρόθεσμη έκθεση σε ΠΑΥ χαμηλού μοριακού βάρους έχει αναφερθεί ότι προκαλεί διαταραχή της πνευμονικής λειτουργίας και θρόμβωση σε ασθματικούς και αυξάνει τον κίνδυνο καρκίνου του δέρματος, του πνεύμονα, της ουροδόχου κύστης και του γαστρεντερικού συστήματος (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Μελέτες σε ζώα έχουν επίσης δείξει ότι η έκθεση σε ΠΑΥ μπορεί να έχει δυσμενείς επιπτώσεις στην αναπαραγωγική λειτουργία και ανάπτυξη και μπορεί να προκαλέσει καταρράκτη, νεφρική και ηπατική βλάβη και ίκτερο. Διάφορα προϊόντα βιομετατροπής ΠΑΥ, όπως διόλες, εποξείδια, κινόνες και ελεύθερες ρίζες (κατιόντα), έχουν αποδειχθεί ότι σχηματίζουν προϊόντα προσθήκης DNA. Έχει αποδειχθεί ότι τα σταθερά προϊόντα προσθήκης αλλοιώνουν τον μηχανισμό αντιγραφής του DNA, ενώ τα ασταθή προϊόντα προσθήκης μπορούν να αποπουρινώσουν το DNA (κυρίως σε αδενίνη και μερικές φορές σε γουανίνη). Και τα δύο μπορούν να δημιουργήσουν σφάλματα που οδηγούν σε μεταλλάξεις (Schweigert et al. 2001). Επιπλέον, οι κινόνες (βενζο-/παν-) μπορούν να παράγουν δραστικά είδη οξυγόνου (ROS), προκαλώντας θανατηφόρα βλάβη στο DNA και σε άλλα μακρομόρια, επηρεάζοντας έτσι τη λειτουργία/βιωσιμότητα των ιστών (Ewa and Danuta 2017). Η χρόνια έκθεση σε χαμηλές συγκεντρώσεις πυρενίου, διφαινυλίου και ναφθαλινίου έχει αναφερθεί ότι προκαλεί καρκίνο σε πειραματόζωα (Diggs et al. 2012). Λόγω της θανατηφόρας τοξικότητάς τους, ο καθαρισμός/αφαίρεση αυτών των ΠΑΥ από τις προσβεβλημένες/μολυσμένες περιοχές αποτελεί προτεραιότητα.
Διάφορες φυσικές και χημικές μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για την απομάκρυνση των ΠΑΥ από μολυσμένες τοποθεσίες/περιβάλλοντα. Διαδικασίες όπως η αποτέφρωση, η αποχλωρίωση, η οξείδωση με υπεριώδη ακτινοβολία, η στερέωση και η εκχύλιση με διαλύτη έχουν πολλά μειονεκτήματα, όπως ο σχηματισμός τοξικών παραπροϊόντων, η πολυπλοκότητα της διαδικασίας, ζητήματα ασφάλειας και κανονισμών, η χαμηλή απόδοση και το υψηλό κόστος. Ωστόσο, η μικροβιακή βιοαποικοδόμηση (που ονομάζεται βιοαποκατάσταση) είναι μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική προσέγγιση που περιλαμβάνει τη χρήση μικροοργανισμών με τη μορφή καθαρών καλλιεργειών ή αποικιών. Σε σύγκριση με τις φυσικές και χημικές μεθόδους, αυτή η διαδικασία είναι φιλική προς το περιβάλλον, μη επεμβατική, οικονομικά αποδοτική και βιώσιμη. Η βιοαποκατάσταση μπορεί να πραγματοποιηθεί στην πληγείσα τοποθεσία (in situ) ή σε ειδικά προετοιμασμένη τοποθεσία (ex situ) και ως εκ τούτου θεωρείται μια πιο βιώσιμη μέθοδος αποκατάστασης από τις παραδοσιακές φυσικές και χημικές μεθόδους (Juhasz and Naidu, 2000; Andreoni and Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Η κατανόηση των μικροβιακών μεταβολικών βημάτων που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση των αρωματικών ρύπων έχει τεράστιες επιστημονικές και οικονομικές επιπτώσεις για την οικολογική και περιβαλλοντική βιωσιμότητα. Υπολογίζεται ότι 2,1×1018 γραμμάρια άνθρακα (C) αποθηκεύονται σε ιζήματα και οργανικές ενώσεις (δηλαδή, πετρέλαιο, φυσικό αέριο και άνθρακα, δηλαδή, ορυκτά καύσιμα) παγκοσμίως, συμβάλλοντας σημαντικά στον παγκόσμιο κύκλο του άνθρακα. Ωστόσο, η ταχεία εκβιομηχάνιση, η εξόρυξη ορυκτών καυσίμων και οι ανθρώπινες δραστηριότητες εξαντλούν αυτές τις λιθοσφαιρικές δεξαμενές άνθρακα, απελευθερώνοντας περίπου 5,5×1015 g οργανικού άνθρακα (ως ρύπους) στην ατμόσφαιρα ετησίως (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Το μεγαλύτερο μέρος αυτού του οργανικού άνθρακα εισέρχεται στα χερσαία και θαλάσσια οικοσυστήματα μέσω ιζηματογένεσης, μεταφοράς και απορροής. Επιπλέον, νέοι συνθετικοί ρύποι που προέρχονται από ορυκτά καύσιμα, όπως πλαστικά, πλαστικοποιητές και σταθεροποιητές πλαστικών (φθαλικές ενώσεις και τα ισομερή τους), ρυπαίνουν σοβαρά τα θαλάσσια, εδαφικά και υδάτινα οικοσυστήματα και τον βιόκοσμό τους, επιδεινώνοντας έτσι τους παγκόσμιους κλιματικούς κινδύνους. Διάφοροι τύποι μικροπλαστικών, νανοπλαστικών, θραυσμάτων πλαστικού και των τοξικών μονομερών προϊόντων τους που προέρχονται από τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο (PET) έχουν συσσωρευτεί στον Ειρηνικό Ωκεανό μεταξύ Βόρειας Αμερικής και Νοτιοανατολικής Ασίας, σχηματίζοντας τη «Μεγάλη Κοίλωμα Σκουπιδιών του Ειρηνικού», βλάπτοντας τη θαλάσσια ζωή (Newell et al., 2020). Επιστημονικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι δεν είναι δυνατή η απομάκρυνση τέτοιων ρύπων/αποβλήτων με καμία φυσική ή χημική μέθοδο. Σε αυτό το πλαίσιο, οι πιο χρήσιμοι μικροοργανισμοί είναι εκείνοι που είναι ικανοί να μεταβολίζουν οξειδωτικά τους ρύπους σε διοξείδιο του άνθρακα, χημική ενέργεια και άλλα μη τοξικά υποπροϊόντα που τελικά εισέρχονται σε άλλες διεργασίες κύκλου θρεπτικών συστατικών (H, O, N, S, P, Fe, κ.λπ.). Έτσι, η κατανόηση της μικροβιακής οικοφυσιολογίας της ορυκτοποίησης αρωματικών ρύπων και του περιβαλλοντικού ελέγχου της είναι ζωτικής σημασίας για την αξιολόγηση του μικροβιακού κύκλου του άνθρακα, του καθαρού ισοζυγίου άνθρακα και των μελλοντικών κλιματικών κινδύνων. Δεδομένης της επείγουσας ανάγκης απομάκρυνσης τέτοιων ενώσεων από το περιβάλλον, έχουν αναδυθεί διάφορες οικολογικές βιομηχανίες που επικεντρώνονται στις καθαρές τεχνολογίες. Εναλλακτικά, η αξιοποίηση των βιομηχανικών αποβλήτων/χημικών αποβλήτων που συσσωρεύονται σε οικοσυστήματα (δηλαδή η προσέγγιση «από τα απόβλητα σε πλούτο») θεωρείται ένας από τους πυλώνες της κυκλικής οικονομίας και των στόχων βιώσιμης ανάπτυξης (Close et al., 2012). Συνεπώς, η κατανόηση των μεταβολικών, ενζυματικών και γενετικών πτυχών αυτών των πιθανών υποψήφιων ουσιών αποικοδόμησης είναι ύψιστης σημασίας για την αποτελεσματική απομάκρυνση και βιοαποκατάσταση τέτοιων αρωματικών ρύπων.
Μεταξύ των πολλών αρωματικών ρύπων, δίνουμε ιδιαίτερη προσοχή στους ΠΑΥ χαμηλού μοριακού βάρους, όπως το ναφθαλίνιο και τα υποκατεστημένα ναφθαλίνια. Αυτές οι ενώσεις αποτελούν κύρια συστατικά καυσίμων που προέρχονται από το πετρέλαιο, χρωστικών υφασμάτων, καταναλωτικών προϊόντων, φυτοφαρμάκων (ναφθαλίνη και εντομοαπωθητικά), πλαστικοποιητών και τανινών και ως εκ τούτου είναι ευρέως διαδεδομένες σε πολλά οικοσυστήματα (Preuss et al., 2003). Πρόσφατες αναφορές υπογραμμίζουν τη συσσώρευση συγκεντρώσεων ναφθαλινίου σε ιζήματα υδροφορέων, υπόγεια ύδατα και υποεπιφανειακά εδάφη, ζώνες βαντόζης και κοίτες ποταμών, υποδηλώνοντας τη βιοσυσσώρευσή του στο περιβάλλον (Duttagupta et al., 2019, 2020). Ο Πίνακας 2 συνοψίζει τις φυσικοχημικές ιδιότητες, τις εφαρμογές και τις επιπτώσεις στην υγεία του ναφθαλινίου και των παραγώγων του. Σε σύγκριση με άλλους ΠΑΥ υψηλού μοριακού βάρους, το ναφθαλίνιο και τα παράγωγά του είναι λιγότερο υδρόφοβα, πιο υδατοδιαλυτά και ευρέως κατανεμημένα στα οικοσυστήματα, επομένως χρησιμοποιούνται συχνά ως υποστρώματα μοντέλων για τη μελέτη του μεταβολισμού, της γενετικής και της μεταβολικής ποικιλομορφίας των ΠΑΥ. Ένας μεγάλος αριθμός μικροοργανισμών είναι σε θέση να μεταβολίζει το ναφθαλίνιο και τα παράγωγά του, και υπάρχουν διαθέσιμες ολοκληρωμένες πληροφορίες σχετικά με τις μεταβολικές τους οδούς, τα ένζυμα και τα ρυθμιστικά τους χαρακτηριστικά (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Επιπλέον, το ναφθαλίνιο και τα παράγωγά του χαρακτηρίζονται ως πρωτότυπες ενώσεις για την αξιολόγηση της περιβαλλοντικής ρύπανσης λόγω της υψηλής αφθονίας και βιοδιαθεσιμότητάς τους. Η Υπηρεσία Προστασίας του Περιβάλλοντος των ΗΠΑ εκτιμά ότι τα μέσα επίπεδα ναφθαλινίου είναι 5,19 μg ανά κυβικό μέτρο από τον καπνό τσιγάρων, κυρίως από ατελή καύση, και 7,8 έως 46 μg από τον καπνό παράπλευρης ροής, ενώ η έκθεση σε κρεόσωτο και ναφθαλίνιο είναι 100 έως 10.000 φορές υψηλότερη (Preuss et al. 2003). Το ναφθαλίνιο, ειδικότερα, έχει βρεθεί ότι έχει αναπνευστική τοξικότητα και καρκινογένεση ανά είδος, περιοχή και φύλο. Με βάση μελέτες σε ζώα, ο Διεθνής Οργανισμός Έρευνας για τον Καρκίνο (IARC) έχει ταξινομήσει το ναφθαλίνιο ως «πιθανό καρκινογόνο για τον άνθρωπο» (Ομάδα 2Β)1. Η έκθεση σε υποκατεστημένα ναφθαλίνια, κυρίως μέσω εισπνοής ή παρεντερικής (από του στόματος) χορήγησης, προκαλεί βλάβη στον πνευμονικό ιστό και αυξάνει τη συχνότητα εμφάνισης όγκων των πνευμόνων σε αρουραίους και ποντίκια (Εθνικό Πρόγραμμα Τοξικολογίας 2). Οι οξείες επιπτώσεις περιλαμβάνουν ναυτία, έμετο, κοιλιακό άλγος, διάρροια, πονοκέφαλο, σύγχυση, έντονη εφίδρωση, πυρετό, ταχυκαρδία κ.λπ. Από την άλλη πλευρά, το ευρέος φάσματος καρβαμιδικό εντομοκτόνο καρβαρύλιο (1-ναφθυλ Ν-μεθυλοκαρβαμιδικό) έχει αναφερθεί ότι είναι τοξικό για τα υδρόβια ασπόνδυλα, τα αμφίβια, τις μέλισσες και τους ανθρώπους και έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την ακετυλοχολινεστεράση προκαλώντας παράλυση (Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011). Επομένως, η κατανόηση των μηχανισμών της μικροβιακής αποικοδόμησης, της γενετικής ρύθμισης, των ενζυματικών και κυτταρικών αντιδράσεων είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη στρατηγικών βιοαποκατάστασης σε μολυσμένα περιβάλλοντα.
