Παρόν *Τρέχουσα διεύθυνση: Κολωνία 50931, Γερμανία, Κολωνία, Έρευνα για την Κυτταρική Απόκριση στο Στρες σε Ασθένειες που Σχετίζονται με τη Γήρανση (CECAD).
Η νευροεκφύλιση των μιτοχονδριακών νοσημάτων θεωρείται μη αναστρέψιμη επειδή η μεταβολική πλαστικότητα των νευρώνων είναι περιορισμένη, αλλά η επίδραση της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας στην αυτονομία του νευρωνικού μεταβολισμού των κυττάρων στο σώμα δεν είναι πλήρως κατανοητή. Εδώ, παρουσιάζουμε το κυτταρικό πρωτέωμα των νευρώνων Purkinje με προοδευτική ανεπάρκεια OXPHOS που προκαλείται από διαταραγμένη δυναμική σύντηξης μιτοχονδρίων. Διαπιστώσαμε ότι η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία πυροδότησε μια βαθιά αλλαγή στον τομέα της πρωτεωμικής, η οποία τελικά οδήγησε στην διαδοχική ενεργοποίηση ακριβών μεταβολικών προγραμμάτων πριν από τον κυτταρικό θάνατο. Απροσδόκητα, προσδιορίσαμε την προφανή επαγωγή της πυροσταφυλικής καρβοξυλάσης (PCx) και άλλων αντιγηραντικών ενζύμων που συμπληρώνουν τα ενδιάμεσα του κύκλου TCA. Η αναστολή της PCx επιδείνωσε το οξειδωτικό στρες και την νευροεκφύλιση, υποδεικνύοντας ότι η αθηροσκλήρωση έχει προστατευτική επίδραση σε νευρώνες που δεν έχουν OXPHOS. Η αποκατάσταση της μιτοχονδριακής σύντηξης σε τελικά εκφυλισμένους νευρώνες αντιστρέφει πλήρως αυτά τα μεταβολικά χαρακτηριστικά, αποτρέποντας έτσι τον κυτταρικό θάνατο. Τα ευρήματά μας εντοπίζουν προηγουμένως άγνωστες οδούς που προσδίδουν ανθεκτικότητα στη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και δείχνουν ότι η νευροεκφύλιση μπορεί να αντιστραφεί ακόμη και στα τελευταία στάδια της νόσου.
Ο κεντρικός ρόλος των μιτοχονδρίων στη διατήρηση του μεταβολισμού της ενέργειας των νευρώνων τονίζεται από τα εκτεταμένα νευρολογικά συμπτώματα που σχετίζονται με τις ανθρώπινες μιτοχονδριακές ασθένειες. Οι περισσότερες από αυτές τις ασθένειες προκαλούνται από γονιδιακές μεταλλάξεις που ρυθμίζουν την έκφραση των μιτοχονδριακών γονιδίων (1, 2) ή από καταστροφή γονιδίων που σχετίζεται με τη μιτοχονδριακή δυναμική, η οποία επηρεάζει έμμεσα τη σταθερότητα του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) (3, 4). Η εργασία σε ζωικά μοντέλα έχει δείξει ότι σε απόκριση στη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία στους περιβάλλοντες ιστούς, μπορούν να ενεργοποιηθούν συντηρητικές μεταβολικές οδοί (5-7), γεγονός που παρέχει σημαντικές πληροφορίες για την εις βάθος κατανόηση της παθογένεσης αυτών των σύνθετων ασθενειών. Σε έντονη αντίθεση, η κατανόησή μας για τις μεταβολικές αλλαγές συγκεκριμένων τύπων κυττάρων που προκαλούνται από τη γενική αποτυχία της παραγωγής τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) των μιτοχονδρίων του εγκεφάλου είναι θεμελιώδης (8), τονίζοντας την ανάγκη εντοπισμού θεραπευτικών στόχων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόληψη ή την πρόληψη ασθενειών. Πρόληψη νευροεκφυλισμού (9). Η έλλειψη πληροφοριών έγκειται στο γεγονός ότι τα νευρικά κύτταρα θεωρούνται ευρέως ότι έχουν πολύ περιορισμένη μεταβολική ευελιξία σε σύγκριση με τους κυτταρικούς τύπους των περιβαλλόντων ιστών (10). Δεδομένου ότι αυτά τα κύτταρα παίζουν κεντρικό ρόλο στον συντονισμό της παροχής μεταβολιτών στους νευρώνες για την προώθηση της συναπτικής μετάδοσης και την ανταπόκριση σε τραυματισμούς και ασθένειες, η ικανότητα προσαρμογής του κυτταρικού μεταβολισμού στις απαιτητικές συνθήκες του εγκεφαλικού ιστού περιορίζεται σχεδόν στα νευρογλοιακά κύτταρα (11-14). Επιπλέον, η εγγενής κυτταρική ετερογένεια του εγκεφαλικού ιστού εμποδίζει σε μεγάλο βαθμό τη μελέτη των μεταβολικών αλλαγών που συμβαίνουν σε συγκεκριμένες νευρωνικές υποομάδες. Ως αποτέλεσμα, λίγα είναι γνωστά για τις ακριβείς κυτταρικές και μεταβολικές συνέπειες της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας στους νευρώνες.
Προκειμένου να κατανοήσουμε τις μεταβολικές συνέπειες της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας, απομονώσαμε νευρώνες Purkinje (PNs) σε διαφορετικά στάδια νευροεκφυλισμού που προκαλούνται από την καταστροφή της σύντηξης της εξωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων (Mfn2). Αν και οι μεταλλάξεις Mfn2 στους ανθρώπους σχετίζονται με μια μορφή κληρονομικής κινητικής αισθητηριακής νευροπάθειας γνωστής ως Charcot-Marie-Tooth τύπου 2Α (15), η υπό όρους καταστροφή της Mfn2 σε ποντίκια είναι μια καλά αναγνωρισμένη μέθοδος δυσλειτουργίας επαγωγής οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (OXPHOS). Οι διάφοροι νευρωνικοί υποτύποι (16-19) και ο προκύπτων νευροεκφυλιστικός φαινότυπος συνοδεύονται από προοδευτικά νευρολογικά συμπτώματα, όπως κινητικές διαταραχές (18, 19) ή παρεγκεφαλιδική αταξία (16). Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό ποσοτικής πρωτεωμικής (LFQ) χωρίς ετικέτα, μεταβολομικής, απεικόνισης και ιολογικών μεθόδων, δείχνουμε ότι η προοδευτική νευροεκφυλισμός προκαλεί έντονα την πυροσταφυλική καρβοξυλάση (PCx) και άλλους παράγοντες που εμπλέκονται στην αρτηριοσκλήρυνση των PNs in vivo. Η έκφραση ενζύμων. Για να επαληθεύσουμε τη συνάφεια αυτού του ευρήματος, μειώσαμε συγκεκριμένα την έκφραση του PCx σε πνευμονοπάθειες με ανεπάρκεια Mfn2 και διαπιστώσαμε ότι αυτή η λειτουργία επιδείνωσε το οξειδωτικό στρες και επιτάχυνε τη νευροεκφύλιση, αποδεικνύοντας έτσι ότι η αζωοσπερμία προσδίδει κυτταρικό θάνατο. Μεταβολική προσαρμοστικότητα. Η σοβαρή έκφραση του MFN2 μπορεί να σώσει πλήρως την πνευμονοπάθεια τελικού εκφυλισμού με σοβαρή ανεπάρκεια OXPHOS, μαζική κατανάλωση μιτοχονδριακού DNA και προφανώς σπασμένο μιτοχονδριακό δίκτυο, γεγονός που υπογραμμίζει περαιτέρω ότι αυτή η μορφή νευροεκφύλισης μπορεί ακόμη και να ανακάμψει στο προχωρημένο στάδιο της νόσου πριν από τον κυτταρικό θάνατο.
Προκειμένου να απεικονίσουμε τα μιτοχόνδρια σε PNs με knockout Mfn2, χρησιμοποιήσαμε ένα στέλεχος ποντικού που επιτρέπει στα μιτοχόνδρια που εξαρτώνται από Cre να στοχεύουν την έκφραση Cre της κίτρινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (YFP) (mtYFP) (20) και ελέγξαμε τη μιτοχονδριακή μορφολογία in vivo. Διαπιστώσαμε ότι η καταστροφή του γονιδίου Mfn2 σε PNs θα οδηγούσε στη σταδιακή διαίρεση του μιτοχονδριακού δικτύου (Σχήμα S1A) και η πρώτη αλλαγή βρέθηκε στην ηλικία των 3 εβδομάδων. Αντίθετα, η σημαντική εκφύλιση του κυτταρικού στρώματος PN, όπως αποδεικνύεται από την απώλεια ανοσοχρώσης Calbindin, δεν ξεκίνησε μέχρι την ηλικία των 12 εβδομάδων (Σχήμα 1, Α και Β). Η χρονική αναντιστοιχία μεταξύ των πρώτων αλλαγών στη μιτοχονδριακή μορφολογία και της ορατής έναρξης του νευρωνικού θανάτου μας ώθησε να διερευνήσουμε τις μεταβολικές αλλαγές που προκαλούνται από τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία πριν από τον κυτταρικό θάνατο. Αναπτύξαμε μια στρατηγική βασισμένη στη φθορίζουσα ταξινόμηση κυττάρων που ενεργοποιούνται (FACS) για την απομόνωση των PN που εκφράζουν YFP (YFP+) (Σχήμα 1C) και σε ποντίκια ελέγχου (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), εφεξής αναφερόμενα ως CTRL (Σχήμα S1B). Η βελτιστοποίηση της στρατηγικής πύλης με βάση τη σχετική ένταση του σήματος YFP μας επιτρέπει να καθαρίσουμε το σώμα YFP+ (YFPhigh) των PN από μη-PN (YFPneg) (Σχήμα S1B) ή υποτιθέμενα φθορίζοντα θραύσματα αξόνων/δενδριτικών (YFPlow· Σχήμα S1D, αριστερά), επιβεβαιωμένα με ομοεστιακό μικροσκόπιο (Σχήμα S1D, δεξιά). Προκειμένου να επαληθεύσουμε την ταυτότητα του ταξινομημένου πληθυσμού, πραγματοποιήσαμε πρωτεωμική LFQ και στη συνέχεια ανάλυση κύριων συστατικών και διαπιστώσαμε ότι υπάρχει σαφής διαχωρισμός μεταξύ των κυττάρων YFPhigh και YFPneg (Σχήμα S1C). Τα κύτταρα YFPhigh έδειξαν καθαρό εμπλουτισμό γνωστών δεικτών PNs (δηλαδή Calb1, Pcp2, Grid2 και Itpr3) (21, 22), αλλά όχι εμπλουτισμό πρωτεϊνών που εκφράζονται συνήθως σε νευρώνες ή άλλους κυτταρικούς τύπους (Σχήμα 1D). Μια σύγκριση μεταξύ δειγμάτων σε ταξινομημένα κύτταρα YFPhigh που συλλέχθηκαν σε ανεξάρτητα πειράματα έδειξε συντελεστή συσχέτισης > 0,9, καταδεικνύοντας καλή αναπαραγωγιμότητα μεταξύ βιολογικών αντιγράφων (Σχήμα S1E). Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα επικύρωσαν το σχέδιό μας για οξεία και ειδική απομόνωση εφικτών PN. Επειδή το σύστημα οδηγού L7-cre που χρησιμοποιήθηκε προκαλεί μωσαϊκό ανασυνδυασμό την πρώτη εβδομάδα μετά τον τοκετό (23), ξεκινήσαμε την απομάκρυνση ποντικών από τους νευρώνες CTRL και τη συλλογή υπό όρους (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Μετά την ολοκλήρωση του ανασυνδυασμού, ονομάζεται Mfn2cKO σε ηλικία 4 εβδομάδων. Ως τελικό σημείο, επιλέξαμε ηλικία 8 εβδομάδων όταν το στρώμα PN ήταν άθικτο παρά τον εμφανή μιτοχονδριακό κατακερματισμό (Σχήμα 1Β και Σχήμα S1A). Συνολικά, ποσοτικοποιήσαμε συνολικά 3013 πρωτεΐνες, εκ των οποίων περίπου το 22% βασίστηκε σε σχολιασμούς MitoCarta 2.0 με βάση το μιτοχονδριακό πρωτέωμα ως μιτοχόνδρια (Σχήμα 1Ε) (Σχήμα 1Ε) (24). Η ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης που πραγματοποιήθηκε την εβδομάδα 8 έδειξε ότι μόνο το 10,5% όλων των πρωτεϊνών είχε σημαντικές αλλαγές (Σχήμα 1F και Σχήμα S1F), εκ των οποίων 195 πρωτεΐνες είχαν υπορύθμιση και 120 πρωτεΐνες είχαν ανοδική ρύθμιση (Σχήμα 1F). Αξίζει να σημειωθεί ότι η «ανάλυση καινοτόμων οδών» αυτού του συνόλου δεδομένων δείχνει ότι τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια ανήκουν κυρίως σε ένα περιορισμένο σύνολο συγκεκριμένων μεταβολικών οδών (Σχήμα 1G). Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και η μείωση της ρύθμισης των οδών που σχετίζονται με το OXPHOS και την σηματοδότηση ασβεστίου επιβεβαιώνει την πρόκληση μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας σε μιτοχονδριακά νοσήματα με ανεπάρκεια σύντηξης, άλλες κατηγορίες που αφορούν κυρίως τον μεταβολισμό των αμινοξέων αυξάνονται σημαντικά, γεγονός που ευθυγραμμίζεται με τον μεταβολισμό που εμφανίζεται στα μιτοχονδριακά νοσήματα. Η επανασύνδεση είναι συνεπής.