Πίνακας 2. Λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τις φυσικοχημικές ιδιότητες, τις χρήσεις, τις μεθόδους ταυτοποίησης και τις σχετικές ασθένειες του ναφθαλινίου και των παραγώγων του.
Σε μολυσμένες περιοχές, οι υδρόφοβοι και λιπόφιλοι αρωματικοί ρύποι μπορούν να προκαλέσουν μια ποικιλία κυτταρικών επιδράσεων στο περιβαλλοντικό μικροβίωμα (κοινότητα), όπως αλλαγές στη ρευστότητα της μεμβράνης, τη διαπερατότητα της μεμβράνης, τη διόγκωση της λιπιδικής διπλοστιβάδας, τη διαταραχή της μεταφοράς ενέργειας (κινητήρια δύναμη αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων/πρωτονίων) και τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μεμβράνη (Sikkema et al., 1995). Επιπλέον, ορισμένα διαλυτά ενδιάμεσα όπως οι κατεχόλες και οι κινόνες παράγουν δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και σχηματίζουν προϊόντα προσθήκης με DNA και πρωτεΐνες (Penning et al., 1999). Έτσι, η αφθονία τέτοιων ενώσεων στα οικοσυστήματα ασκεί επιλεκτική πίεση στις μικροβιακές κοινότητες ώστε να γίνουν αποτελεσματικοί αποικοδομητές σε διάφορα φυσιολογικά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένης της πρόσληψης/μεταφοράς, του ενδοκυτταρικού μετασχηματισμού, της αφομοίωσης/αξιοποίησης και της διαμερισματοποίησης.
Μια αναζήτηση στο Ribosomal Database Project-II (RDP-II) αποκάλυψε ότι συνολικά 926 βακτηριακά είδη απομονώθηκαν από μέσα ή καλλιέργειες εμπλουτισμού μολυσμένες με ναφθαλίνη ή παράγωγά της. Η ομάδα Proteobacteria είχε τον μεγαλύτερο αριθμό εκπροσώπων (n = 755), ακολουθούμενη από Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) και μη ταξινομημένα βακτήρια (8) (Σχήμα 2). Εκπρόσωποι των γ-Proteobacteria (Pseudomonadales και Xanthomonadales) κυριάρχησαν σε όλες τις Gram-αρνητικές ομάδες με υψηλή περιεκτικότητα σε G+C (54%), ενώ τα Clostridiales και Bacillales (30%) ήταν Gram-θετικές ομάδες με χαμηλή περιεκτικότητα σε G+C. Αναφέρθηκε ότι η Pseudomonas (ο μεγαλύτερος αριθμός, 338 είδη) είναι ικανή να αποικοδομεί το ναφθαλίνιο και τα μεθυλικά παράγωγά της σε διάφορα μολυσμένα οικοσυστήματα (λιθανθρακόπισσα, πετρέλαιο, αργό πετρέλαιο, λάσπη, πετρελαιοκηλίδες, λύματα, οργανικά απόβλητα και χώροι υγειονομικής ταφής) καθώς και σε άθικτα οικοσυστήματα (έδαφος, ποτάμια, ιζήματα και υπόγεια ύδατα) (Σχήμα 2). Επιπλέον, μελέτες εμπλουτισμού και μεταγονιδιωματική ανάλυση ορισμένων από αυτές τις περιοχές αποκάλυψαν ότι τα μη καλλιεργημένα είδη Legionella και Clostridium μπορεί να έχουν αποικοδομητική ικανότητα, υποδεικνύοντας την ανάγκη καλλιέργειας αυτών των βακτηρίων για τη μελέτη νέων οδών και μεταβολικής ποικιλομορφίας.
Σχήμα 2. Ταξινομική ποικιλομορφία και οικολογική κατανομή βακτηριακών αντιπροσώπων σε περιβάλλοντα μολυσμένα με ναφθαλίνη και παράγωγα ναφθαλίνης.
Μεταξύ των διαφόρων μικροοργανισμών που αποικοδομούν αρωματικούς υδρογονάνθρακες, οι περισσότεροι είναι ικανοί να αποικοδομήσουν το ναφθαλίνιο ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας. Η αλληλουχία των γεγονότων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του ναφθαλινίου έχει περιγραφεί για το Pseudomonas sp. (στελέχη: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 και CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 και άλλα στελέχη (ND6 και AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis and Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Ο μεταβολισμός ξεκινά από μια πολυσυστατική διοξυγενάση [ναφθαλινοδιοξυγενάση (NDO), μια διοξυλιωτική δακτυλιοειδής διοξυγενάση] που καταλύει την οξείδωση ενός από τους αρωματικούς δακτυλίους του ναφθαλινίου χρησιμοποιώντας μοριακό οξυγόνο ως άλλο υπόστρωμα, μετατρέποντας το ναφθαλίνιο σε cis-ναφθαλινοδιόλη (Σχήμα 3). Η cis-διυδροδιόλη μετατρέπεται σε 1,2-διυδροξυναφθαλίνιο με αφυδρογονάση. Μια διοξυγενάση που διασπά τον δακτύλιο, η 1,2-διυδροξυναφθαλινοδιοξυγενάση (12DHNDO), μετατρέπει το 1,2-διυδροξυναφθαλίνιο σε 2-υδροξυχρωμενο-2-καρβοξυλικό οξύ. Η ενζυμική cis-trans ισομερείωση παράγει trans-ο-υδροξυβενζυλιδενοπυροσταφυλικό, το οποίο διασπάται από την υδρατάση αλδολάσης σε σαλικυλική αλδεΰδη και πυροσταφυλικό. Το οργανικό πυροσταφυλικό οξύ ήταν η πρώτη ένωση C3 που προήλθε από τον σκελετό άνθρακα του ναφθαλινίου και κατευθύνθηκε στην κεντρική οδό άνθρακα. Επιπλέον, η εξαρτώμενη από NAD+ αφυδρογονάση της σαλικυλαλδεΰδης μετατρέπει τη σαλικυλαλδεΰδη σε σαλικυλικό οξύ. Ο μεταβολισμός σε αυτό το στάδιο ονομάζεται «ανώτερη οδός» αποικοδόμησης ναφθαλινίου. Αυτή η οδός είναι πολύ συχνή στα περισσότερα βακτήρια που αποικοδομούν το ναφθαλίνιο. Ωστόσο, υπάρχουν μερικές εξαιρέσεις. για παράδειγμα, στο θερμόφιλο Bacillus hamburgii 2, η αποικοδόμηση του ναφθαλινίου ξεκινά από τη ναφθαλινο 2,3-διοξυγενάση για να σχηματίσει 2,3-διυδροξυναφθαλίνιο (Annweiler et al., 2000).
Σχήμα 3. Οδοί αποικοδόμησης ναφθαλινίου, μεθυλοναφθαλινίου, ναφθοϊκού οξέος και καρβαρυλίου. Οι κυκλωμένοι αριθμοί αντιπροσωπεύουν ένζυμα υπεύθυνα για τη διαδοχική μετατροπή του ναφθαλινίου και των παραγώγων του σε επόμενα προϊόντα. 1 — ναφθαλινοδιοξυγενάση (NDO). 2, cis-διυδροδιόλη αφυδρογονάση. 3, 1,2-διυδροξυναφθαλινοδιοξυγενάση. 4, 2-υδροξυχρωμενο-2-καρβοξυλικό οξύ ισομεράση. 5, trans-O-υδροξυβενζυλιδενοπυροσταφυλική υδρατάση αλδολάση. 6, σαλικυλαλδεΰδη αφυδρογονάση. 7, σαλικυλικό 1-υδροξυλάση. 8, κατεχόλη 2,3-διοξυγενάση (C23DO). 9, 2-υδροξυμουκονική ημιαλδεΰδη αφυδρογονάση. 10, 2-οξοπεντ-4-ενοϊκή υδρατάση. 11, 4-υδροξυ-2-οξοπεντανοϊκή αλδολάση. 12, αφυδρογονάση ακεταλδεΰδης· 13, κατεχολ-1,2-διοξυγενάση (C12DO)· 14, μουκονική κυκλοϊσομεράση· 15, μουκονολακτόνη δέλτα-ισομεράση· 16, υδρολάση β-κετοαδιπατενολακτόνης· 17, β-κετοαδιπική σουκινυλ-CoA τρανσφεράση· 18, β-κετοαδιπική-CoA θειολάση· 19, σουκινυλ-CoA: ακετυλο-CoA σουκινυλτρανσφεράση· 20, σαλικυλική 5-υδροξυλάση· 21 – γεντισάτη 1,2-διοξυγενάση (GDO)· 22, μαλεϋλπυροσταφυλική ισομεράση· 23, φουμαρυλπυροσταφυλική υδρολάση· 24, μεθυλοναφθαλινική υδροξυλάση (NDO)· 25, υδροξυμεθυλοναφθαλινική αφυδρογονάση· 26, ναφθαλδεϋδο-αφυδρογονάση· 27, οξειδάση του 3-φορμυλοσαλικυλικού οξέος· 28, υδροξυισοφθαλική δεκαρβοξυλάση· 29, καρβαρυλική υδρολάση (CH3)· 30, 1-ναφθολ-2-υδροξυλάση.
Ανάλογα με τον οργανισμό και τη γενετική του σύνθεση, το προκύπτον σαλικυλικό οξύ μεταβολίζεται περαιτέρω είτε μέσω της κατεχολικής οδού χρησιμοποιώντας σαλικυλικό 1-υδροξυλάση (S1H) είτε μέσω της γεντισιτικής οδού χρησιμοποιώντας σαλικυλικό 5-υδροξυλάση (S5H) (Σχήμα 3). Δεδομένου ότι το σαλικυλικό οξύ είναι το κύριο ενδιάμεσο στον μεταβολισμό του ναφθαλινίου (ανώτερη οδός), τα βήματα από το σαλικυλικό οξύ στο ενδιάμεσο TCA συχνά αναφέρονται ως η κατώτερη οδός και τα γονίδια οργανώνονται σε ένα μόνο οπερόνιο. Είναι σύνηθες να βλέπουμε ότι τα γονίδια στο οπερόνιο της ανώτερης οδού (nah) και στο οπερόνιο της κατώτερης οδού (sal) ρυθμίζονται από κοινούς ρυθμιστικούς παράγοντες. Για παράδειγμα, το NahR και το σαλικυλικό οξύ δρουν ως επαγωγείς, επιτρέποντας και στα δύο οπερόνια να μεταβολίσουν πλήρως το ναφθαλίνιο (Phale et al., 2019, 2020).
Επιπλέον, η κατεχόλη διασπάται κυκλικά σε 2-υδροξυμουκονική ημιαλδεΰδη μέσω της μετα-οδού από την κατεχολ 2,3-διοξυγενάση (C23DO) (Yen et al., 1988) και υδρολύεται περαιτέρω από την υδρολάση 2-υδροξυμουκονικής ημιαλδεΰδης για να σχηματίσει 2-υδροξυπεντ-2,4-διενοϊκό οξύ. Το 2-υδροξυπεντ-2,4-διενοϊκό στη συνέχεια μετατρέπεται σε πυροσταφυλικό και ακεταλδεΰδη από μια υδρατάση (2-οξοπεντ-4-ενοϊκή υδρατάση) και μια αλδολάση (4-υδροξυ-2-οξοπεντανοϊκή αλδολάση) και στη συνέχεια εισέρχεται στην κεντρική οδό άνθρακα (Σχήμα 3). Εναλλακτικά, η κατεχόλη διασπάται κυκλικά σε cis,cis-μουκονικό μέσω της ορθο-οδού από την κατεχολ 1,2-οξυγενάση (C12DO). Η μουκονική κυκλοϊσομεράση, η μουκονολακτονική ισομεράση και η β-κετοαδιπική-νολακτονική υδρολάση μετατρέπουν το cis,cis-μουκονικό σε 3-οξοαδιπικό, το οποίο εισέρχεται στην κεντρική οδό άνθρακα μέσω του σουκινυλ-CoA και του ακετυλ-CoA (Nozaki et al., 1968) (Σχήμα 3).
Στην οδό του γεντισάτου (2,5-διυδροξυβενζοϊκό), ο αρωματικός δακτύλιος διασπάται από την γεντισάτη 1,2-διοξυγενάση (GDO) για να σχηματίσει μαλεϋλοπυροσταφυλικό. Αυτό το προϊόν μπορεί να υδρολυθεί απευθείας σε πυροσταφυλικό και μηλικό, ή μπορεί να ισομεριστεί για να σχηματίσει φουμαρυλοπυροσταφυλικό, το οποίο στη συνέχεια μπορεί να υδρολυθεί σε πυροσταφυλικό και φουμαρικό (Larkin and Day, 1986). Η επιλογή της εναλλακτικής οδού έχει παρατηρηθεί τόσο σε Gram-αρνητικά όσο και σε Gram-θετικά βακτήρια σε βιοχημικό και γενετικό επίπεδο (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Τα Gram-αρνητικά βακτήρια (Pseudomonas) προτιμούν να χρησιμοποιούν σαλικυλικό οξύ, το οποίο είναι ένας επαγωγέας του μεταβολισμού του ναφθαλινίου, αποκαρβοξυλιώνοντάς το σε κατεχόλη χρησιμοποιώντας σαλικυλική 1-υδροξυλάση (Gibson and Subramanian, 1984). Από την άλλη πλευρά, στα Gram-θετικά βακτήρια (Rhodococcus), η σαλικυλική 5-υδροξυλάση μετατρέπει το σαλικυλικό οξύ σε γεντισικό οξύ, ενώ το σαλικυλικό οξύ δεν έχει επαγωγική επίδραση στη μεταγραφή των γονιδίων ναφθαλίνης (Grund et al., 1992) (Σχήμα 3).
Έχει αναφερθεί ότι είδη όπως τα Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas και Mycobacterium μπορούν να αποικοδομήσουν το μονομεθυλοναφθαλίνιο ή το διμεθυλοναφθαλίνιο (Dean-Raymond and Bartha, 1975; Cane and Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Μεταξύ αυτών, η οδός αποικοδόμησης του Pseudomonas sp. CSV86 σε 1-μεθυλοναφθαλίνιο και 2-μεθυλοναφθαλίνιο έχει μελετηθεί με σαφήνεια σε βιοχημικό και ενζυματικό επίπεδο (Mahajan et al., 1994). Το 1-μεθυλοναφθαλίνιο μεταβολίζεται μέσω δύο οδών. Αρχικά, ο αρωματικός δακτύλιος υδροξυλιώνεται (ο μη υποκατεστημένος δακτύλιος του μεθυλοναφθαλινίου) για να σχηματίσει cis-1,2-διυδροξυ-1,2-διυδρο-8-μεθυλοναφθαλίνιο, το οποίο οξειδώνεται περαιτέρω σε σαλικυλικό μεθυλεστέρα και μεθυλοκατεχόλη, και στη συνέχεια εισέρχεται στην κεντρική οδό άνθρακα μετά τη διάσπαση του δακτυλίου (Σχήμα 3). Αυτή η οδός ονομάζεται «οδός πηγής άνθρακα». Στη δεύτερη «οδό αποτοξίνωσης», η μεθυλομάδα μπορεί να υδροξυλιωθεί με NDO για να σχηματίσει 1-υδροξυμεθυλοναφθαλίνιο, το οποίο οξειδώνεται περαιτέρω σε 1-ναφθοϊκό οξύ και απεκκρίνεται στο μέσο καλλιέργειας ως αδιέξοδο προϊόν. Μελέτες έχουν δείξει ότι το στέλεχος CSV86 δεν είναι σε θέση να αναπτυχθεί σε 1- και 2-ναφθοϊκό οξύ ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας, επιβεβαιώνοντας την οδό αποτοξίνωσης (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). Στο 2-μεθυλοναφθαλίνιο, η μεθυλομάδα υφίσταται υδροξυλίωση από υδροξυλάση για να σχηματίσει 2-υδροξυμεθυλοναφθαλίνιο. Επιπλέον, ο μη υποκατεστημένος δακτύλιος του δακτυλίου ναφθαλίνης υφίσταται υδροξυλίωση του δακτυλίου για να σχηματίσει μια διυδροδιόλη, η οποία οξειδώνεται σε 4-υδροξυμεθυλοκατεχόλη σε μια σειρά αντιδράσεων που καταλύονται από ένζυμα και εισέρχεται στην κεντρική οδό άνθρακα μέσω της οδού διάσπασης του μετα-δακτυλίου. Ομοίως, αναφέρθηκε ότι το S. paucimobilis 2322 χρησιμοποιεί NDO για την υδροξυλίωση του 2-μεθυλοναφθαλινίου, το οποίο οξειδώνεται περαιτέρω για να σχηματίσει σαλικυλικό μεθυλεστέρα και μεθυλοκατεχόλη (Dutta et al., 1998).
Τα ναφθοϊκά οξέα (υποκατεστημένα/μη υποκατεστημένα) είναι υποπροϊόντα αποτοξίνωσης/βιομετασχηματισμού που σχηματίζονται κατά την αποικοδόμηση του μεθυλοναφθαλινίου, του φαινανθρενίου και του ανθρακενίου και απελευθερώνονται στο χρησιμοποιημένο μέσο καλλιέργειας. Έχει αναφερθεί ότι το απομονωμένο εδαφικό στέλεχος Stenotrophomonas maltophilia CSV89 είναι ικανό να μεταβολίζει το 1-ναφθοϊκό οξύ ως πηγή άνθρακα (Phale et al., 1995). Ο μεταβολισμός ξεκινά με διυδροξυλίωση του αρωματικού δακτυλίου για να σχηματίσει 1,2-διυδροξυ-8-καρβοξυναφθαλίνιο. Η προκύπτουσα διόλη οξειδώνεται σε κατεχόλη μέσω 2-υδροξυ-3-καρβοξυβενζυλιδενοπυροσταφυλικού, 3-φορμυλοσαλικυλικού οξέος, 2-υδροξυισοφθαλικού οξέος και σαλικυλικού οξέος και εισέρχεται στην κεντρική οδό άνθρακα μέσω της οδού διάσπασης του μετα-δακτυλίου (Σχήμα 3).
Το καρβαρύλιο είναι ένα ναφθυλοκαρβαμιδικό φυτοφάρμακο. Από την Πράσινη Επανάσταση στην Ινδία τη δεκαετία του 1970, η χρήση χημικών λιπασμάτων και φυτοφαρμάκων έχει οδηγήσει σε αύξηση των εκπομπών πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (ΠΑΥ) από γεωργικές μη σημειακές πηγές (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Υπολογίζεται ότι το 55% (85.722.000 εκτάρια) της συνολικής καλλιεργήσιμης γης στην Ινδία υποβάλλεται σε επεξεργασία με χημικά φυτοφάρμακα. Τα τελευταία πέντε χρόνια (2015–2020), ο αγροτικός τομέας της Ινδίας έχει χρησιμοποιήσει κατά μέσο όρο 55.000 έως 60.000 τόνους φυτοφαρμάκων ετησίως (Τμήμα Συνεταιρισμών και Πρόνοιας Αγροτών, Υπουργείο Γεωργίας, Κυβέρνηση της Ινδίας, Αύγουστος 2020). Στις βόρειες και κεντρικές πεδιάδες του Γάγγη (οι πολιτείες με τον υψηλότερο πληθυσμό και πυκνότητα πληθυσμού), η χρήση φυτοφαρμάκων στις καλλιέργειες είναι ευρέως διαδεδομένη, με κυρίαρχα τα εντομοκτόνα. Το καρβαρύλιο (1-ναφθυλο-Ν-μεθυλοκαρβαμικό) είναι ένα εντομοκτόνο καρβαμικού ευρέος φάσματος, μέτριας έως υψηλής τοξικότητας, που χρησιμοποιείται στην ινδική γεωργία με μέσο ρυθμό 100-110 τόνων. Πωλείται συνήθως με την εμπορική ονομασία Sevin και χρησιμοποιείται για τον έλεγχο εντόμων (αφίδες, μυρμήγκια φωτιάς, ψύλλοι, ακάρεα, αράχνες και πολλά άλλα εξωτερικά παράσιτα) που επηρεάζουν μια ποικιλία καλλιεργειών (καλαμπόκι, σόγια, βαμβάκι, φρούτα και λαχανικά). Ορισμένοι μικροοργανισμοί όπως Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus και Arthrobacter μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο άλλων παρασίτων. Έχει αναφερθεί ότι η RC100 μπορεί να αποικοδομήσει το καρβαρύλιο (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Η οδός αποικοδόμησης του καρβαρυλίου έχει μελετηθεί εκτενώς σε βιοχημικό, ενζυματικό και γενετικό επίπεδο σε απομονωμένα στελέχη εδάφους των στελεχών Pseudomonas sp. C4, C5 και C6 (Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Εικ. 3). Η μεταβολική οδός ξεκινά με την υδρόλυση του δεσμού εστέρα από την καρβαρυλική υδρολάση (CH4) για να σχηματίσει 1-ναφθόλη, μεθυλαμίνη και διοξείδιο του άνθρακα. Η 1-ναφθόλη στη συνέχεια μετατρέπεται σε 1,2-διυδροξυναφθαλίνιο από την 1-ναφθόλη υδροξυλάση (1-NH), η οποία μεταβολίζεται περαιτέρω μέσω της κεντρικής οδού άνθρακα μέσω σαλικυλικού και γεντισικού. Ορισμένα βακτήρια που αποικοδομούν καρβαρύλιο έχουν αναφερθεί ότι το μεταβολίζουν σε σαλικυλικό οξύ μέσω διάσπασης του ορθο δακτυλίου της κατεχόλης (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). Αξιοσημείωτα, τα βακτήρια που αποικοδομούν ναφθαλίνιο μεταβολίζουν κυρίως το σαλικυλικό οξύ μέσω της κατεχόλης, ενώ τα βακτήρια που αποικοδομούν καρβαρύλιο προτιμούν να μεταβολίζουν το σαλικυλικό οξύ μέσω της οδού γεντισικού.