(Α) Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές φωτογραφίες παρεγκεφαλιδικών τομών ποντικών CTRL και Mfn2cKO που δείχνουν προοδευτική απώλεια PNs (καλμπινδίνη, γκρι). Οι πυρήνες αντιχρωματίστηκαν με DAPI. (Β) Ποσοτικοποίηση του (Α) (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης, ***P<0,001; n = 4 έως 6 κύκλοι από τρία ποντίκια). (Γ) Πειραματική ροή εργασίας. (Δ) Κατανομή θερμικού χάρτη δεικτών ειδικών για τον Purkinje (πάνω) και άλλους κυτταρικούς τύπους (μέση). (Ε) Διάγραμμα Venn που δείχνει τον αριθμό των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών που εντοπίστηκαν στον ταξινομημένο PN. (ΣΤ) Διάγραμμα Volcano διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών σε νευρώνες Mfn2cKO στις 8 εβδομάδες (τιμή αποκοπής σημαντικότητας 1,3). (Ζ) Η ανάλυση της οδού δημιουργικότητας δείχνει τις πέντε πιο σημαντικές οδούς ανοδικής ρύθμισης (κόκκινη) και καθοδικής ρύθμισης (μπλε) στον Mfn2cKO PN που ταξινομήθηκε ως 8 εβδομάδες. Εμφανίζεται το μέσο επίπεδο έκφρασης κάθε ανιχνευμένης πρωτεΐνης. Θερμικός χάρτης κλίμακας του γκρι: προσαρμοσμένη τιμή P. ns, μη σημαντική.
Τα δεδομένα πρωτεωμικής έδειξαν ότι η πρωτεϊνική έκφραση των συμπλεγμάτων I, III και IV μειώθηκε σταδιακά. Τα σύμπλοκα I, III και IV περιείχαν όλα βασικές υπομονάδες που κωδικοποιούνταν από mtDNA, ενώ το σύμπλοκο II, το οποίο κωδικοποιούνταν μόνο από τον πυρήνα, παρέμεινε ουσιαστικά ανεπηρέαστο (Σχήμα 2Α και Σχήμα S2A). . Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της πρωτεωμικής, η ανοσοϊστοχημεία των τομών του παρεγκεφαλιδικού ιστού έδειξε ότι το επίπεδο υπομονάδας MTCO1 (υπομονάδα 1 της μιτοχονδριακής οξειδάσης του κυτοχρώματος C) του συμπλόκου IV στην παρεντερική προσβολή μειώθηκε σταδιακά (Σχήμα 2Β). Η υπομονάδα Mtatp8 που κωδικοποιείται από το mtDNA μειώθηκε σημαντικά (Σχήμα S2A), ενώ το επίπεδο σταθερής κατάστασης της υπομονάδας συνθάσης ATP που κωδικοποιείται από τον πυρήνα παρέμεινε αμετάβλητο, γεγονός που συνάδει με το γνωστό σταθερό σύμπλοκο F1 του υποσυνόλου συνθάσης ATP όταν η έκφραση του mtDNA είναι σταθερή. Ο σχηματισμός είναι συνεπής. Διακοπή (7). Η αξιολόγηση του επιπέδου του μιτοχονδριακού DNA στα ταξινομημένα Mfn2cKO PNs με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qPCR) επιβεβαίωσε τη σταδιακή μείωση του αριθμού αντιγράφων του μιτοχονδριακού DNA. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, σε ηλικία 8 εβδομάδων, διατηρήθηκε μόνο περίπου το 20% του επιπέδου του μιτοχονδριακού DNA (Σχήμα 2C). Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, η χρώση ομοεστιακής μικροσκοπίας των Mfn2cKO PNs χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση DNA, δείχνοντας την χρονικά εξαρτώμενη κατανάλωση μιτοχονδριακών νουκλεοτιδίων (Σχήμα 2D). Διαπιστώσαμε ότι μόνο ορισμένοι υποψήφιοι που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών και στην απόκριση στο στρες ήταν υπερρυθμισμένοι, συμπεριλαμβανομένων των Lonp1, Afg3l2 και Clpx, και των παραγόντων συναρμολόγησης του συμπλέγματος OXPHOS. Δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην απόπτωση (Σχήμα S2B). Ομοίως, διαπιστώσαμε ότι τα μιτοχόνδρια και τα κανάλια του ενδοπλασματικού δικτύου που εμπλέκονται στη μεταφορά ασβεστίου έχουν μόνο μικρές αλλαγές (Σχήμα S2C). Επιπλέον, η αξιολόγηση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την αυτοφαγία δεν διαπίστωσε σημαντικές αλλαγές, κάτι που συνάδει με την ορατή επαγωγή αυτοφαγοσωμάτων που παρατηρείται in vivo με ανοσοϊστοχημεία και ηλεκτρονική μικροσκοπία (Σχήμα S3). Ωστόσο, η προοδευτική δυσλειτουργία του OXPHOS σε PNs συνοδεύεται από εμφανείς υπερδομικές μιτοχονδριακές αλλαγές. Μιτοχονδριακές συστάδες μπορούν να παρατηρηθούν στα κυτταρικά σώματα και τα δενδριτικά δέντρα των PNs Mfn2cKO ηλικίας 5 και 8 εβδομάδων, και η δομή της εσωτερικής μεμβράνης έχει υποστεί βαθιές αλλαγές (Σχήμα S4, Α και Β). Σύμφωνα με αυτές τις υπερδομικές αλλαγές και μια σημαντική μείωση στο mtDNA, η ανάλυση οξέων εγκεφαλικών παρεγκεφαλιδικών φετών με μεθυλεστέρα τετραμεθυλοροδαμίνης (TMRM) έδειξε ότι το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε PNs Mfn2cKO μειώθηκε σημαντικά (Σχήμα S4C).
(Α) Ανάλυση χρονικής πορείας του επιπέδου έκφρασης του συμπλόκου OXPHOS. Εξετάστε μόνο πρωτεΐνες με P<0,05 στις 8 εβδομάδες (αμφίδρομη ANOVA). Διακεκομμένη γραμμή: Καμία προσαρμογή σε σύγκριση με το CTRL. (Β) Αριστερά: Ένα παράδειγμα παρεγκεφαλιδικής τομής που έχει επισημανθεί με αντίσωμα κατά του MTCO1 (γραμμή κλίμακας, 20 μm). Η περιοχή που καταλαμβάνεται από κυτταρικά σωμάτια Purkinje καλύπτεται με κίτρινο χρώμα. Δεξιά: Ποσοτικοποίηση των επιπέδων MTCO1 (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης· n = 7 έως 20 κύτταρα που αναλύθηκαν από τρία ποντίκια). (Γ) Ανάλυση qPCR του αριθμού αντιγράφων μιτοχονδριακού DNA στο ταξινομημένο PN (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης· n = 3 έως 7 ποντίκια). (Δ) Αριστερά: Ένα παράδειγμα παρεγκεφαλιδικής τομής που έχει επισημανθεί με αντίσωμα κατά του DNA (γραμμή κλίμακας, 20 μm). Η περιοχή που καταλαμβάνεται από κυτταρικά σωμάτια Purkinje καλύπτεται με κίτρινο χρώμα. Δεξιά: Ποσοτικοποίηση αλλοιώσεων μιτοχονδριακού DNA (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης· n = 5 έως 9 κύτταρα από τρία ποντίκια). (Ε) Ένα παράδειγμα οξείας παρεγκεφαλιδικής τομής που δείχνει mitoYFP + κύτταρα Purkinje (βέλος) σε μια καταγραφή ολόκληρων κυττάρων patch clamp. (ΣΤ) Ποσοτικοποίηση της καμπύλης IV. (Ζ) Αντιπροσωπευτικές καταγραφές έγχυσης αποπολωτικού ρεύματος σε κύτταρα Purkinje CTRL και Mfn2cKO. Άνω ίχνος: Ο πρώτος παλμός που ενεργοποίησε το AP. Κάτω ίχνος: Μέγιστη συχνότητα AP. (Η) Ποσοτικοποίηση μετασυναπτικών αυθόρμητων εισόδων (sPSPs). Το αντιπροσωπευτικό ίχνος καταγραφής και ο λόγος ζουμ του φαίνονται στο (Ι). Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ανέλυσε n = 5 έως 20 κύτταρα από τρία ποντίκια. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (Ι) Αντιπροσωπευτικά ίχνη αυθόρμητης AP που καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας τη λειτουργία διάτρητου patch clamp. Άνω ίχνος: Μέγιστη συχνότητα AP. Κάτω ίχνος: ζουμ ενός μόνο AP. (Κ) Ποσοτικοποιήστε τη μέση και μέγιστη συχνότητα AP σύμφωνα με το (Ι). Δοκιμασία Mann-Whitney. n = 5 κύτταρα αναλύθηκαν από τέσσερα ποντίκια. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM· δεν είναι σημαντικό.
Προφανής βλάβη OXPHOS ανιχνεύθηκε στο νευρωνικό πόρο Mfn2cKO ηλικίας 8 εβδομάδων, υποδεικνύοντας ότι η φυσιολογική λειτουργία των νευρώνων είναι σοβαρά ανώμαλη. Επομένως, αναλύσαμε τα παθητικά ηλεκτρικά χαρακτηριστικά των νευρώνων με ανεπάρκεια OXPHOS στις 4 έως 5 εβδομάδες και 7 έως 8 εβδομάδες πραγματοποιώντας καταγραφές ολόκληρων κυττάρων σε οξείες παρεγκεφαλιδικές τομές (Σχήμα 2Ε). Απροσδόκητα, το μέσο δυναμικό ηρεμίας της μεμβράνης και η αντίσταση εισόδου των νευρώνων Mfn2cKO ήταν παρόμοια με τον έλεγχο, αν και υπήρχαν ανεπαίσθητες διαφορές μεταξύ των κυττάρων (Πίνακας 1). Ομοίως, σε ηλικία 4 έως 5 εβδομάδων, δεν βρέθηκαν σημαντικές αλλαγές στη σχέση ρεύματος-τάσης (καμπύλη IV) (Σχήμα 2F). Ωστόσο, κανένας νευρώνας Mfn2cKO ηλικίας 7 έως 8 εβδομάδων δεν επέζησε του IV σχήματος (βήμα υπερπόλωσης), υποδεικνύοντας ότι υπάρχει σαφής ευαισθησία στο δυναμικό υπερπόλωσης σε αυτό το προχωρημένο στάδιο. Αντίθετα, στους νευρώνες Mfn2cKO, τα αποπολωτικά ρεύματα που προκαλούν επαναλαμβανόμενες εκκενώσεις δυναμικού δράσης (AP) είναι καλά ανεκτά, υποδεικνύοντας ότι τα συνολικά πρότυπα εκκένωσής τους δεν διαφέρουν σημαντικά από αυτά των νευρώνων ελέγχου ηλικίας 8 εβδομάδων (Πίνακας 1 και Σχήμα 2G). Ομοίως, η συχνότητα και το πλάτος των αυθόρμητων μετασυναπτικών ρευμάτων (sPSCs) ήταν συγκρίσιμα με αυτά της ομάδας ελέγχου και η συχνότητα των συμβάντων αυξήθηκε από 4 εβδομάδες σε 5 εβδομάδες σε 7 εβδομάδες σε 8 εβδομάδες με παρόμοια αύξηση (Σχήμα 2, H και I). Η περίοδος συναπτικής ωρίμανσης σε PNs (25). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν μετά από διάτρητες πλάκες PNs. Αυτή η διαμόρφωση αποτρέπει την πιθανή αντιστάθμιση των κυτταρικών ελαττωμάτων ATP, όπως μπορεί να συμβεί στην καταγραφή σφιγκτήρα ολόκληρων κυττάρων. Συγκεκριμένα, το δυναμικό ηρεμίας της μεμβράνης και η συχνότητα αυθόρμητης πυροδότησης των νευρώνων Mfn2cKO δεν επηρεάστηκαν (Σχήμα 2, J και K). Συνοπτικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι νευροδιαβιβαστές με εμφανή δυσλειτουργία του OXPHOS μπορούν να αντιμετωπίσουν καλά τα πρότυπα εκκένωσης υψηλής συχνότητας, υποδεικνύοντας ότι υπάρχει ένας μηχανισμός αντιστάθμισης που τους επιτρέπει να διατηρούν σχεδόν φυσιολογικές ηλεκτροφυσιολογικές αποκρίσεις.
Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης, πολλαπλή συγκριτική δοκιμή Holm-Sidak· *P<0,05). Ο αριθμός μονάδας υποδεικνύεται με παρενθέσεις.
Ξεκινήσαμε να διερευνήσουμε εάν κάποια κατηγορία στο σύνολο δεδομένων πρωτεωμικής (Σχήμα 1G) περιλαμβάνει οδούς που μπορούν να αντισταθμίσουν τη σοβαρή ανεπάρκεια OXPHOS, εξηγώντας έτσι γιατί η προσβεβλημένη περιτοναϊκή νοσηρότητα μπορεί να διατηρήσει σχεδόν φυσιολογική ηλεκτροφυσιολογία (Σχήμα 2, E έως K). Η πρωτεωμική ανάλυση έδειξε ότι τα ένζυμα που εμπλέκονται στον καταβολισμό των αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας (BCAA) ήταν σημαντικά αυξημένα (Σχήμα 3Α και Σχήμα S5A) και το τελικό προϊόν ακετυλο-CoA (CoA) ή σουκινυλο-CoA μπορεί να συμπληρώσει τα τρικαρβοξυλικά στον κύκλο του οξέος αρτηριοσκλήρωσης (TCA). Διαπιστώσαμε ότι η περιεκτικότητα σε τρανσαμινάση 1 BCAA (BCAT1) και BCAT2 αυξήθηκε και οι δύο. Καταλύουν το πρώτο βήμα του καταβολισμού BCAA παράγοντας γλουταμινικό από α-κετογλουταρικό (26). Όλες οι υπομονάδες που αποτελούν το σύμπλοκο διακλαδισμένης αλυσίδας κετο-οξέος αφυδρογονάσης (BCKD) είναι ανοδικά ρυθμισμένες (το σύμπλοκο καταλύει την επακόλουθη και μη αναστρέψιμη αποκαρβοξυλίωση του προκύπτοντος σκελετού άνθρακα BCAA) (Σχήμα 3Α και Σχήμα S5A). Ωστόσο, δεν βρέθηκαν εμφανείς αλλαγές στο ίδιο το BCAA στο ταξινομημένο PN, κάτι που μπορεί να οφείλεται στην αυξημένη κυτταρική πρόσληψη αυτών των απαραίτητων αμινοξέων ή στη χρήση άλλων πηγών (γλυκόζη ή γαλακτικό οξύ) για τη συμπλήρωση του κύκλου TCA (Σχήμα S5B). Τα PN που δεν είχαν OXPHOS εμφάνισαν επίσης αυξημένη αποσύνθεση γλουταμίνης και δραστικότητα τρανσαμινοποίησης σε ηλικία 8 εβδομάδων, κάτι που μπορεί να αντικατοπτρίζεται από την ανοδική ρύθμιση των μιτοχονδριακών ενζύμων γλουταμινάση (GLS) και γλουταμινοπυρροσταφυλική τρανσαμινάση 2 (GPT2) (Σχήμα 3, A και C). Αξίζει να σημειωθεί ότι η ανοδική ρύθμιση της GLS περιορίζεται στην ισομορφή γλουταμινάσης C (GLS-GAC) (η αλλαγή της Mfn2cKO/CTRL είναι περίπου 4,5 φορές, P = 0,05) και η ειδική ανοδική της ρύθμιση σε καρκινικούς ιστούς μπορεί να υποστηρίξει τη μιτοχονδριακή βιοενέργεια. (27).
(Α) Ο χάρτης θερμότητας δείχνει την αναδιπλούμενη μεταβολή στο επίπεδο πρωτεΐνης για την καθορισμένη οδό στις 8 εβδομάδες. (Β) Παράδειγμα παρεγκεφαλιδικής τομής επισημασμένης με αντίσωμα κατά του PCx (γραμμή κλίμακας, 20 μm). Το κίτρινο βέλος δείχνει το κυτταρικό σώμα Purkinje. (Γ) Ανάλυση χρονικής πορείας έκφρασης πρωτεΐνης που αναγνωρίστηκε ως σημαντικός υποψήφιος για αθηροσκλήρωση (πολλαπλό t-test, *FDR <5%· n = 3-5 ποντίκια). (Δ) Πάνω: Ένα σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τους διαφορετικούς τρόπους εισόδου του επισημασμένου άνθρακα που περιέχεται στον ιχνηθέτη [1-13C]πυροσταφυλικού (δηλαδή, μέσω PDH ή δια-αρτηριακής οδού). Κάτω: Το διάγραμμα βιολιού δείχνει το ποσοστό του μονά επισημασμένου άνθρακα (M1) που μετατράπηκε σε ασπαρτικό οξύ, κιτρικό οξύ και μηλικό οξύ μετά την επισήμανση οξέων παρεγκεφαλιδικών τομών με [1-13C]πυροσταφυλικό (ζευγάρωμα t-test· ** P <0,01). (Ε) Πλήρης ανάλυση χρονοϊστορίας της υποδεικνυόμενης οδού. Εξετάστε μόνο πρωτεΐνες με P<0,05 στις 8 εβδομάδες. Διακεκομμένη γραμμή: καμία τιμή προσαρμογής (αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης· * P <0,05· *** P <0,001). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM.
Στην ανάλυσή μας, ο καταβολισμός των BCAA έχει γίνει μία από τις βασικές οδούς ανοδικής ρύθμισης. Αυτό το γεγονός υποδηλώνει έντονα ότι ο όγκος αερισμού που εισέρχεται στον κύκλο TCA μπορεί να αλλάξει σε PN χωρίς OXPHOS. Αυτό μπορεί να αντιπροσωπεύει μια σημαντική μορφή νευρωνικής μεταβολικής επανασύνδεσης, η οποία μπορεί να έχει άμεσο αντίκτυπο στη νευρωνική φυσιολογία και την επιβίωση κατά τη διάρκεια της διατήρησης σοβαρής δυσλειτουργίας του OXPHOS. Σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση, διαπιστώσαμε ότι το κύριο αντιαθηροσκληρωτικό ένζυμο PCx ρυθμίζεται ανοδικά (το Mfn2cKO/CTRL αλλάζει περίπου 1,5 φορές· Σχήμα 3Α), το οποίο καταλύει τη μετατροπή του πυροσταφυλικού σε οξαλοξικό (28), το οποίο πιστεύεται ότι βρίσκεται στον εγκεφαλικό ιστό. Η έκφραση περιορίζεται στα αστροκύτταρα (29, 30). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της πρωτεωμικής, η ομοεστιακή μικροσκοπία έδειξε ότι η έκφραση PCx αυξήθηκε ειδικά και σημαντικά σε PN με ανεπάρκεια OXPHOS, ενώ η αντιδραστικότητα του PCx περιορίστηκε κυρίως στα γειτονικά γλοιακά κύτταρα Bergmann του ελέγχου (Σχήμα 3Β). Για να ελέγξουμε λειτουργικά την παρατηρούμενη ανοδική ρύθμιση του PCx, αντιμετωπίσαμε οξείες παρεγκεφαλιδικές φέτες με ιχνηθέτη [1-13C]πυροσταφυλικού οξέος. Όταν το πυροσταφυλικό οξύ οξειδώθηκε από την πυροσταφυλική αφυδρογονάση (PDH), η ισοτοπική του ετικέτα εξαφανίστηκε. Το But ενσωματώνεται στα ενδιάμεσα του κύκλου TCA όταν το πυροσταφυλικό οξύ μεταβολίζεται μέσω αγγειακών αντιδράσεων (Σχήμα 3D). Προς υποστήριξη των πρωτεϊνωμικών μας δεδομένων, παρατηρήσαμε μεγάλο αριθμό δεικτών από αυτόν τον ιχνηθέτη στο ασπαρτικό οξύ των φετών Mfn2cKO, ενώ το κιτρικό οξύ και το μηλικό οξύ είχαν επίσης μέτρια τάση, αν και όχι σημαντική (Σχήμα 3D).