Τα παράγωγα ναφθαλινοσουλφονικού οξέος/δισουλφονικού οξέος και ναφθυλαμινοσουλφονικού οξέος μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ενδιάμεσα στην παραγωγή αζωχρωμάτων, διαβρεκτικών, διασπορέων κ.λπ. Αν και αυτές οι ενώσεις έχουν χαμηλή τοξικότητα για τον άνθρωπο, οι αξιολογήσεις κυτταροτοξικότητας έχουν δείξει ότι είναι θανατηφόρες για τα ψάρια, τις δάφνιες και τα φύκια (Greim et al., 1994). Έχει αναφερθεί ότι εκπρόσωποι του γένους Pseudomonas (στελέχη A3, C22) ξεκινούν τον μεταβολισμό τους με διπλή υδροξυλίωση του αρωματικού δακτυλίου που περιέχει την ομάδα σουλφονικού οξέος για να σχηματίσουν μια διυδροδιόλη, η οποία μετατρέπεται περαιτέρω σε 1,2-διυδροξυναφθαλίνιο με αυθόρμητη διάσπαση της θειώδους ομάδας (Brilon et al., 1981). Το προκύπτον 1,2-διυδροξυναφθαλίνιο καταβολίζεται μέσω της κλασικής οδού ναφθαλινίου, δηλαδή της οδού κατεχόλης ή γεντισάτης (Σχήμα 4). Έχει αποδειχθεί ότι το αμινοναφθαλινοσουλφονικό οξύ και το υδροξυναφθαλινοσουλφονικό οξύ μπορούν να αποικοδομηθούν πλήρως από μικτές βακτηριακές κοινοπραξίες με συμπληρωματικές καταβολικές οδούς (Nortemann et al., 1986). Έχει αποδειχθεί ότι ένα μέλος της κοινοπραξίας αποθείωνει το αμινοναφθαλινοσουλφονικό οξύ ή το υδροξυναφθαλινοσουλφονικό οξύ μέσω 1,2-διοξυγόνωσης, ενώ το αμινοσαλικυλικό ή το υδροξυσαλικυλικό απελευθερώνεται στο μέσο καλλιέργειας ως αδιέξοδος μεταβολίτης και στη συνέχεια προσλαμβάνεται από άλλα μέλη της κοινοπραξίας. Το ναφθαλινοδισουλφονικό οξύ είναι σχετικά πολικό αλλά ελάχιστα βιοδιασπώμενο και επομένως μπορεί να μεταβολιστεί μέσω διαφορετικών οδών. Η πρώτη αποθείωση συμβαίνει κατά την περιοχική εκλεκτική διυδροξυλίωση του αρωματικού δακτυλίου και της ομάδας σουλφονικού οξέος. Η δεύτερη αποθείωση συμβαίνει κατά την υδροξυλίωση του 5-σουλφοσαλικυλικού οξέος από την 5-υδροξυλάση του σαλικυλικού οξέος για να σχηματιστεί γεντισικό οξύ, το οποίο εισέρχεται στην κεντρική οδό άνθρακα (Brilon et al., 1981) (Σχήμα 4). Τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για την αποικοδόμηση του ναφθαλινίου είναι επίσης υπεύθυνα για τον μεταβολισμό του ναφθαλινοσουλφονικού (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Σχήμα 4. Μεταβολικές οδοί για την αποικοδόμηση του ναφθαλινοσουλφονικού άλατος. Οι αριθμοί μέσα στους κύκλους αντιπροσωπεύουν τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για τον μεταβολισμό του ναφθυλοσουλφονικού άλατος, παρόμοια/πανομοιότυπα με τα ένζυμα που περιγράφονται στο ΣΧ. 3.
Οι ΠΑΥ χαμηλού μοριακού βάρους (LMW-PAH) είναι αναγώγιμοι, υδρόφοβοι και ελάχιστα διαλυτοί και επομένως δεν είναι ευαίσθητοι σε φυσική διάσπαση/αποικοδόμηση. Ωστόσο, οι αερόβιοι μικροοργανισμοί είναι σε θέση να τους οξειδώσουν απορροφώντας μοριακό οξυγόνο (O2). Αυτά τα ένζυμα ανήκουν κυρίως στην κατηγορία των οξειδοαναγωγασών και μπορούν να εκτελέσουν διάφορες αντιδράσεις όπως υδροξυλίωση αρωματικού δακτυλίου (μονο- ή διυδροξυλίωση), αφυδρογόνωση και διάσπαση αρωματικού δακτυλίου. Τα προϊόντα που λαμβάνονται από αυτές τις αντιδράσεις βρίσκονται σε υψηλότερη κατάσταση οξείδωσης και μεταβολίζονται πιο εύκολα μέσω της κεντρικής οδού άνθρακα (Phale et al., 2020). Τα ένζυμα στην οδό αποικοδόμησης έχουν αναφερθεί ότι είναι επαγώγιμα. Η δραστικότητα αυτών των ενζύμων είναι πολύ χαμηλή ή αμελητέα όταν τα κύτταρα αναπτύσσονται σε απλές πηγές άνθρακα όπως γλυκόζη ή οργανικά οξέα. Ο Πίνακας 3 συνοψίζει τα διάφορα ένζυμα (οξυγενάσες, υδρολάσες, αφυδρογονάσες, οξειδάσες κ.λπ.) που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του ναφθαλινίου και των παραγώγων του.
Πίνακας 3. Βιοχημικά χαρακτηριστικά των ενζύμων που είναι υπεύθυνα για την αποικοδόμηση του ναφθαλινίου και των παραγώγων του.
Μελέτες ραδιοϊσοτόπων (18O2) έχουν δείξει ότι η ενσωμάτωση μοριακού O2 σε αρωματικούς δακτυλίους από οξυγενάσες είναι το πιο σημαντικό βήμα στην ενεργοποίηση περαιτέρω βιοαποικοδόμησης μιας ένωσης (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Η ενσωμάτωση ενός ατόμου οξυγόνου (O) από το μοριακό οξυγόνο (O2) στο υπόστρωμα ξεκινά είτε από ενδογενείς είτε από εξωγενείς μονοοξυγενάσες (που ονομάζονται επίσης υδροξυλάσες). Ένα άλλο άτομο οξυγόνου ανάγεται σε νερό. Οι εξωγενείς μονοοξυγενάσες ανάγουν τη φλαβίνη με NADH ή NADPH, ενώ στις ενδομονοοξυγενάσες η φλαβίνη ανάγεται από το υπόστρωμα. Η θέση υδροξυλίωσης έχει ως αποτέλεσμα την ποικιλομορφία στον σχηματισμό του προϊόντος. Για παράδειγμα, η σαλικυλική 1-υδροξυλάση υδροξυλιώνει το σαλικυλικό οξύ στη θέση C1, σχηματίζοντας κατεχόλη. Από την άλλη πλευρά, η πολυσυστατική σαλικυλική 5-υδροξυλάση (που περιέχει υπομονάδες αναγωγάσης, φερρεδοξίνης και οξυγενάσης) υδροξυλιώνει το σαλικυλικό οξύ στη θέση C5, σχηματίζοντας γεντισικό οξύ (Yamamoto et al., 1965).