Στους νευρώνες ντοπαμίνης των ποντικών MitoPark με μιτοχονδριακή δυσλειτουργία που προκαλείται από νευρώνες ντοπαμίνης που καταστρέφουν ειδικά το γονίδιο του μιτοχονδριακού παράγοντα μεταγραφής Α (Tfam) (Σχήμα S6B), η έκφραση PCx ήταν επίσης σημαντικά αυξημένη (31), υποδεικνύοντας ότι η εμφάνιση της νόσου ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια της δυσλειτουργίας του νευρωνικού OXPHOS στο σώμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι έχει διαπιστωθεί ότι μοναδικά ένζυμα (32-34) που μπορεί να εκφράζονται σε νευρώνες που μπορεί να σχετίζονται με αρτηριοσκλήρυνση είναι σημαντικά αυξημένα σε νευρωνικά κύτταρα που δεν έχουν OXPHOS, όπως η προπιονυλ-CoA καρβοξυλάση (PCC-A), η μαλονυλ-CoA μετατρέπει το προπιονυλ-CoA σε σουκινυλ-CoA και το μιτοχονδριακό μηλικό ένζυμο 3 (ME3), του οποίου ο κύριος ρόλος είναι η ανάκτηση του πυροσταφυλικού από το μηλικό (Σχήμα 3, A και C) (33, 35). Επιπλέον, διαπιστώσαμε σημαντική αύξηση στο ένζυμο Pdk3, το οποίο φωσφορυλιώνει και έτσι απενεργοποιεί την PDH (36), ενώ δεν ανιχνεύθηκαν αλλαγές στο ένζυμο Pdp1 που ενεργοποιεί την PDH ή στο ίδιο το σύμπλεγμα ενζύμων PDH (Σχήμα 3Α). Συνεπώς, σε πνευμονικές διεργασίες Mern2cKO, η φωσφορυλίωση της υπομονάδας α1 α (PDHE1α) του συστατικού Ε1 της πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης του συμπλόκου PDH στη Ser293 (γνωστό ότι αναστέλλει την ενζυμική δράση της PDH) ενισχύθηκε (Σχήμα S6C) (Σχήμα S6C). Το πυροσταφυλικό δεν έχει αγγειακή πρόσβαση.
Τέλος, διαπιστώσαμε ότι η υπερ-οδός βιοσύνθεσης σερίνης και γλυκίνης, ο σχετικός κύκλος του μιτοχονδριακού φυλλικού οξέος (1C) και η βιοσύνθεση της προλίνης (Σχήμα 1G και Σχήμα S5C) αυξάνονται σημαντικά, σύμφωνα με αναφορές, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενεργοποίησης. Οι περιβάλλοντες ιστοί ενεργοποιούνται με μιτοχονδριακή δυσλειτουργία (5-7). Η ομοεστιακή ανάλυση που υποστηρίζει αυτά τα πρωτεωμικά δεδομένα έδειξε ότι σε περιτοναϊκή αδενοπάθεια (PN) με απουσία OXPHOS, οι παρεγκεφαλιδικές τομές ποντικών ηλικίας 8 εβδομάδων υποβλήθηκαν σε σερίνη υδροξυμεθυλοτρανσφεράση 2 (SHMT2), ένα βασικό ένζυμο του μιτοχονδριακού κύκλου του φυλλικού οξέος. Σημαντική ανοσολογική απόκριση (Σχήμα S5D). Σε 13 οξείες παρεγκεφαλιδικές τομές που επωάστηκαν με CU-γλυκόζη, τα πειράματα μεταβολικής ιχνηλάτησης επιβεβαίωσαν περαιτέρω την αυξητική ρύθμιση της βιοσύνθεσης σερίνης και προλίνης, υποδεικνύοντας ότι η ροή ισομορφών άνθρακα σε σερίνη και προλίνη αυξήθηκε (Σχήμα S5E). Δεδομένου ότι οι αντιδράσεις που προάγονται από την GLS και την GPT2 είναι υπεύθυνες για τη σύνθεση γλουταμινικού από γλουταμίνη και την τρανσαμίνωση μεταξύ γλουταμινικού και α-κετογλουταρικού, η ανοδική τους ρύθμιση υποδηλώνει ότι οι νευρώνες με ανεπάρκεια OXPHOS έχουν αυξημένη ζήτηση για γλουταμινικό . Αυτό μπορεί να στοχεύει στη διατήρηση της αυξημένης βιοσύνθεσης προλίνης (Σχήμα S5C). Σε αντίθεση με αυτές τις αλλαγές, μια πρωτεωμική ανάλυση παρεγκεφαλιδικών αστροκυττάρων από ποντίκια Mfn2cKO ειδικά για την PN έδειξε ότι αυτές οι οδοί (συμπεριλαμβανομένων όλων των αντιυπεροξειδασών) δεν άλλαξαν σημαντικά στην έκφραση, αποδεικνύοντας έτσι ότι αυτή η μεταβολική ανακατεύθυνση είναι επιλεκτική προς την αποικοδομημένη PN (Σχήμα S6, D έως G).
Συνοπτικά, αυτές οι αναλύσεις αποκάλυψαν σημαντικά διαφορετικά πρότυπα χρονικής ενεργοποίησης συγκεκριμένων μεταβολικών οδών σε PNs. Αν και η ανώμαλη νευρωνική μιτοχονδριακή λειτουργία μπορεί να οδηγήσει σε πρώιμη αθηροσκλήρωση και αναδιαμόρφωση 1C (Σχήμα 3Ε και Σχήμα S5C), ακόμη και σε προβλέψιμες αλλαγές στην έκφραση των συμπλεγμάτων I και IV, οι αλλαγές στη σύνθεση de novo σερίνης είναι εμφανείς μόνο στα τελευταία στάδια. Δυσλειτουργία OXPHOS (Σχήμα 3Ε και Σχήμα S5C). Αυτά τα ευρήματα ορίζουν μια διαδοχική διαδικασία στην οποία η μιτοχονδριακή (κύκλος 1C) και η κυτταροπλασματική (βιοσύνθεση σερίνης) που προκαλείται από το στρες αντιδρούν συνεργιστικά με την αύξηση της αθηροσκλήρωσης στον κύκλο TCA για να αναδιαμορφώσουν τον νευρωνικό μεταβολισμό.
Τα PNs με ανεπάρκεια OXPHOS ηλικίας 8 εβδομάδων μπορούν να διατηρήσουν δραστηριότητα διέγερσης υψηλής συχνότητας και να υποστούν σημαντική μεταβολική επανασύνδεση για να αντισταθμίσουν τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. Αυτή η ανακάλυψη εγείρει μια ενδιαφέρουσα πιθανότητα ότι ακόμη και αυτή τη στιγμή, αυτά τα κύτταρα μπορούν επίσης να λάβουν θεραπευτική παρέμβαση για να καθυστερήσουν ή να αποτρέψουν τη νευροεκφύλιση. Καθυστερημένα. Επιλύσαμε αυτή την πιθανότητα μέσω δύο ανεξάρτητων παρεμβάσεων. Στην πρώτη μέθοδο, σχεδιάσαμε έναν φορέα αδενο-σχετιζόμενου ιού (AAV) εξαρτώμενο από Cre, έτσι ώστε το MFN2 να μπορεί να εκφράζεται επιλεκτικά σε PNs με ανεπάρκεια OXPHOS in vivo (Σχήμα S7A). Το AAV που κωδικοποιεί το MFN2 και το φθορίζον γονίδιο αναφοράς mCherry (Mfn2-AAV) επαληθεύτηκαν σε καλλιέργειες πρωτογενών νευρώνων in vitro, γεγονός που προκάλεσε την έκφραση του MFN2 με τρόπο εξαρτώμενο από Cre και διέσωσε τη μιτοχονδριακή μορφολογία, αποτρέποντας έτσι τη νευρομετάλλαξη σε νευρώνες Mfn2cKO (Σχήμα S7, B, D και E). Στη συνέχεια, διεξήγαμε πειράματα in vivo για την στερεοτακτική χορήγηση Mfn2-AAV 8 εβδομάδων στον παρεγκεφαλιδικό φλοιό ποντικών Mfn2cKO και ποντικών ελέγχου και αναλύσαμε ποντίκια 12 εβδομάδων (Σχήμα 4Α). Τα ποντίκια Mfn2cKO που υποβλήθηκαν σε αγωγή πέθαναν (Σχήμα 1, Α και Β) (16). Η μεταγωγή του ιού in vivo είχε ως αποτέλεσμα την επιλεκτική έκφραση της PN σε ορισμένους παρεγκεφαλιδικούς κύκλους (Σχήμα S7, G και H). Η έγχυση του AAV ελέγχου που εκφράζει μόνο mCherry (Ctrl-AAV) δεν είχε σημαντική επίδραση στον βαθμό νευροεκφυλισμού σε ζώα Mfn2cKO. Αντίθετα, η ανάλυση των Mfn2cKO που μετασχηματίστηκαν με Mfn2-AAV έδειξε σημαντική προστατευτική επίδραση της κυτταρικής στιβάδας PN (Σχήμα 4, Β και C). Συγκεκριμένα, η πυκνότητα των νευρώνων φαίνεται να είναι σχεδόν αδιαχώριστη από τα ζώα ελέγχου (Σχήμα 4, Β και C, και Σχήμα S7, Η και Ι). Η έκφραση του MFN1 αλλά όχι του MFN2 είναι εξίσου αποτελεσματική στην αποφυγή του νευρωνικού θανάτου (Σχήμα 4C και Σχήμα S7, C και F), γεγονός που υποδεικνύει ότι η έκφραση του έκτοπου MFN1 μπορεί να συμπληρώσει αποτελεσματικά την έλλειψη του MFN2. Περαιτέρω ανάλυση σε επίπεδο μίας παρεντερικής νοσηλείας έδειξε ότι το Mfn2-AAV διέσωσε σε μεγάλο βαθμό την υπερδομή των μιτοχονδρίων, ομαλοποίησε τα επίπεδα του μιτοχονδριακού DNA και ανέστρεψε την υψηλή έκφραση του δείκτη αντι-αγγειογένεσης PCx (Σχήμα 4, C έως E). Ο οπτικός έλεγχος των διασωθέντων ποντικών Mfn2cKO σε κατάσταση ηρεμίας έδειξε ότι η στάση του σώματος και τα κινητικά τους συμπτώματα (κίνηση S1 έως S3) βελτιώθηκαν. Συμπερασματικά, αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι η καθυστερημένη επανεισαγωγή του MFN2 σε παρεντερικές νοσολογ ...
(Α) Ένα σχήμα που δείχνει το πειραματικό πρόγραμμα για την έγχυση AAV που κωδικοποιεί MFN2 όταν ενεργοποιείται η υποδεικνυόμενη μεταβολική οδός. (Β) Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές εικόνες παρεγκεφαλιδικών τομών ηλικίας 12 εβδομάδων που μετασχηματίστηκαν στις 8 εβδομάδες σε ποντίκια Mfn2cKO και επισημάνθηκαν με αντίσωμα κατά της Καλμπινδίνης. Δεξιά: Κλιμάκωση των νευραξονικών ινών. Η κλίμακα του ζουμ του άξονα είναι 450 και 75 μm. (Γ) Αριστερά: Ποσοτικοποίηση της πυκνότητας των κυττάρων Purkinje στον βρόχο μεταγωγής AAV (AAV+) (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης· n = 3 ποντίκια). Δεξιά: ανάλυση εστίασης μιτοχονδριακού DNA σε μεταδιεγερμένο PN την εβδομάδα 12 (μη ζευγαρωμένο t-test· n = 6 κύτταρα από τρία ποντίκια). * P <0,05; ** P <0,01. (Δ) Αντιπροσωπευτικές ηλεκτρονικές μικρογραφίες μετάδοσης PN παρεγκεφαλιδικών τομών Mfn2cKO που μετασχηματίστηκαν με τους υποδεικνυόμενους ιικούς φορείς. Η ροζ μάσκα απεικονίζει την περιοχή που καταλαμβάνουν οι δενδρίτες και το κίτρινο διακεκομμένο τετράγωνο απεικονίζει το ζουμ που παρέχεται στα δεξιά. Το n αντιπροσωπεύει τον πυρήνα. Γραμμή κλίμακας, 1 μm. (E) δείχνει ένα παράδειγμα χρώσης PCx σε PN που μετατράπηκε στις 12 εβδομάδες. Γραμμή κλίμακας, 20 μm. OE, υπερέκφραση. FC, αλλαγή πτυχής.
Τέλος, διερευνήσαμε τη σημασία της επαγόμενης από την υπεροξειδάση κυτταρικής επιβίωσης σε ΠΝ που έχουν παρουσιάσει δυσλειτουργία OXPHOS. Δημιουργήσαμε mCherry που κωδικοποιεί AAV-shRNA (short hairpin RNA) που στοχεύει ειδικά το mRNA PCx ποντικού (AAV-shPCx) και εγχύσαμε τον ιό ή τον κωδικοποιημένο μάρτυρά του (AAV-scr) στην παρεγκεφαλίδα ποντικών Mfn2cKO. Η ένεση πραγματοποιήθηκε την τέταρτη εβδομάδα ηλικίας (Σχήμα 5Α) για να επιτευχθεί αποτελεσματική καταστολή του PCx κατά την περίοδο που η έκφραση του PCx αυξήθηκε (Σχήμα 3C) και το στρώμα των κυττάρων ΠΝ ήταν ακόμα άθικτο (Σχήμα 1Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι η καταστολή του PCx (Σχήμα S8A) οδηγεί σε σημαντική επιτάχυνση του θανάτου ΠΝ, η οποία περιορίζεται στον μολυσμένο δακτύλιο (Σχήμα 5, Β και Γ). Προκειμένου να κατανοήσουμε τον μηχανισμό των μεταβολικών επιδράσεων που προκαλούνται από την ανοδική ρύθμιση του PCx, μελετήσαμε την οξειδοαναγωγική κατάσταση των PNs μετά την ταυτόχρονη έκφραση του knockdown του PCx και του οπτικού βιοαισθητήρα Grx1-roGFP2 που προκαλείται από AAV (Σχήμα S8, B έως D) για να αξιολογήσουμε τη σχετική αλλαγή του δυναμικού οξειδοαναγωγής πεπτιδίων γλουταθειόνης (38). Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μικροσκοπία απεικόνισης διάρκειας ζωής φθορισμού δύο φωτονίων (FLIM) σε οξείες τομές εγκεφάλου Mfn2cKO ηλικίας 7 εβδομάδων ή συγγενών ελέγχου για να ανιχνεύσουμε πιθανές αλλαγές στην κυτταροπλασματική οξειδοαναγωγική κατάσταση μετά την επαλήθευση των συνθηκών FLIM (Σχήμα S8, E έως G). Η ανάλυση έδειξε σημαντική αύξηση στην κατάσταση οξείδωσης ενός μόνο PNs Mfn2cKO που δεν είχαν έκφραση PCx, η οποία είναι διαφορετική από τους νευρώνες ελέγχου ή τα PNs Mfn2cKO που εκφράζουν μόνο κωδικοποιημένο shRNA (Σχήμα 5, D και E). Όταν η έκφραση PCx μειώθηκε, το ποσοστό των Mfn2cKO PNs που εμφάνισαν έντονα οξειδωμένη κατάσταση αυξήθηκε περισσότερο από τρεις φορές (Σχήμα 5Ε), υποδεικνύοντας ότι η ανοδική ρύθμιση PCx διατήρησε την οξειδοαναγωγική ικανότητα των εκφυλισμένων νευρώνων.
(Α) Ένα σχήμα που δείχνει το πειραματικό πρόγραμμα για την έγχυση AAV που κωδικοποιεί shPCx όταν ενεργοποιείται η υποδεικνυόμενη μεταβολική οδός. (Β) Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές φωτογραφίες παρεγκεφαλιδικών τομών 8 εβδομάδων σε ποντίκια Mfn2cKO που έχουν υποστεί μεταγωγή και επισήμανση με αντίσωμα κατά της καλσινευρίνης στις 4 εβδομάδες. Γραμμή κλίμακας, 450 μm. (Γ) Ποσοτικοποίηση της πυκνότητας των κυττάρων Purkinje σε βρόχους μεταγωγής AAV (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης· n = 3 έως 4 ποντίκια). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM· ***P<0,001. (Δ) Αντιπροσωπευτική εικόνα FLIM δείχνει τη μέση διάρκεια ζωής PN ηλικίας 7 εβδομάδων που εκφράζει αισθητήρα οξειδοαναγωγής γλουταθειόνης Grx1-roGFP2 υπό τις καθορισμένες πειραματικές συνθήκες. Λόγος LUT (πίνακας αναζήτησης): χρονικό διάστημα επιβίωσης (σε πικοδευτερόλεπτα). Γραμμή κλίμακας, 25 μm. (Ε) Το ιστόγραμμα δείχνει την κατανομή των τιμών διάρκειας ζωής Grx1-roGFP2 από (Δ) (n=158 έως 368 κύτταρα σε δύο ποντίκια υπό κάθε συνθήκη). Το κυκλικό διάγραμμα πάνω από κάθε ιστόγραμμα: δείχνει τον αριθμό των κυττάρων με σημαντικά μεγαλύτερες (κόκκινο, οξειδωμένο) ή μικρότερες (μπλε, μειωμένο) τιμές διάρκειας ζωής, οι οποίες υπερβαίνουν την 1 τυπική απόκλιση της μέσης τιμής διάρκειας ζωής στο CTRL-AAV-scr. (ΣΤ) Το προτεινόμενο μοντέλο δείχνει την προστατευτική επίδραση της ανοδικής ρύθμισης του νευρωνικού PCx.
Συνολικά, τα δεδομένα που παρέχουμε εδώ δείχνουν ότι η επανέκφραση του MFN2 μπορεί να διασώσει πλήρως την προχωρημένη PN με σοβαρή ανεπάρκεια OXPHOS, σοβαρή εξάντληση του μιτοχονδριακού DNA και εξαιρετικά ανώμαλη μορφολογία τύπου ista, παρέχοντας έτσι συνεχή πρόοδο ακόμη και σε προχωρημένες ασθένειες. Η νευροεκφύλιση παρέχει αναστρέψιμη ένδειξη του σταδίου πριν από τον κυτταρικό θάνατο. Αυτός ο βαθμός μεταβολικής ευελιξίας τονίζεται περαιτέρω από την ικανότητα των νευρώνων να προκαλούν αθηροσκλήρωση (αναδιαμόρφωση του κύκλου TCA), η οποία αναστέλλει την έκφραση PCx σε PN που δεν έχουν OXPHOS και ενισχύει τον κυτταρικό θάνατο, παίζοντας έτσι προστατευτικό ρόλο (Σχήμα 5F).
Σε αυτή τη μελέτη, παρείχαμε στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η απόκριση των νευρώνων παρεντερικής οδού (PN) στη δυσλειτουργία του OXPHOS είναι η σταδιακή σύγκλιση προς την αθηροσκλήρωση του κύκλου TCA μέσω της διαφορικής οδού ενεργοποίησης που ενεργοποιείται από μεταβολικά προγράμματα. Επιβεβαιώσαμε την πρωτεωμική ανάλυση με πολλές συμπληρωματικές μεθόδους και αποκαλύψαμε ότι όταν αντιμετωπίζουν σοβαρή μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, οι νευρώνες έχουν μια προηγουμένως άγνωστη μορφή μεταβολικής ελαστικότητας. Προς έκπληξή μας, ολόκληρη η διαδικασία επανασύνδεσης δεν σηματοδοτεί απαραίτητα την τελική μεταβολική κατάσταση που συνοδεύει τη νευροεκφύλιση σταδιακά και μη αναστρέψιμα, αλλά τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι μπορεί να αποτελεί νευρώνα συντήρησης ακόμη και στο στάδιο πριν από τον κυτταρικό θάνατο. Μηχανισμός λειτουργικής αντιστάθμισης. Αυτό το εύρημα δείχνει ότι οι νευρώνες έχουν σημαντικό βαθμό μεταβολικής πλαστικότητας στο σώμα. Αυτό το γεγονός αποδεικνύει ότι η μεταγενέστερη επανεισαγωγή του MFN2 μπορεί να αντιστρέψει την έκφραση βασικών μεταβολικών δεικτών και να αποτρέψει την εκφύλιση του PN. Αντίθετα, αναστέλλει την αθηροσκλήρωση και επιταχύνει τα νεύρα. τρανσεξουαλικό.