Οι διοξυγενάσες ενσωματώνουν δύο άτομα Ο2 στο υπόστρωμα. Ανάλογα με τα προϊόντα που σχηματίζονται, διαιρούνται σε διοξυγενάσες υδροξυλιώσεως δακτυλίου και διοξυγενάσες διάσπασης δακτυλίου. Οι διοξυγενάσες υδροξυλιώσεως δακτυλίου μετατρέπουν τα αρωματικά υποστρώματα σε cis-διυδροδιόλες (π.χ. ναφθαλίνιο) και είναι ευρέως διαδεδομένες μεταξύ των βακτηρίων. Μέχρι σήμερα, έχει αποδειχθεί ότι οι οργανισμοί που περιέχουν διοξυγενάσες υδροξυλιώσεως δακτυλίου είναι ικανοί να αναπτύσσονται σε διάφορες αρωματικές πηγές άνθρακα και αυτά τα ένζυμα ταξινομούνται ως NDO (ναφθαλίνιο), τολουολοδιοξυγενάση (TDO, τολουόλιο) και διφαινυλοδιοξυγενάση (BPDO, διφαινύλιο). Τόσο το NDO όσο και το BPDO μπορούν να καταλύσουν την διπλή οξείδωση και την υδροξυλίωση της πλευρικής αλυσίδας διαφόρων πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (τολουόλιο, νιτροτολουόλιο, ξυλόλιο, αιθυλοβενζόλιο, ναφθαλίνιο, διφαινύλιο, φλουορένιο, ινδόλιο, μεθυλοναφθαλίνιο, ναφθαλινοσουλφονικό, φαινανθρένιο, ανθρακένιο, ακετοφαινόνη, κ.λπ.) (Boyd and Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). Το NDO είναι ένα σύστημα πολλαπλών συστατικών που αποτελείται από μια οξειδοαναγωγάση, μια φερρεδοξίνη και ένα συστατικό οξυγενάσης που περιέχει ενεργό κέντρο (Gibson and Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Η καταλυτική μονάδα του NDO αποτελείται από μια μεγάλη α υπομονάδα και μια μικρή β υπομονάδα διατεταγμένες σε διαμόρφωση α3β3. Η NDO ανήκει σε μια μεγάλη οικογένεια οξυγενασών και η α-υπομονάδα της περιέχει μια θέση Rieske [2Fe-2S] και έναν μονοπύρηνο μη αιμικό σίδηρο, ο οποίος καθορίζει την εξειδίκευση του υποστρώματος της NDO (Parales et al., 1998). Συνήθως, σε έναν καταλυτικό κύκλο, δύο ηλεκτρόνια από την αναγωγή του νουκλεοτιδίου πυριδίνης μεταφέρονται στο ιόν Fe(II) στην ενεργό θέση μέσω μιας αναγωγάσης, μιας φερρεδοξίνης και μιας θέσης Rieske. Τα αναγωγικά ισοδύναμα ενεργοποιούν το μοριακό οξυγόνο, το οποίο αποτελεί προϋπόθεση για την διυδροξυλίωση του υποστρώματος (Ferraro et al., 2005). Μέχρι σήμερα, μόνο λίγα NDO έχουν καθαριστεί και χαρακτηριστεί λεπτομερώς από διαφορετικά στελέχη και ο γενετικός έλεγχος των οδών που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση του ναφθαλινίου έχει μελετηθεί λεπτομερώς (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Οι διοξυγενάσες που διασπούν τον δακτύλιο (ένζυμα ενδο- ή ορθο-διασπώμενα και ένζυμα εξοδιόλης ή μετα-διασπώμενα) δρουν σε υδροξυλιωμένες αρωματικές ενώσεις. Για παράδειγμα, η ορθο-διασπώμενη διοξυγενάση είναι η κατεχολ-1,2-διοξυγενάση, ενώ η μετα-διασπώμενη διοξυγενάση είναι η κατεχολ-2,3-διοξυγενάση (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Εκτός από τις διάφορες οξυγενάσες, υπάρχουν επίσης διάφορες αφυδρογονάσες υπεύθυνες για την αφυδρογόνωση αρωματικών διυδροδιολών, αλκοολών και αλδεϋδών και χρησιμοποιούν NAD+/NADP+ ως δέκτες ηλεκτρονίων, τα οποία είναι μερικά από τα σημαντικά ένζυμα που εμπλέκονται στον μεταβολισμό (Gibson and Subramanian, 1984; Shaw and Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Ένζυμα όπως οι υδρολάσες (εστεράσες, αμιδάσες) είναι μια δεύτερη σημαντική κατηγορία ενζύμων που χρησιμοποιούν νερό για να διασπάσουν ομοιοπολικούς δεσμούς και εμφανίζουν ευρεία εξειδίκευση υποστρώματος. Η καρβαρυλική υδρολάση και άλλες υδρολάσες θεωρούνται συστατικά του περιπλάσματος (διαμεμβρανικού) σε μέλη Gram-αρνητικών βακτηρίων (Kamini et al., 2018). Το καρβαρύλιο έχει αμιδικό και εστερικό δεσμό. Επομένως, μπορεί να υδρολυθεί είτε από εστεράση είτε από αμιδάση για να σχηματίσει 1-ναφθόλη. Έχει αναφερθεί ότι το καρβαρύλιο στο στέλεχος Rhizobium rhizobium AC10023 και στο στέλεχος Arthrobacter RC100 λειτουργεί ως εστεράση και αμιδάση, αντίστοιχα. Το καρβαρύλιο στο στέλεχος Arthrobacter RC100 λειτουργεί επίσης ως αμιδάση. Έχει αποδειχθεί ότι το RC100 υδρολύει τέσσερα εντομοκτόνα κατηγορίας Ν-μεθυλοκαρβαμικού όπως καρβαρύλιο, μεθομύλιο, μεφεναμικό οξύ και XMC (Hayaatsu et al., 2001). Έχει αναφερθεί ότι το CH στο Pseudomonas sp. C5pp μπορεί να δράσει στο καρβαρύλιο (δραστηριότητα 100%) και στο οξικό 1-ναφθύλιο (δραστηριότητα 36%), αλλά όχι στο 1-ναφθυλακεταμίδιο, γεγονός που υποδηλώνει ότι πρόκειται για εστεράση (Trivedi et al., 2016).
Βιοχημικές μελέτες, πρότυπα ρύθμισης ενζύμων και γενετική ανάλυση έχουν δείξει ότι τα γονίδια αποικοδόμησης ναφθαλινίου αποτελούνται από δύο επαγώγιμες ρυθμιστικές μονάδες ή «οπερόνια»: nah (η «ανοδική οδός», που μετατρέπει το ναφθαλίνιο σε σαλικυλικό οξύ) και sal (η «κατάντη οδός», που μετατρέπει το σαλικυλικό οξύ στην κεντρική οδό άνθρακα μέσω κατεχόλης). Το σαλικυλικό οξύ και τα ανάλογά του μπορούν να λειτουργήσουν ως επαγωγείς (Shamsuzzaman και Barnsley, 1974). Παρουσία γλυκόζης ή οργανικών οξέων, το οπερόνιο καταστέλλεται. Το Σχήμα 5 δείχνει την πλήρη γενετική οργάνωση της αποικοδόμησης ναφθαλινίου (σε μορφή οπερονίου). Έχουν περιγραφεί αρκετές ονομαστικές παραλλαγές/μορφές του γονιδίου nah (ndo/pah/dox) και έχουν βρεθεί ότι έχουν υψηλή ομολογία αλληλουχίας (90%) μεταξύ όλων των ειδών Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Τα γονίδια της ανοδικής οδού ναφθαλινίου ήταν γενικά διατεταγμένα με συναινετική σειρά όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α. Ένα άλλο γονίδιο, το nahQ, αναφέρθηκε επίσης ότι εμπλέκεται στον μεταβολισμό του ναφθαλινίου και συνήθως βρισκόταν μεταξύ του nahC και του nahE, αλλά η πραγματική του λειτουργία παραμένει άγνωστη. Ομοίως, το γονίδιο nahY, υπεύθυνο για την ευαίσθητη στο ναφθαλίνιο χημειοταξία, βρέθηκε στο άκρο του οπερονίου nah σε ορισμένα μέλη. Στο Ralstonia sp., το γονίδιο U2 που κωδικοποιεί τη γλουταθειόνη S-τρανσφεράση (gsh) βρέθηκε να βρίσκεται μεταξύ του nahAa και του nahAb, αλλά δεν επηρέασε τα χαρακτηριστικά αξιοποίησης του ναφθαλινίου (Zylstra et al., 1997).
Σχήμα 5. Γενετική οργάνωση και ποικιλομορφία που παρατηρήθηκε κατά την αποικοδόμηση του ναφθαλινίου μεταξύ βακτηριακών ειδών. (Α) Άνω οδός ναφθαλινίου, μεταβολισμός του ναφθαλινίου σε σαλικυλικό οξύ. (Β) Κάτω οδός ναφθαλινίου, σαλικυλικό οξύ μέσω κατεχόλης προς την κεντρική οδό άνθρακα. (Γ) σαλικυλικό οξύ μέσω γεντισάτης προς την κεντρική οδό άνθρακα.
Η «κατώτερη οδός» (οπερόνιο sal) αποτελείται συνήθως από το nahGTHINLMOKJ και μετατρέπει το σαλικυλικό σε πυροσταφυλικό και ακεταλδεΰδη μέσω της οδού διάσπασης κατεχολικής μέτρησης. Το γονίδιο nahG (που κωδικοποιεί την σαλικυλική υδροξυλάση) βρέθηκε να είναι συντηρημένο στο εγγύς άκρο του οπερονίου (Εικ. 5Β). Σε σύγκριση με άλλα στελέχη που αποικοδομούν ναφθαλίνη, στο P. putida CSV86 τα οπερόνια nah και sal είναι διαδοχικά και πολύ στενά συγγενικά (περίπου 7,5 kb). Σε ορισμένα Gram-αρνητικά βακτήρια, όπως τα Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 και P. putida AK5, το ναφθαλίνιο μεταβολίζεται ως κεντρικός μεταβολίτης άνθρακα μέσω της οδού gentisate (με τη μορφή του οπερονίου sgp/nag). Η γονιδιακή κασέτα αναπαρίσταται τυπικά με τη μορφή nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, όπου το nagR (που κωδικοποιεί έναν ρυθμιστή τύπου LysR) βρίσκεται στο άνω άκρο (Σχήμα 5C).
Το καρβαρύλιο εισέρχεται στον κεντρικό κύκλο του άνθρακα μέσω του μεταβολισμού της 1-ναφθόλης, του 1,2-διυδροξυναφθαλινίου, του σαλικυλικού οξέος και του γεντισικού οξέος (Σχήμα 3). Με βάση γενετικές και μεταβολικές μελέτες, έχει προταθεί η διαίρεση αυτής της οδού σε «ανάντη» (μετατροπή καρβαρυλίου σε σαλικυλικό οξύ), «μεσαία» (μετατροπή σαλικυλικού οξέος σε γεντισικό οξύ) και «κατάντη» (μετατροπή γεντισικού οξέος σε ενδιάμεσα της κεντρικής οδού άνθρακα) (Singh et al., 2013). Η γονιδιωματική ανάλυση του C5pp (supercontig A, 76,3 kb) αποκάλυψε ότι το γονίδιο mcbACBDEF εμπλέκεται στη μετατροπή του καρβαρυλίου σε σαλικυλικό οξύ, ακολουθούμενο από το mcbIJKL στη μετατροπή του σαλικυλικού οξέος σε γεντισικό οξύ και το mcbOQP στη μετατροπή του γεντισικού οξέος σε ενδιάμεσα κεντρικού άνθρακα (φουμαρικό και πυροσταφυλικό, Trivedi et al., 2016) (Σχήμα 6).
Έχει αναφερθεί ότι τα ένζυμα που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση αρωματικών υδρογονανθράκων (συμπεριλαμβανομένου του ναφθαλινίου και του σαλικυλικού οξέος) μπορούν να προκληθούν από τις αντίστοιχες ενώσεις και να ανασταλούν από απλές πηγές άνθρακα όπως η γλυκόζη ή τα οργανικά οξέα (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Μεταξύ των διαφόρων μεταβολικών οδών του ναφθαλινίου και των παραγώγων του, τα ρυθμιστικά χαρακτηριστικά του ναφθαλινίου και του καρβαρυλίου έχουν μελετηθεί σε κάποιο βαθμό. Για το ναφθαλίνιο, τα γονίδια τόσο στις ανοδικές όσο και στις κατάντη οδούς ρυθμίζονται από το NahR, έναν θετικό ρυθμιστή trans-δράσης τύπου LysR. Απαιτείται για την επαγωγή του γονιδίου nah από το σαλικυλικό οξύ και την επακόλουθη υψηλού επιπέδου έκφρασή του (Yen and Gunsalus, 1982). Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι ο ολοκληρωτικός παράγοντας ξενιστή (IHF) και ο XylR (εξαρτώμενος από το sigma 54 ρυθμιστής μεταγραφής) είναι επίσης κρίσιμοι για την μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων στον μεταβολισμό του ναφθαλινίου (Ramos et al., 1997). Μελέτες έχουν δείξει ότι τα ένζυμα της οδού ανοίγματος του μετα-δακτυλίου της κατεχόλης, δηλαδή η κατεχόλη 2,3-διοξυγενάση, επάγονται παρουσία ναφθαλινίου ή/και σαλικυλικού οξέος (Basu et al., 2006). Μελέτες έχουν δείξει ότι τα ένζυμα της οδού ανοίγματος του ορθο-δακτυλίου της κατεχόλης, δηλαδή η κατεχόλη 1,2-διοξυγενάση, επάγονται παρουσία βενζοϊκού οξέος και cis,cis-μουκονικού οξέος (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Στο στέλεχος C5pp, πέντε γονίδια, τα mcbG, mcbH, mcbN, mcbR και mcbS, κωδικοποιούν ρυθμιστές που ανήκουν στην οικογένεια ρυθμιστών μεταγραφής LysR/TetR που είναι υπεύθυνοι για τον έλεγχο της αποικοδόμησης των καρβαρυλίων. Το ομόλογο γονίδιο mcbG βρέθηκε να σχετίζεται στενότερα με τον ρυθμιστή τύπου LysR PhnS (58% ταυτότητα αμινοξέων) που εμπλέκεται στον μεταβολισμό του φαινανθρενίου στο Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Το γονίδιο mcbH βρέθηκε να εμπλέκεται στην ενδιάμεση οδό (μετατροπή σαλικυλικού οξέος σε γεντισικό οξύ) και ανήκει στον ρυθμιστή μεταγραφής τύπου LysR NagR/DntR/NahR στα Pseudomonas και Burkholderia. Μέλη αυτής της οικογένειας έχουν αναφερθεί ότι αναγνωρίζουν το σαλικυλικό οξύ ως ειδικό μόριο-τελεστή για την επαγωγή γονιδίων αποικοδόμησης. Από την άλλη πλευρά, τρία γονίδια, mcbN, mcbR και mcbS, που ανήκουν σε ρυθμιστές μεταγραφής τύπου LysR και TetR, ταυτοποιήθηκαν στην κατάντη οδό (μεταβολίτες της κεντρικής οδού άνθρακα-gentisate).