Ένα από τα πιο συναρπαστικά ευρήματα της έρευνάς μας είναι ότι οι πρωτοπαθείς νευρώνες που δεν έχουν OXPHOS μπορούν να τροποποιήσουν τον μεταβολισμό του κύκλου TCA αυξάνοντας την ενεργοποίηση ενζύμων που διεγείρουν ειδικά την αρτηριοσκλήρωση. Η μεταβολική αναδιάταξη είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων, μερικά από τα οποία βασίζονται στη γλουταμίνη για να συμπληρώσουν τα ενδιάμεσα του κύκλου TCA για να παράγουν αναγωγικά ισοδύναμα, τα οποία οδηγούν την αναπνευστική αλυσίδα και διατηρούν την παραγωγή προδρόμων βιοσύνθεσης λιπιδίων και νουκλεοτιδίων (39, 40). Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι σε περιφερειακούς ιστούς που βιώνουν δυσλειτουργία του OXPHOS, η επανασύνδεση του μεταβολισμού γλουταμίνης/γλουταμινικού είναι επίσης ένα σημαντικό χαρακτηριστικό (5, 41), όπου η κατεύθυνση εισόδου γλουταμίνης στον κύκλο TCA εξαρτάται από τη σοβαρότητα της βλάβης από το OXPHOS (41). Ωστόσο, δεν υπάρχουν σαφή στοιχεία για οποιαδήποτε ομοιότητα της νευρωνικής μεταβολικής πλαστικότητας στο σώμα και την πιθανή της σημασία στο πλαίσιο της νόσου. Σε μια πρόσφατη μελέτη in vitro, οι πρωτογενείς νευρώνες του φλοιού έδειξαν ότι κινητοποιούν δεξαμενές γλουταμινικού για νευροδιαβίβαση, προωθώντας έτσι τον οξειδωτικό μεταβολισμό και την αθηροσκλήρωση υπό συνθήκες μεταβολικού στρες (42). Αξίζει να σημειωθεί ότι υπό τη φαρμακολογική αναστολή του ενζύμου του κύκλου TCA, ηλεκτρική αφυδρογονάση, η καρβοξυλίωση του πυροσταφυλικού οξέος πιστεύεται ότι διατηρεί τη σύνθεση οξαλοξικού οξέος σε καλλιεργημένους νευρώνες παρεγκεφαλιδικών κοκκίων (34). Ωστόσο, η φυσιολογική σημασία αυτών των μηχανισμών για τον εγκεφαλικό ιστό (όπου η αθηροσκλήρωση πιστεύεται ότι περιορίζεται κυρίως στα αστροκύτταρα) εξακολουθεί να έχει σημαντική φυσιολογική σημασία (43). Σε αυτήν την περίπτωση, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι οι παρεντερικές ίνες που έχουν υποστεί βλάβη από το OXPHOS στο σώμα μπορούν να μετατραπούν σε αποικοδόμηση BCAA και καρβοξυλίωση πυροσταφυλικού οξέος, οι οποίες είναι οι δύο κύριες πηγές συμπλήρωσης ενδιάμεσων προϊόντων της ομάδας TCA. Αν και έχει προταθεί η πιθανή συμβολή του καταβολισμού BCAA στον μεταβολισμό της νευρωνικής ενέργειας, εκτός από τον ρόλο του γλουταμινικού οξέος και του GABA για νευροδιαβίβαση (44), δεν υπάρχουν ακόμη στοιχεία για αυτούς τους μηχανισμούς in vivo. Επομένως, είναι εύκολο να υποθέσουμε ότι οι δυσλειτουργικές παρεντερικές ίνες μπορούν να αντισταθμίσουν αυτόματα την κατανάλωση ενδιάμεσων προϊόντων TCA που καθοδηγούνται από τη διαδικασία αφομοίωσης αυξάνοντας την αθηροσκλήρωση. Συγκεκριμένα, η ανοδική ρύθμιση του PCx μπορεί να απαιτείται για τη διατήρηση αυξημένης ζήτησης για ασπαρτικό οξύ, κάτι που υποδηλώνεται σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα με μιτοχονδριακή δυσλειτουργία (45). Ωστόσο, η μεταβολική μας ανάλυση δεν αποκάλυψε σημαντικές αλλαγές στο επίπεδο σταθερής κατάστασης του ασπαρτικού οξέος σε Mfn2cKO PNs (Σχήμα S6A), κάτι που πιθανώς αντανακλά τη διαφορετική μεταβολική αξιοποίηση του ασπαρτικού οξέος μεταξύ των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων και των μεταμιτωτικών νευρώνων. Αν και ο ακριβής μηχανισμός της ανοδικής ρύθμισης του PCx σε δυσλειτουργικούς νευρώνες in vivo δεν έχει ακόμη χαρακτηριστεί, καταδείξαμε ότι αυτή η πρόωρη απόκριση παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης των νευρώνων, κάτι που αποδείχθηκε σε πειράματα FLIM σε παρεγκεφαλιδικές τομές. Συγκεκριμένα, η αποτροπή της ανοδικής ρύθμισης του PCx από τα PNs μπορεί να οδηγήσει σε μια πιο οξειδωμένη κατάσταση και να επιταχύνει τον κυτταρικό θάνατο. Η ενεργοποίηση της αποικοδόμησης των BCAA και η καρβοξυλίωση του πυροσταφυλικού οξέος δεν είναι τρόποι χαρακτηρισμού των περιφερειακών ιστών με μιτοχονδριακή δυσλειτουργία (7). Επομένως, φαίνεται να αποτελούν χαρακτηριστικό προτεραιότητας των νευρώνων με ανεπάρκεια OXPHOS, ακόμη και αν δεν είναι το μόνο χαρακτηριστικό, το οποίο είναι σημαντικό για τη νευροεκφύλιση.
Η παρεγκεφαλιδική νόσος είναι ένας ετερογενής τύπος νευροεκφυλιστικής νόσου που συνήθως εκδηλώνεται ως αταξία και συχνά βλάπτει τους παρεγκεφαλιδικούς νευρώνες (46). Αυτός ο πληθυσμός νευρώνων είναι ιδιαίτερα ευάλωτος στη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία επειδή η επιλεκτική εκφύλισή τους σε ποντίκια επαρκεί για να αναπαράγει πολλά από τα κινητικά συμπτώματα που χαρακτηρίζουν την ανθρώπινη σπινοπαρεγκεφαλιδική αταξία (16, 47, 48). Σύμφωνα με αναφορές, ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού με μεταλλαγμένο γονίδιο σχετίζεται με την ανθρώπινη σπινοπαρεγκεφαλιδική αταξία και έχει μιτοχονδριακή δυσλειτουργία (49, 50), υπογραμμίζοντας τη σημασία της μελέτης των συνεπειών της ανεπάρκειας OXPHOS στην PNPH. Επομένως, είναι ιδιαίτερα κατάλληλο να απομονωθεί και να μελετηθεί αποτελεσματικά αυτός ο μοναδικός πληθυσμός νευρώνων. Ωστόσο, δεδομένου ότι οι παρεγκεφαλιδικοί νευρώνες είναι πολύ ευαίσθητοι στην πίεση και αντιπροσωπεύουν ένα χαμηλό ποσοστό ολόκληρου του πληθυσμού των παρεγκεφαλιδικών κυττάρων, για πολλές μελέτες που βασίζονται στην ομική, ο επιλεκτικός διαχωρισμός τους ως ολόκληρα κύτταρα εξακολουθεί να αποτελεί μια δύσκολη πτυχή. Παρόλο που είναι σχεδόν αδύνατο να επιτευχθεί απόλυτη έλλειψη μόλυνσης άλλων τύπων κυττάρων (ειδικά ενήλικων ιστών), συνδυάσαμε ένα αποτελεσματικό βήμα διαχωρισμού με FACS για να λάβουμε επαρκή αριθμό βιώσιμων νευρώνων για ανάλυση πρωτεωμικής κατάντη και να έχουμε αρκετά υψηλή κάλυψη πρωτεΐνης (περίπου 3000 πρωτεΐνες) σε σύγκριση με το υπάρχον σύνολο δεδομένων ολόκληρης της παρεγκεφαλίδας (51). Διατηρώντας τη βιωσιμότητα ολόκληρων κυττάρων, η μέθοδος που παρέχουμε εδώ μας επιτρέπει όχι μόνο να ελέγξουμε τις αλλαγές στις μεταβολικές οδούς στα μιτοχόνδρια, αλλά και να ελέγξουμε τις αλλαγές στα κυτταροπλασματικά αντίστοιχα, γεγονός που συμπληρώνει τη χρήση ετικετών μιτοχονδριακής μεμβράνης για τον εμπλουτισμό του κυτταρικού τύπου. Η νέα μέθοδος για τον αριθμό των μιτοχονδρίων σε σύνθετους ιστούς (52, 53). Η μέθοδος που περιγράφουμε δεν σχετίζεται μόνο με τη μελέτη των κυττάρων Purkinje, αλλά μπορεί εύκολα να εφαρμοστεί σε οποιοδήποτε τύπο κυττάρου για την αντιμετώπιση μεταβολικών αλλαγών σε νοσούντες εγκεφάλους, συμπεριλαμβανομένων άλλων μοντέλων μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας.
Τέλος, εντοπίσαμε ένα θεραπευτικό παράθυρο κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας μεταβολικής αναδιάταξης που μπορεί να αντιστρέψει πλήρως τα βασικά σημάδια του κυτταρικού στρες και να αποτρέψει την νευρωνική εκφύλιση. Επομένως, η κατανόηση των λειτουργικών επιπτώσεων της επανασύνδεσης που περιγράφεται εδώ μπορεί να παρέχει θεμελιώδεις γνώσεις σχετικά με πιθανές θεραπείες για τη διατήρηση της νευρωνικής βιωσιμότητας κατά τη διάρκεια της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας. Απαιτείται μελλοντική έρευνα με στόχο την ανάλυση των αλλαγών στον ενεργειακό μεταβολισμό σε άλλους τύπους εγκεφαλικών κυττάρων για να αποκαλυφθεί πλήρως η εφαρμογή αυτής της αρχής σε άλλες νευρολογικές ασθένειες.
Ποντίκια MitoPark έχουν περιγραφεί προηγουμένως (31). Ποντίκια C57BL/6N με γονίδια Mfn2 που πλαισιώνουν την loxP έχουν περιγραφεί προηγουμένως (18) και έχουν διασταυρωθεί με ποντίκια L7-Cre (23). Οι διπλοί ετερόζυγοι απόγονοι που προέκυψαν διασταυρώθηκαν στη συνέχεια με ομόζυγα ποντίκια Mfn2loxP/Mfn2loxP για να δημιουργηθούν ειδικά για τον Purkinje knockouts γονιδίων για την Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Σε ένα υποσύνολο ζευγαρώματος, το αλληλόμορφο Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) εισήχθη μέσω πρόσθετων διασταυρώσεων (20). Όλες οι διαδικασίες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις ευρωπαϊκές, εθνικές και θεσμικές οδηγίες και εγκρίθηκαν από την LandesamtfürNatur του Umwelt και Verbraucherschutz, Βόρεια Ρηνανία-Βεστφαλία, Γερμανία. Η εργασία σε ζώα ακολουθεί επίσης τις οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ομοσπονδίας Ενώσεων Επιστημών Ζώων Εργαστηρίου.
Μετά την αναισθητοποίηση του τραχηλικού εξαρθρήματος της εγκύου, το έμβρυο ποντικού απομονώνεται (E13). Ο φλοιός ανατέμνεται σε Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) συμπληρωμένο με 10 mM Hepes και διοχετεύεται σε Dulbecco's Modified Eagle's Medium που περιέχει παπαΐνη (20 U/ml) και κυστεΐνη (1μg/ml). Ο ιστός επωάζεται σε DMEM) και διαχωρίζεται με ενζυματική πέψη (Ml) στους 37°C για 20 λεπτά και στη συνέχεια αλέθεται μηχανικά σε DMEM συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδών. Τα κύτταρα εμβολιάζονται σε γυάλινες καλυπτρίδες επικαλυμμένες με πολυλυσίνη σε πυκνότητα 2×106 ανά τρυβλίο καλλιέργειας 6 cm ή σε πυκνότητα 0,5×105 κύτταρα/cm2 για ανάλυση απεικόνισης. Μετά από 4 ώρες, το μέσο αντικαθίσταται με μέσο Neurobasal χωρίς ορό που περιέχει 1% συμπλήρωμα B27 και 0,5 mM GlutaMax. Οι νευρώνες στη συνέχεια διατηρήθηκαν στους 37°C και σε 5% CO2 καθ' όλη τη διάρκεια του πειράματος και τροφοδοτήθηκαν μία φορά την εβδομάδα. Προκειμένου να προκληθεί ανασυνδυασμός in vitro, χρησιμοποιήθηκαν 3 μl (τρυβλίο καλλιέργειας 24 φρεατίων) ή 0,5 μl (τρυβλίο 24 φρεατίων) του ακόλουθου φορέα του ιού AAV9 για την επεξεργασία νευρώνων τη δεύτερη ημέρα in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, αριθμός καταλόγου 105530-AAV9) και AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, αριθμός καταλόγου 105545-AAV9).
Τα συμπληρωματικά DNA ποντικού Mfn1 και Mfn2 (που ελήφθησαν από τα πλασμίδια Addgene #23212 και #23213, αντίστοιχα) σημειώνονται με την αλληλουχία V5 (GKPIPNPLLGLDST) στο C-τελικό άκρο και είναι συγχωνευμένα με το mCherry στο πλαίσιο μέσω της αλληλουχίας T2A. Το Grx1-roGFP2 είναι δώρο από την Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Αντικαθιστώντας την κασέτα tdTomato χρησιμοποιώντας συμβατικές μεθόδους κλωνοποίησης, η κασέτα υποκλωνοποιήθηκε στον σκελετό pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (αριθμός αναφοράς Addgene 28306) για να δημιουργηθούν οι φορείς pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 και pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Μια παρόμοια στρατηγική χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία του φορέα ελέγχου pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Για τη δημιουργία της κατασκευής AAV-shPCx, απαιτείται ένας πλασμιδιακός φορέας AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), ο οποίος περιέχει την αλληλουχία DNA που κωδικοποιεί το shRNA που στοχεύει την PCx ποντικού (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Υπό τον έλεγχο του υποκινητή U6, χρησιμοποιείται mCherry υπό τον έλεγχο του υποκινητή CMV. Η παραγωγή βοηθητικών φορέων AAV πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Cell Biolabs). Εν ολίγοις, χρησιμοποιήστε ένα πλασμίδιο μεταφοράς που φέρει mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) παροδική μεταμόσχευση των κυττάρων 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ή Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), καθώς και το πλασμίδιο συσκευασίας της πρωτεΐνης καψιδίου AAV1 και της βοηθητικής πρωτεΐνης, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο φωσφορικού ασβεστίου. Το ακατέργαστο υπερκείμενο του ιού ελήφθη με κύκλους κατάψυξης-απόψυξης σε λουτρό ξηρού πάγου/αιθανόλης και τα κύτταρα λύθηκαν σε αλατούχο διάλυμα φωσφορικών (PBS). Ο φορέας AAV καθαρίστηκε με ασυνεχή υπερφυγοκέντρηση βαθμίδωσης ιωδιξανόλης (24 ώρες στις 32.000 rpm και 4°C) και συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας φυγοκεντρικό φίλτρο Amicon ultra-15. Ο τίτλος γονιδιώματος των AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 αντίγραφο γονιδιώματος (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (54), μετρούμενος με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) και AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Οι πρωτογενείς νευρώνες αποξέστηκαν σε παγωμένο 1x PBS, σχηματίστηκαν σφαιρίδια και στη συνέχεια ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης 0,5% Triton X-100 / 0,5% δεοξυχολικού νατρίου/PBS που περιείχε φωσφατάση και αναστολέα πρωτεάσης (Roche). Η ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία δικινχονινικού οξέος (Thermo Fisher Scientific). Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου και στη συνέχεια στυπώθηκαν σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (GE Healthcare). Αποκλείστε τις μη ειδικές θέσεις και επωάστε με το πρωτογενές αντίσωμα (βλ. Πίνακα S1 για λεπτομέρειες) σε γάλα 5% σε TBST (φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με Tris με Tween), βήματα πλύσης και δευτερογενές αντίσωμα σε επωαστικό διάλυμα TBST. Επωάστε με το πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύχτα στους +4°C. Μετά το πλύσιμο, εφαρμόστε το δευτερογενές αντίσωμα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, επωάζοντας το ίδιο στυπόγραμμα με ένα αντίσωμα κατά της β-ακτίνης, επιβεβαιώθηκε το ίδιο φορτίο. Ανίχνευση με μετατροπή σε χημειοφωταύγεια και ενίσχυση της χημειοφωταύγειας (GE Healthcare).
Οι νευρώνες που είχαν προηγουμένως τοποθετηθεί σε γυάλινες καλυπτρίδες σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA)/PBS στο καθορισμένο χρονικό σημείο σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Οι καλυπτρίδες πρώτα διαποτίζονται με 0,1% Triton X-100/PBS για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού [3% αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA)/PBS]. Τη δεύτερη ημέρα, οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού και επωάστηκαν με το κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με φθοροφόρο για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, τα δείγματα πλύθηκαν καλά σε PBS με 4′,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI), η οποία αντιχρωματίστηκε και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκε στην αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου με Aqua-Poly/Mount.
Τα ποντίκια (αρσενικά και θηλυκά) αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση κεταμίνης (130 mg/kg) και ξυλαζίνης (10 mg/kg) και χορηγήθηκαν υποδόρια με αναλγητικό καρπροφαίνης (5 mg/kg) και τοποθετήθηκαν σε στερεοτακτικό όργανο (Kopf) εξοπλισμένο με θερμό επίθεμα. Αποκαλύψτε το κρανίο και χρησιμοποιήστε οδοντιατρικό τρυπάνι για να λεπτύνετε το τμήμα του παρεγκεφαλιδικού φλοιού που αντιστοιχεί στο οστό mis (από λάμδα: ουρά 1,8, πλάγια 1, που αντιστοιχεί στα λοβίδια IV και V). Χρησιμοποιήστε μια καμπύλη βελόνα σύριγγας για να δημιουργήσετε προσεκτικά μια μικρή τρύπα στο κρανίο για να αποφύγετε τη διαταραχή του αγγειακού συστήματος από κάτω. Στη συνέχεια, το λεπτό γυάλινο τριχοειδές εισάγεται αργά στην μικρο-οπή (από -1,3 έως -1 στην κοιλιακή πλευρά της σκληράς μήνιγγας) και 200 ​​έως 300 nl AAV εγχέονται στον μικρο-εγχυτήρα (Narishige) με χειροκίνητες σύριγγες (Narishige) αρκετές φορές σε χαμηλή πίεση για μια χρονική περίοδο 10 έως 20 λεπτών. Μετά την έγχυση, τοποθετήστε το τριχοειδές αγγείο για άλλα 10 λεπτά για να επιτρέψετε στον ιό να εξαπλωθεί πλήρως. Αφού αφαιρεθούν τα τριχοειδή αγγεία, το δέρμα συρράπτεται προσεκτικά για να ελαχιστοποιηθεί η φλεγμονή του τραύματος και να επιτραπεί στο ζώο να αναρρώσει. Τα ζώα έλαβαν αναλγητικά (κασποφαίνη) για αρκετές ημέρες μετά την επέμβαση, κατά τη διάρκεια των οποίων η φυσική τους κατάσταση παρακολουθούνταν προσεκτικά και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ευθανασία στο καθορισμένο χρονικό σημείο. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις ευρωπαϊκές, εθνικές και θεσμικές οδηγίες και εγκρίθηκαν από την LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Βόρεια Ρηνανία-Βεστφαλία, Γερμανία.
Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη (100 mg/kg) και ξυλαζίνη (10 mg/kg) και η καρδιά αιματώθηκε πρώτα με 0,1 M PBS και στη συνέχεια με 4% PFA σε PBS. Ο ιστός ανατομήθηκε και σταθεροποιήθηκε σε 4% PFA/PBS όλη τη νύχτα στους 4°C. Χρησιμοποιήθηκε ένα δονούμενο μαχαίρι (Leica Microsystems GmbH, Βιέννη, Αυστρία) για την παρασκευή οβελιαίων τομών (πάχους 50 μm) από τον σταθεροποιημένο εγκέφαλο σε PBS. Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, η χρώση των ελεύθερα επιπλεόντων τομών πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω (13) σε θερμοκρασία δωματίου και ανάδευση. Εν ολίγοις, πρώτα, οι ληφθείσες τομές διαπερατοποιήθηκαν με 0,5% Triton X-100/PBS για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. για ορισμένα επίτοπα (Pcx και Shmt2), με ρυθμιστικό διάλυμα tris-EDTA στους 80°C (pH 9) θερμάνετε τις τομές για 25 λεπτά αντί για αυτό το βήμα. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα (βλ. Πίνακα S1) σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (3% BSA/PBS) στους 4°C όλη τη νύχτα με ανάδευση. Την επόμενη ημέρα, οι τομές πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού και επωάστηκαν με το κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με φθοροφόρο για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι τομές πλύθηκαν καλά σε PBS, χρώστηκαν με DAPI και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με AquaPolymount σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου.
Για την απεικόνιση του δείγματος χρησιμοποιήθηκε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ (TCS SP8-X ή TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) εξοπλισμένο με λέιζερ λευκού φωτός και λέιζερ υπεριώδους διόδου 405. Διεγείροντας το φθοροφόρο και συλλέγοντας το σήμα με τον Υβριδικό Ανιχνευτή (HyDs), το λογισμικό LAS-X χρησιμοποιήθηκε για τη συλλογή στοιβαγμένων εικόνων σύμφωνα με τη δειγματοληψία Nyquist σε διαδοχική λειτουργία: για μη ποσοτικά πάνελ, πρόκειται για εξαιρετικά δυναμικά σήματα (για παράδειγμα, σε σωματικά κύτταρα και δενδρίτες) mtYFP (χρησιμοποιείται το HyD για την ανίχνευση του αριθμού των PN σε λειτουργία BrightR). Εφαρμόζεται πύλη από 0,3 έως 6 ns για τη μείωση του φόντου.
Απεικόνιση ταξινομημένων κυττάρων σε πραγματικό χρόνο. Μετά την ταξινόμηση σε μέσο Neurobasal-A που περιείχε 1% συμπλήρωμα B27 και 0,5 mM GlutaMax, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν αμέσως σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες επικαλυμμένες με πολυ-1-λυσίνη (μ-Slide8 Well, Ibidi, αριθμός καταλόγου 80826). Στη συνέχεια, διατηρήθηκαν στους 37°C και σε 5% CO2 για 1 ώρα, ώστε τα κύτταρα να καθιζάνουν. Η απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο πραγματοποιήθηκε σε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ Leica SP8 εξοπλισμένο με λευκό λέιζερ, HyD, αντικειμενικό φακό λαδιού 63×[αριθμητικό άνοιγμα (NA) 1,4] και θερμαντική βαθμίδα.