Στους προκαρυώτες, οι οριζόντιες διαδικασίες μεταφοράς γονιδίων (απόκτηση, ανταλλαγή ή μεταφορά) μέσω πλασμιδίων, τρανσποζονίων, προφάγων, γονιδιωματικών νησίδων και ολοκληρωτικών συζευκτικών στοιχείων (ICE) αποτελούν κύριες αιτίες πλαστικότητας στα βακτηριακά γονιδιώματα, οδηγώντας στην απόκτηση ή απώλεια συγκεκριμένων λειτουργιών/χαρακτηριστικών. Επιτρέπει στα βακτήρια να προσαρμόζονται γρήγορα σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες, παρέχοντας πιθανά προσαρμοστικά μεταβολικά πλεονεκτήματα στον ξενιστή, όπως η αποικοδόμηση αρωματικών ενώσεων. Οι μεταβολικές αλλαγές επιτυγχάνονται συχνά μέσω της λεπτής ρύθμισης των οπερονίων αποικοδόμησης, των ρυθμιστικών μηχανισμών τους και των ενζυμικών εξειδικεύσεων, γεγονός που διευκολύνει την αποικοδόμηση ενός ευρύτερου φάσματος αρωματικών ενώσεων (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Οι γονιδιακές κασέτες για την αποικοδόμηση του ναφθαλινίου έχουν βρεθεί να βρίσκονται σε μια ποικιλία κινητών στοιχείων όπως πλασμίδια (συζευκτικά και μη συζευκτικά), τρανσποζόνια, γονιδιώματα, ICE και συνδυασμούς διαφορετικών βακτηριακών ειδών (Σχήμα 5). Στο Pseudomonas G7, τα οπερόνια nah και sal του πλασμιδίου NAH7 μεταγράφονται με τον ίδιο προσανατολισμό και αποτελούν μέρος ενός ελαττωματικού τρανσποζονίου που απαιτεί την τρανσποζάση Tn4653 για κινητοποίηση (Sota et al., 2006). Στο στέλεχος Pseudomonas NCIB9816-4, το γονίδιο βρέθηκε στο συζευκτικό πλασμίδιο pDTG1 ως δύο οπερόνια (περίπου 15 kb μεταξύ τους) που μεταγράφηκαν σε αντίθετες κατευθύνσεις (Dennis and Zylstra, 2004). Στο στέλεχος Pseudomonas putida AK5, το μη συζευκτικό πλασμίδιο pAK5 κωδικοποιεί το ένζυμο που είναι υπεύθυνο για την αποικοδόμηση ναφθαλινίου μέσω της οδού gentisate (Izmalkova et al., 2013). Στο στέλεχος Pseudomonas PMD-1, το οπερόνιο nah βρίσκεται στο χρωμόσωμα, ενώ το οπερόνιο sal βρίσκεται στο συζευκτικό πλασμίδιο pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Ωστόσο, στο Pseudomonas stutzeri AN10, όλα τα γονίδια αποικοδόμησης ναφθαλινίου (οπερόνια nah και sal) βρίσκονται στο χρωμόσωμα και πιθανώς στρατολογούνται μέσω μετατόπισης, ανασυνδυασμού και αναδιάταξης (Bosch et al., 2000). Στο Pseudomonas sp. CSV86, τα οπερόνια nah και sal βρίσκονται στο γονιδίωμα με τη μορφή ICE (ICECSV86). Η δομή προστατεύεται από tRNAGly ακολουθούμενη από άμεσες επαναλήψεις που υποδεικνύουν θέσεις ανασυνδυασμού/προσκόλλησης (attR και attL) και μια ιντεγκράση τύπου φάγου που βρίσκεται και στα δύο άκρα του tRNAGly, επομένως δομικά παρόμοια με το στοιχείο ICEclc (ICEclcB13 στο Pseudomonas knackmusii για αποικοδόμηση χλωροκατεχόλης). Έχει αναφερθεί ότι τα γονίδια στο ICE μπορούν να μεταφερθούν μέσω σύζευξης με εξαιρετικά χαμηλή συχνότητα μεταφοράς (10-8), μεταφέροντας έτσι ιδιότητες αποικοδόμησης στον δέκτη (Basu and Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Τα περισσότερα από τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για την αποικοδόμηση του καρβαρυλίου βρίσκονται σε πλασμίδια. Το Arthrobacter sp. RC100 περιέχει τρία πλασμίδια (pRC1, pRC2 και pRC300) εκ των οποίων δύο συζευκτικά πλασμίδια, το pRC1 και το pRC2, κωδικοποιούν τα ένζυμα που μετατρέπουν το καρβαρύλιο σε γεντισάτη. Από την άλλη πλευρά, τα ένζυμα που εμπλέκονται στη μετατροπή του γεντισάτη στους κεντρικούς μεταβολίτες άνθρακα βρίσκονται στο χρωμόσωμα (Hayaatsu et al., 1999). Βακτήρια του γένους Rhizobium. Το στέλεχος AC100, που χρησιμοποιείται για τη μετατροπή του καρβαρυλίου σε 1-ναφθόλη, περιέχει το πλασμίδιο pAC200, το οποίο φέρει το γονίδιο cehA που κωδικοποιεί το CH ως μέρος του τρανσποζονίου Tnceh που περιβάλλεται από αλληλουχίες που μοιάζουν με στοιχεία εισαγωγής (istA και istB) (Hashimoto et al., 2002). Στο στέλεχος Sphingomonas CF06, το γονίδιο αποικοδόμησης καρβαρυλίου πιστεύεται ότι υπάρχει σε πέντε πλασμίδια: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 και pCF05. Η ομολογία DNA αυτών των πλασμιδίων είναι υψηλή, υποδεικνύοντας την ύπαρξη ενός συμβάντος διπλασιασμού γονιδίων (Feng et al., 1997). Σε ένα συμβιωτικό υλικό που αποικοδομεί καρβαρύλιο και αποτελείται από δύο είδη Pseudomonas, το στέλεχος 50581 περιέχει ένα συζευκτικό πλασμίδιο pCD1 (50 kb) που κωδικοποιεί το γονίδιο της καρβαρυλικής υδρολάσης mcd, ενώ το συζευκτικό πλασμίδιο στο στέλεχος 50552 κωδικοποιεί ένα ένζυμο που αποικοδομεί την 1-ναφθόλη (Chapalamadugu και Chaudhry, 1991). Στο στέλεχος Achromobacter WM111, το γονίδιο της υδρολάσης mcd furadan βρίσκεται σε ένα πλασμίδιο 100 kb (pPDL11). Αυτό το γονίδιο έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει σε διαφορετικά πλασμίδια (100, 105, 115 ή 124 kb) σε διαφορετικά βακτήρια από διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές (Parekh et al., 1995). Στο Pseudomonas sp. C5pp, όλα τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για την αποικοδόμηση καρβαρυλίου βρίσκονται σε ένα γονιδίωμα που εκτείνεται σε 76,3 kb αλληλουχίας (Trivedi et al., 2016). Η ανάλυση γονιδιώματος (6,15 Mb) αποκάλυψε την παρουσία 42 MGE και 36 GEI, εκ των οποίων 17 MGE εντοπίστηκαν στην υπερσυνέχεια Α (76,3 kb) με μέση ασύμμετρη περιεκτικότητα σε G+C (54–60 mol%), υποδηλώνοντας πιθανά συμβάντα οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων (Trivedi et al., 2016). Το P. putida XWY-1 παρουσιάζει παρόμοια διάταξη γονιδίων που αποικοδομούν καρβαρύλιο, αλλά αυτά τα γονίδια βρίσκονται σε ένα πλασμίδιο (Zhu et al., 2019).
Εκτός από την μεταβολική αποτελεσματικότητα σε βιοχημικό και γονιδιωματικό επίπεδο, οι μικροοργανισμοί εμφανίζουν επίσης άλλες ιδιότητες ή αποκρίσεις όπως χημειοταξία, ιδιότητες τροποποίησης της κυτταρικής επιφάνειας, διαμερισματοποίηση, προτιμησιακή αξιοποίηση, παραγωγή βιοεπιφανειοδραστικών ουσιών κ.λπ., οι οποίες τους βοηθούν να μεταβολίζουν πιο αποτελεσματικά τους αρωματικούς ρύπους σε μολυσμένα περιβάλλοντα (Σχήμα 7).
Σχήμα 7. Διαφορετικές στρατηγικές κυτταρικής απόκρισης ιδανικών βακτηρίων που αποικοδομούν αρωματικούς υδρογονάνθρακες για την αποτελεσματική βιοαποικοδόμηση ξένων ρυπογόνων ενώσεων.
Οι χημειοτακτικές αποκρίσεις θεωρούνται παράγοντες που ενισχύουν την αποικοδόμηση οργανικών ρύπων σε ετερογενώς μολυσμένα οικοσυστήματα. (2002) κατέδειξαν ότι η χημειοταξία του Pseudomonas sp. G7 σε ναφθαλίνιο αύξησε τον ρυθμό αποικοδόμησης του ναφθαλινίου στα υδάτινα συστήματα. Το άγριου τύπου στέλεχος G7 αποικοδόμηση του ναφθαλινίου πολύ πιο γρήγορα από ένα μεταλλαγμένο στέλεχος με έλλειψη χημειοταξίας. Η πρωτεΐνη NahY (538 αμινοξέα με τοπολογία μεμβράνης) βρέθηκε να συν-μεταγράφεται με τα γονίδια της οδού μεταδιάσπασης στο πλασμίδιο NAH7, και όπως οι μορφοτροπείς χημειοταξίας, αυτή η πρωτεΐνη φαίνεται να λειτουργεί ως χημειοϋποδοχέας για την αποικοδόμηση του ναφθαλινίου (Grimm και Harwood 1997). Μια άλλη μελέτη των Hansel et al. (2009) έδειξε ότι η πρωτεΐνη είναι χημειοτακτική, αλλά ο ρυθμός αποικοδόμησης της είναι υψηλός. (2011) κατέδειξαν μια χημειοτακτική απόκριση της Pseudomonas (P. putida) στο αέριο ναφθαλίνιο, όπου η διάχυση σε αέρια φάση είχε ως αποτέλεσμα μια σταθερή ροή ναφθαλινίου προς τα κύτταρα, η οποία έλεγχε την χημειοτακτική απόκριση των κυττάρων. Οι ερευνητές εκμεταλλεύτηκαν αυτή τη χημειοτακτική συμπεριφορά για να κατασκευάσουν μικρόβια που θα ενίσχυαν τον ρυθμό αποικοδόμησης. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι χημειοαισθητηριακές οδοί ρυθμίζουν επίσης άλλες κυτταρικές λειτουργίες όπως η κυτταρική διαίρεση, η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και ο σχηματισμός βιοφίλμ, συμβάλλοντας έτσι στον έλεγχο του ρυθμού αποικοδόμησης. Ωστόσο, η αξιοποίηση αυτής της ιδιότητας (χημειοταξία) για αποτελεσματική αποικοδόμηση παρεμποδίζεται από διάφορα σημεία συμφόρησης. Τα κύρια εμπόδια είναι: (α) διαφορετικοί παράλογοι υποδοχείς αναγνωρίζουν τις ίδιες ενώσεις/συνδέτες· (β) η ύπαρξη εναλλακτικών υποδοχέων, δηλαδή ο ενεργειακός τροπισμός· (γ) σημαντικές διαφορές αλληλουχίας στους αισθητηριακούς τομείς της ίδιας οικογένειας υποδοχέων· και (δ) έλλειψη πληροφοριών σχετικά με τις κύριες βακτηριακές πρωτεΐνες αισθητήρων (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Μερικές φορές, η βιοαποικοδόμηση αρωματικών υδρογονανθράκων παράγει πολλαπλούς μεταβολίτες/ενδιάμεσα προϊόντα, τα οποία μπορεί να είναι χημειοτακτικά για μια ομάδα βακτηρίων αλλά απωθητικά για άλλες, περιπλέκοντας περαιτέρω τη διαδικασία. Για να προσδιορίσουμε τις αλληλεπιδράσεις των υποκαταστατών (αρωματικών υδρογονανθράκων) με χημικούς υποδοχείς, κατασκευάσαμε υβριδικές πρωτεΐνες αισθητήρων (PcaY, McfR και NahY) συντήκοντας τους τομείς αισθητήρων και σηματοδότησης των Pseudomonas putida και Escherichia coli, οι οποίοι στοχεύουν τους υποδοχείς για αρωματικά οξέα, ενδιάμεσα TCA και ναφθαλίνιο, αντίστοιχα (Luu et al., 2019).
Υπό την επίδραση του ναφθαλινίου και άλλων πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (PAH), η δομή της βακτηριακής μεμβράνης και η ακεραιότητα των μικροοργανισμών υφίστανται σημαντικές αλλαγές. Μελέτες έχουν δείξει ότι το ναφθαλίνιο παρεμβαίνει στην αλληλεπίδραση της ακυλικής αλυσίδας μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, αυξάνοντας έτσι τη διόγκωση και τη ρευστότητα της μεμβράνης (Sikkema et al., 1995). Για να αντισταθμίσουν αυτό το αρνητικό αποτέλεσμα, τα βακτήρια ρυθμίζουν τη ρευστότητα της μεμβράνης αλλάζοντας την αναλογία και τη σύνθεση λιπαρών οξέων μεταξύ ισο/αντισο διακλαδισμένης αλυσίδας λιπαρών οξέων και ισομερίζοντας τα cis-ακόρεστα λιπαρά οξέα στα αντίστοιχα trans-ισομερή (Heipieper and de Bont, 1994). Στο Pseudomonas stutzeri που αναπτύχθηκε με επεξεργασία ναφθαλινίου, η αναλογία κορεσμένων προς ακόρεστα λιπαρά οξέα αυξήθηκε από 1,1 σε 2,1, ενώ στο Pseudomonas JS150 αυτή η αναλογία αυξήθηκε από 7,5 σε 12,0 (Mrozik et al., 2004). Όταν αναπτύχθηκαν σε ναφθαλίνη, τα κύτταρα Achromobacter KAs 3-5 εμφάνισαν συσσωμάτωση κυττάρων γύρω από κρυστάλλους ναφθαλίνης και μείωση στο φορτίο της κυτταρικής επιφάνειας (από -22,5 σε -2,5 mV) συνοδευόμενη από κυτταροπλασματική συμπύκνωση και κενοτοπίωση, υποδεικνύοντας αλλαγές στη δομή των κυττάρων και στις ιδιότητες της κυτταρικής επιφάνειας (Mohapatra et al., 2019). Αν και οι κυτταρικές/επιφανειακές αλλαγές σχετίζονται άμεσα με την καλύτερη πρόσληψη αρωματικών ρύπων, οι σχετικές στρατηγικές βιοϊατρικής δεν έχουν βελτιστοποιηθεί πλήρως. Η χειραγώγηση του σχήματος των κυττάρων σπάνια έχει χρησιμοποιηθεί για τη βελτιστοποίηση των βιολογικών διεργασιών (Volke and Nikel, 2018). Η διαγραφή γονιδίων που επηρεάζουν την κυτταρική διαίρεση προκαλεί αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων. Η διαγραφή γονιδίων που επηρεάζουν την κυτταρική διαίρεση προκαλεί αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων. Στο Bacillus subtilis, η πρωτεΐνη SepF του κυτταρικού διαφράγματος έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στο σχηματισμό του διαφράγματος και απαιτείται για τα επόμενα βήματα της κυτταρικής διαίρεσης, αλλά δεν είναι απαραίτητο γονίδιο. Η διαγραφή γονιδίων που κωδικοποιούν υδρολάσες πεπτιδικής γλυκάνης στο Bacillus subtilis είχε ως αποτέλεσμα την επιμήκυνση των κυττάρων, την αύξηση του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης και τη βελτίωση της ικανότητας παραγωγής ενζύμων (Cui et al., 2018).
Έχει προταθεί η διαμερισματοποίηση της οδού αποικοδόμησης καρβαρυλίου για την επίτευξη αποτελεσματικής αποικοδόμησης των στελεχών Pseudomonas C5pp και C7 (Kamini et al., 2018). Προτείνεται ότι το καρβαρύλιο μεταφέρεται στον περιπλασματικό χώρο μέσω του διαφράγματος της εξωτερικής μεμβράνης ή/και μέσω διαχυόμενων πορινών. Το CH είναι ένα περιπλασματικό ένζυμο που καταλύει την υδρόλυση του καρβαρυλίου σε 1-ναφθόλη, η οποία είναι πιο σταθερή, πιο υδρόφοβη και πιο τοξική. Το CH εντοπίζεται στο περίπλασμα και έχει χαμηλή συγγένεια για το καρβαρύλιο, ελέγχοντας έτσι τον σχηματισμό της 1-ναφθόλης, αποτρέποντας έτσι τη συσσώρευσή της στα κύτταρα και μειώνοντας την τοξικότητά της στα κύτταρα (Kamini et al., 2018). Η προκύπτουσα 1-ναφθόλη μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα διαμέσου της εσωτερικής μεμβράνης με διαχωρισμό ή/και διάχυση και στη συνέχεια υδροξυλιώνεται σε 1,2-διυδροξυναφθαλίνιο από το ένζυμο υψηλής συγγένειας 1NH για περαιτέρω μεταβολισμό στην κεντρική οδό άνθρακα.
Παρόλο που οι μικροοργανισμοί έχουν τις γενετικές και μεταβολικές ικανότητες να αποικοδομούν ξενοβιοτικές πηγές άνθρακα, η ιεραρχική δομή της αξιοποίησής τους (δηλαδή, η προτιμησιακή χρήση απλών έναντι σύνθετων πηγών άνθρακα) αποτελεί σημαντικό εμπόδιο στη βιοαποικοδόμηση. Η παρουσία και η αξιοποίηση απλών πηγών άνθρακα υπορυθμίζει τα γονίδια που κωδικοποιούν ένζυμα που αποικοδομούν σύνθετες/μη προτιμώμενες πηγές άνθρακα, όπως οι ΠΑΥ. Ένα καλά μελετημένο παράδειγμα είναι ότι όταν η γλυκόζη και η λακτόζη τροφοδοτούνται ταυτόχρονα στο Escherichia coli, η γλυκόζη χρησιμοποιείται πιο αποτελεσματικά από τη λακτόζη (Jacob and Monod, 1965). Έχει αναφερθεί ότι η Pseudomonas αποικοδομεί μια ποικιλία ΠΑΥ και ξενοβιοτικών ενώσεων ως πηγές άνθρακα. Η ιεραρχία της αξιοποίησης πηγών άνθρακα στην Pseudomonas είναι οργανικά οξέα > γλυκόζη > αρωματικές ενώσεις (Hylemon and Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Ωστόσο, υπάρχει μια εξαίρεση. Είναι ενδιαφέρον ότι το Pseudomonas sp. Το CSV86 παρουσιάζει μια μοναδική ιεραρχική δομή που χρησιμοποιεί κατά προτίμηση αρωματικούς υδρογονάνθρακες (βενζοϊκό οξύ, ναφθαλίνιο, κ.λπ.) αντί για γλυκόζη και συν-μεταβολίζει αρωματικούς υδρογονάνθρακες με οργανικά οξέα (Basu et al., 2006). Σε αυτό το βακτήριο, τα γονίδια για την αποικοδόμηση και τη μεταφορά αρωματικών υδρογονανθράκων δεν υπορυθμίζονται ακόμη και παρουσία μιας δεύτερης πηγής άνθρακα όπως η γλυκόζη ή τα οργανικά οξέα. Όταν αναπτύχθηκε σε μέσο γλυκόζης και αρωματικών υδρογονανθράκων, παρατηρήθηκε ότι τα γονίδια για τη μεταφορά και τον μεταβολισμό της γλυκόζης υπορυθμίστηκαν, οι αρωματικοί υδρογονάνθρακες χρησιμοποιήθηκαν στην πρώτη λογαριθμική φάση και η γλυκόζη χρησιμοποιήθηκε στη δεύτερη λογαριθμική φάση (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Από την άλλη πλευρά, η παρουσία οργανικών οξέων δεν επηρέασε την έκφραση του μεταβολισμού των αρωματικών υδρογονανθράκων, επομένως αυτό το βακτήριο αναμένεται να είναι υποψήφιο στέλεχος για μελέτες βιοαποικοδόμησης (Phale et al., 2020).
Είναι γνωστό ότι ο βιομετασχηματισμός υδρογονανθράκων μπορεί να προκαλέσει οξειδωτικό στρες και ανοδική ρύθμιση των αντιοξειδωτικών ενζύμων σε μικροοργανισμούς. Η αναποτελεσματική βιοαποικοδόμηση του ναφθαλινίου τόσο σε κύτταρα στατικής φάσης όσο και παρουσία τοξικών ενώσεων οδηγεί στο σχηματισμό δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) (Kang et al. 2006). Δεδομένου ότι τα ένζυμα που αποικοδομούν το ναφθαλίνιο περιέχουν συστάδες σιδήρου-θείου, υπό οξειδωτικό στρες, ο σίδηρος στις πρωτεΐνες της αίμης και του σιδήρου-θείου θα οξειδωθεί, οδηγώντας σε απενεργοποίηση πρωτεϊνών. Η φερρεδοξίνη-NADP+ αναγωγάση (Fpr), μαζί με την υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), μεσολαβεί στην αναστρέψιμη οξειδοαναγωγική αντίδραση μεταξύ NADP+/NADPH και δύο μορίων φερρεδοξίνης ή φλαβοδοξίνης, δεσμεύοντας έτσι τα ROS και αποκαθιστώντας το κέντρο σιδήρου-θείου υπό οξειδωτικό στρες (Li et al. 2006). Έχει αναφερθεί ότι τόσο η Fpr όσο και η SodA (SOD) στην Pseudomonas μπορούν να προκληθούν από οξειδωτικό στρες, και παρατηρήθηκαν αυξημένες δραστηριότητες SOD και καταλάσης σε τέσσερα στελέχη Pseudomonas (O1, W1, As1 και G1) κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης υπό συνθήκες προσθήκης ναφθαλινίου (Kang et al., 2006). Μελέτες έχουν δείξει ότι η προσθήκη αντιοξειδωτικών όπως το ασκορβικό οξύ ή ο σιδηρούχος σίδηρος (Fe2+) μπορεί να αυξήσει τον ρυθμό ανάπτυξης της ναφθαλίνης. Όταν το Rhodococcus erythropolis αναπτύχθηκε σε μέσο ναφθαλινίου, η μεταγραφή των γονιδίων του κυτοχρώματος P450 που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες, συμπεριλαμβανομένων των sodA (υπεροξειδική δισμουτάση Fe/Mn), sodC (υπεροξειδική δισμουτάση Cu/Zn) και recA, αυξήθηκε (Sazykin et al., 2019). Η συγκριτική ποσοτική πρωτεωμική ανάλυση κυττάρων Pseudomonas που καλλιεργήθηκαν σε ναφθαλίνη έδειξε ότι η ανοδική ρύθμιση διαφόρων πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόκριση στο οξειδωτικό στρες είναι μια στρατηγική αντιμετώπισης του στρες (Herbst et al., 2013).
Έχει αναφερθεί ότι οι μικροοργανισμοί παράγουν βιοεπιφανειοδραστικές ουσίες υπό τη δράση υδρόφοβων πηγών άνθρακα. Αυτές οι επιφανειοδραστικές ουσίες είναι αμφίφιλες επιφανειοδραστικές ενώσεις που μπορούν να σχηματίσουν συσσωματώματα σε διεπιφάνειες λαδιού-νερού ή αέρα-νερού. Αυτό προάγει την ψευδοδιαλυτοποίηση και διευκολύνει την προσρόφηση αρωματικών υδρογονανθράκων, με αποτέλεσμα την αποτελεσματική βιοαποικοδόμηση (Rahman et al., 2002). Λόγω αυτών των ιδιοτήτων, οι βιοεπιφανειοδραστικές ουσίες χρησιμοποιούνται ευρέως σε διάφορες βιομηχανίες. Η προσθήκη χημικών επιφανειοδραστικών ουσιών ή βιοεπιφανειοδραστικών ουσιών σε βακτηριακές καλλιέργειες μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα και τον ρυθμό αποικοδόμησης των υδρογονανθράκων. Μεταξύ των βιοεπιφανειοδραστικών, τα ραμνολιπίδια που παράγονται από το Pseudomonas aeruginosa έχουν μελετηθεί και χαρακτηριστεί εκτενώς (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Επιπλέον, άλλοι τύποι βιοεπιφανειοδραστικών περιλαμβάνουν λιποπεπτίδια (βλεννίνες από Pseudomonas fluorescens), γαλακτωματοποιητή 378 (από Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg και Ron, 1999), λιπίδια δισακχαρίτη τρεχαλόζης από Rhodococcus (Ramdahl, 1985), λειχενίνη από Bacillus (Saraswathy και Hallberg, 2002) και επιφανειοδραστική ουσία από Bacillus subtilis (Siegmund και Wagner, 1991) και Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Αυτά τα ισχυρά επιφανειοδραστικά έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν την επιφανειακή τάση από 72 dynes/cm σε λιγότερο από 30 dynes/cm, επιτρέποντας καλύτερη απορρόφηση υδρογονανθράκων. Έχει αναφερθεί ότι τα Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia και άλλα βακτηριακά είδη μπορούν να παράγουν διάφορες βιοεπιφανειοδραστικές ουσίες με βάση τα ραμνολιπίδια και τα γλυκολιπίδια όταν καλλιεργούνται σε μέσα ναφθαλίνης και μεθυλοναφθαλίνης (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Το Pseudomonas maltophilia CSV89 μπορεί να παράγει εξωκυτταρικό βιοεπιφανειοδραστικό Biosur-Pm όταν καλλιεργείται σε αρωματικές ενώσεις όπως το ναφθοϊκό οξύ (Phale et al., 1995). Η κινητική του σχηματισμού Biosur-Pm έδειξε ότι η σύνθεσή του είναι μια διαδικασία που εξαρτάται από την ανάπτυξη και το pH. Διαπιστώθηκε ότι η ποσότητα Biosur-Pm που παράγεται από τα κύτταρα σε ουδέτερο pH ήταν υψηλότερη από αυτή σε pH 8,5. Τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε pH 8,5 ήταν πιο υδρόφοβα και είχαν υψηλότερη συγγένεια για αρωματικές και αλειφατικές ενώσεις από τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε pH 7,0. Στο Rhodococcus spp. Το N6, η υψηλότερη αναλογία άνθρακα προς άζωτο (C:N) και ο περιορισμός του σιδήρου αποτελούν βέλτιστες συνθήκες για την παραγωγή εξωκυτταρικών βιοεπιφανειοδραστικών ουσιών (Mutalik et al., 2008). Έχουν γίνει προσπάθειες βελτίωσης της βιοσύνθεσης βιοεπιφανειοδραστικών ουσιών (επιφανειοδραστικών ουσιών) βελτιστοποιώντας τα στελέχη και τη ζύμωση. Ωστόσο, ο τίτλος του επιφανειοδραστικού στο μέσο καλλιέργειας είναι χαμηλός (1,0 g/L), γεγονός που αποτελεί πρόκληση για την παραγωγή μεγάλης κλίμακας (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Ως εκ τούτου, έχουν χρησιμοποιηθεί μέθοδοι γενετικής μηχανικής για τη βελτίωση της βιοσύνθεσής του. Ωστόσο, η μηχανική του τροποποίηση είναι δύσκολη λόγω του μεγάλου μεγέθους του οπερονίου (∼25 kb) και της πολύπλοκης βιοσυνθετικής ρύθμισης του συστήματος ανίχνευσης απαρτίας (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Έχει πραγματοποιηθεί μια σειρά από τροποποιήσεις γενετικής μηχανικής σε βακτήρια Bacillus, με κύριο στόχο την αύξηση της παραγωγής σουρφακτίνης αντικαθιστώντας τον υποκινητή (οπερόνιο srfA), υπερεκφράζοντας την πρωτεΐνη εξαγωγής σουρφακτίνης YerP και τους ρυθμιστικούς παράγοντες ComX και PhrC (Jiao et al., 2017). Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι γενετικής μηχανικής έχουν επιτύχει μόνο μία ή λίγες γενετικές τροποποιήσεις και δεν έχουν ακόμη φτάσει σε εμπορική παραγωγή. Επομένως, είναι απαραίτητη περαιτέρω μελέτη των μεθόδων βελτιστοποίησης που βασίζονται στη γνώση.
Οι μελέτες βιοαποικοδόμησης ΠΑΥ διεξάγονται κυρίως υπό τυπικές εργαστηριακές συνθήκες. Ωστόσο, σε μολυσμένες τοποθεσίες ή σε μολυσμένα περιβάλλοντα, έχει αποδειχθεί ότι πολλοί αβιοτικοί και βιοτικοί παράγοντες (θερμοκρασία, pH, οξυγόνο, διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών, βιοδιαθεσιμότητα υποστρώματος, άλλα ξενοβιοτικά, αναστολή τελικού προϊόντος κ.λπ.) μεταβάλλουν και επηρεάζουν την ικανότητα αποικοδόμησης των μικροοργανισμών.
Η θερμοκρασία έχει σημαντική επίδραση στη βιοαποικοδόμηση των ΠΑΥ. Καθώς αυξάνεται η θερμοκρασία, η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου μειώνεται, γεγονός που επηρεάζει τον μεταβολισμό των αερόβιων μικροοργανισμών, καθώς απαιτούν μοριακό οξυγόνο ως ένα από τα υποστρώματα για τις οξυγενάσες που πραγματοποιούν αντιδράσεις υδροξυλίωσης ή διάσπασης δακτυλίου. Συχνά παρατηρείται ότι η αυξημένη θερμοκρασία μετατρέπει τους αρχικούς ΠΑΥ σε πιο τοξικές ενώσεις, αναστέλλοντας έτσι τη βιοαποικοδόμηση (Muller et al., 1998).
Έχει παρατηρηθεί ότι πολλές περιοχές μολυσμένες με ΠΑΥ έχουν ακραίες τιμές pH, όπως οι περιοχές μολυσμένες με όξινη αποστράγγιση ορυχείων (pH 1-4) και οι περιοχές αεριοποίησης φυσικού αερίου/άνθρακα μολυσμένες με αλκαλικά στραγγίσματα (pH 8-12). Αυτές οι συνθήκες μπορούν να επηρεάσουν σοβαρά τη διαδικασία βιοαποικοδόμησης. Επομένως, πριν από τη χρήση μικροοργανισμών για βιοαποκατάσταση, συνιστάται η ρύθμιση του pH με την προσθήκη κατάλληλων χημικών ουσιών (με μέτριο έως πολύ χαμηλό δυναμικό οξείδωσης-αναγωγής) όπως θειικό αμμώνιο ή νιτρικό αμμώνιο για αλκαλικά εδάφη ή ασβέστιο με ανθρακικό ασβέστιο ή ανθρακικό μαγνήσιο για όξινες περιοχές (Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020).
Η παροχή οξυγόνου στην πληγείσα περιοχή είναι ο παράγοντας που περιορίζει τον ρυθμό βιοαποικοδόμησης των ΠΑΥ. Λόγω των οξειδοαναγωγικών συνθηκών του περιβάλλοντος, οι διαδικασίες βιοαποκατάστασης in situ συνήθως απαιτούν την εισαγωγή οξυγόνου από εξωτερικές πηγές (όργωμα, ψεκασμός με αέρα και προσθήκη χημικών) (Pardieck et al., 1992). Οι Odenkranz et al. (1996) απέδειξαν ότι η προσθήκη υπεροξειδίου του μαγνησίου (μιας ένωσης που απελευθερώνει οξυγόνο) σε έναν μολυσμένο υδροφορέα θα μπορούσε να βιοαποκαταστήσει αποτελεσματικά τις ενώσεις BTEX. Μια άλλη μελέτη διερεύνησε την in situ αποικοδόμηση φαινόλης και BTEX σε έναν μολυσμένο υδροφορέα με την έγχυση νιτρικού νατρίου και την κατασκευή φρεατίων εξαγωγής για την επίτευξη αποτελεσματικής βιοαποκατάστασης (Bewley and Webb, 2001).