Το ποντίκι αναισθητοποιήθηκε γρήγορα με διοξείδιο του άνθρακα και αποκεφαλίστηκε, ο εγκέφαλος αφαιρέθηκε γρήγορα από το κρανίο και κόπηκε σε οβελιαία τομή πάχους 200 μm (για το πείραμα επισήμανσης 13C) ή πάχους 275 μm (για πειράματα δύο φωτονίων) γεμισμένη με τα ακόλουθα υλικά. Το παγωτό (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Γερμανία) γεμίζεται με τις ακόλουθες ουσίες: 125 mM παγωμένο, κορεσμένο με άνθρακα (95% O2 και 5% CO2) τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ACSF) χαμηλού Ca2 + NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου, 25 mM NaHCO3, 25 mM γλυκόζη, 0,5 mM CaCl2 και 3,5 mM MgCl2 (ωσμωτική πίεση 310 έως 330 mmol). Μεταφέρετε τις ληφθείσες φέτες εγκεφάλου σε θάλαμο προεπώασης που περιέχει υψηλότερη περιεκτικότητα σε Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-γλυκόζη, 1,0 mM CaCl2 και 2,0 mM MgCl2) Μέσο (pH 7,4 και 310 έως 320 mmol).
Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας απεικόνισης, οι τομές μεταφέρθηκαν σε ειδικό χώρο απεικόνισης και το πείραμα πραγματοποιήθηκε υπό συνεχή έγχυση ACSF σε σταθερή θερμοκρασία 32° έως 33°C. Για την απεικόνιση των τομών χρησιμοποιήθηκε ένα πολυφωτονικό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) εξοπλισμένο με αντικειμενικό φακό Leica 25x (NA 0.95, νερό), λέιζερ Ti:Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent). Μονάδα FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM της Grx1-roGFP2. Οι αλλαγές στην κυτταροπλασματική οξειδοαναγωγική κατάσταση των PNs μετρήθηκαν με FLIM δύο φωτονίων σε οβελιαίες τομές εγκεφάλου, όπου ο βιοαισθητήρας Grx1-roGFP2 στόχευσε PNs. Στο στρώμα PN, το πεδίο λήψης επιλέγεται περίπου 50 έως 80 μm κάτω από την επιφάνεια της τομής για να διασφαλιστεί ότι υπάρχει βιώσιμο PN (δηλαδή, η έλλειψη δομής με χάντρες ή νευρωνικών μορφολογικών αλλαγών κατά μήκος των δενδριτών) και ο διπλά θετικός αισθητήρας roGFP2 και το AAV που κωδικοποιούν shRNA PCx ή την αλληλουχία ελέγχου του (το καθένα εκφράζει ταυτόχρονα mCherry). Συλλέξτε εικόνες μονής στοίβας με ψηφιακό ζουμ 2x [μήκος κύματος διέγερσης: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Ανίχνευση: εσωτερική ομάδα φίλτρου HyD, ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης (FITC)] και μέσος όρος εικόνας εντός 2 έως 3 λεπτών χρησιμοποιούνται για να διασφαλιστεί ότι συλλέγονται αρκετά φωτόνια (1000 φωτόνια συνολικά) για την προσαρμογή της καμπύλης. Η ευαισθησία του ανιχνευτή Grx1-roGFP2 και η επαλήθευση των συνθηκών FLIM πραγματοποιήθηκαν παρακολουθώντας την τιμή διάρκειας ζωής του roGFP2 κατά την προσθήκη εξωγενούς 10 mM H2O2 στο ACSF έγχυσης (για μεγιστοποίηση της οξείδωσης, με αποτέλεσμα την αυξημένη διάρκεια ζωής) και στη συνέχεια την προσθήκη 2 mM διθειοθρεϊτόλης (ελαχιστοποιεί τον βαθμό αναγωγής, με αποτέλεσμα τη μείωση της διάρκειας ζωής) (Σχήμα S8, D έως G). Χρησιμοποιήστε το λογισμικό FLIMfit 5.1.1 για να αναλύσετε τα ληφθέντα αποτελέσματα, προσαρμόστε την καμπύλη μοναδικής εκθετικής απόσβεσης ολόκληρης της εικόνας στο μετρούμενο IRF (συνάρτηση απόκρισης οργάνου) και το χ2 είναι περίπου 1. Για τον υπολογισμό της διάρκειας ζωής ενός μόνο PN, η μάσκα γύρω από το νευρικό σώμα σχεδιάστηκε χειροκίνητα και η μέση διάρκεια ζωής σε κάθε μάσκα χρησιμοποιήθηκε για ποσοτικοποίηση.
Ανάλυση μιτοχονδριακού δυναμικού. Αφού η οξεία τομή επωάστηκε με 100 nM TMRM που προστέθηκε απευθείας στο αιματωμένο ACSF για 30 λεπτά, οι αλλαγές στο μιτοχονδριακό δυναμικό των PNs μετρήθηκαν με μικροσκόπιο δύο φωτονίων. Η απεικόνιση TMRM πραγματοποιήθηκε διεγείροντας τον ανιχνευτή στα 920 nm και χρησιμοποιώντας εσωτερικό HyD (ισοθειοκυανική τετραμεθυλοροδαμίνη: 585/40 nm) για τη συλλογή σημάτων. Χρησιμοποιώντας το ίδιο μήκος κύματος διέγερσης αλλά χρησιμοποιώντας διαφορετικό εσωτερικό HyD (FITC: 525/50) για την απεικόνιση του mtYFP. Χρησιμοποιήστε το πρόσθετο Image Calculator του ImageJ για να αξιολογήσετε το μιτοχονδριακό δυναμικό σε επίπεδο μεμονωμένου κυττάρου. Εν ολίγοις, η εξίσωση προσθήκης: σήμα = min (mtYFP, TMRM) χρησιμοποιείται για την αναγνώριση της μιτοχονδριακής περιοχής που εμφανίζει το σήμα TMRM σε Purkinje Somali στην ομοεστιακή εικόνα μονής στοίβας του αντίστοιχου καναλιού. Στη συνέχεια, η περιοχή των εικονοστοιχείων στην προκύπτουσα μάσκα ποσοτικοποιείται και στη συνέχεια ομαλοποιείται στην αντίστοιχη εικόνα κατωφλίου μονής στοίβας του καναλιού mtYFP για να ληφθεί το μιτοχονδριακό κλάσμα που δείχνει το μιτοχονδριακό δυναμικό.
Η εικόνα αποσυναρμολογήθηκε με το λογισμικό Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Για τις σαρωμένες εικόνες πλακιδίων, το μοντάζ ενός μόνο πλακιδίου γίνεται χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο αυτόματης συρραφής που παρέχεται από το λογισμικό LAS-X. Μετά τη βαθμονόμηση της εικόνας, χρησιμοποιήστε το ImageJ και το Adobe Photoshop για περαιτέρω επεξεργασία της εικόνας και ομοιόμορφη ρύθμιση της φωτεινότητας και της αντίθεσης. Χρησιμοποιήστε το Adobe Illustrator για την προετοιμασία γραφικών.
Ανάλυση εστίασης μιτοχονδριακού DNA. Ο αριθμός των αλλοιώσεων του μιτοχονδριακού DNA ποσοτικοποιήθηκε σε παρεγκεφαλιδικές τομές επισημασμένες με αντισώματα κατά του DNA με ομοεστιακό μικροσκόπιο. Κάθε περιοχή-στόχος δημιουργήθηκε για το κυτταρικό σώμα και τον πυρήνα κάθε κυττάρου και η αντίστοιχη περιοχή υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το πρόσθετο Multi Measure (λογισμικό ImageJ). Αφαιρέστε την πυρηνική περιοχή από την περιοχή του κυτταρικού σώματος για να λάβετε την κυτταροπλασματική περιοχή. Τέλος, χρησιμοποιήθηκε το πρόσθετο Analyze Particles (λογισμικό ImageJ) για την αυτόματη ποσοτικοποίηση των σημείων κυτταροπλασματικού DNA που υποδεικνύουν μιτοχονδριακό DNA στην εικόνα κατωφλίου και τα ληφθέντα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν στον μέσο όρο PN των ποντικών CTRL. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο μέσος αριθμός νουκλεοζιτών ανά κύτταρο.
Ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήστε το πρόσθετο Image Calculator του ImageJ για να αξιολογήσετε την έκφραση πρωτεΐνης σε PN σε επίπεδο ενός κυττάρου. Εν ολίγοις, στην ομοεστιακή εικόνα μονής στρώσης του αντίστοιχου καναλιού, μέσω της εξίσωσης: σήμα = min (mtYFP, αντίσωμα), αναγνωρίζεται η μιτοχονδριακή περιοχή που εμφανίζει ανοσοαντιδραστικότητα σε ένα συγκεκριμένο αντίσωμα στο Purkina. Στη συνέχεια, η περιοχή pixel στην προκύπτουσα μάσκα ποσοτικοποιείται και στη συνέχεια κανονικοποιείται στην αντίστοιχη εικόνα κατωφλίου μονής στοίβας του καναλιού mtYFP για να ληφθεί το μιτοχονδριακό κλάσμα της εμφανιζόμενης πρωτεΐνης.
Ανάλυση πυκνότητας κυττάρων Purkinje. Το πρόσθετο Cell Counter του ImageJ χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της πυκνότητας Purkinje διαιρώντας τον αριθμό των κυττάρων Purkinje που καταμετρήθηκαν με το μήκος του παρεγκεφαλιδικού δακτυλίου που καταλαμβάνεται από τα καταμετρημένα κύτταρα.
Προετοιμασία και συλλογή δείγματος. Οι εγκέφαλοι από την ομάδα ελέγχου και τα ποντίκια Mfn2cKO σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα 2% PFA/2,5% γλουταραλδεΰδης σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,1 M (PB) και στη συνέχεια παρασκευάστηκαν στεφανιαίες τομές χρησιμοποιώντας κροσσωτά (Leica Mikrosysteme GmbH, Βιέννη, Αυστρία) (Πάχος 50 έως 60 μm). Στη συνέχεια, σταθεροποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα PB σε 1% τετραοξείδιο του οζιδίου και 1,5% σιδηροκυανιούχο κάλιο σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι τομές πλύθηκαν τρεις φορές με απεσταγμένο νερό και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 70% αιθανόλη που περιείχε 1% οξικό ουρανύλιο για 20 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αλκοόλη και ενσωματώθηκαν σε εποξειδική ρητίνη Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, αριθμός καταλόγου 14040) μεταξύ γυάλινων πλακών επικαλυμμένων με πυρίτιο και τέλος στους 60°C πολυμερίστηκαν στον φούρνο για 48 ώρες. Επιλέχθηκε η περιοχή του παρεγκεφαλιδικού φλοιού και κόπηκαν υπερλεπτές τομές 50 nm σε Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Βιέννη, Αυστρία) και συλλέχθηκαν σε πλέγμα σχισμών χαλκού 2×1 mm επικαλυμμένο με μεμβράνη πολυστυρενίου. Οι τομές χρωματίστηκαν με διάλυμα 4% οξικού ουρανυλίου σε H2O για 10 λεπτά, πλύθηκαν με H2O αρκετές φορές, στη συνέχεια με κιτρικό μόλυβδο Reynolds σε H2O για 10 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκαν με H2O αρκετές φορές. Οι μικροφωτογραφίες λήφθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας ψηφιακή κάμερα TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, ΗΠΑ). Γερμανία).
Για ποντίκια που είχαν μολυνθεί με AAV, ο εγκέφαλος διαχωρίστηκε και τεμαχίστηκε σε μια οβελιαία τομή πάχους 1 mm και η παρεγκεφαλίδα εξετάστηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού για την αναγνώριση του δακτυλίου που είχε μολυνθεί με AAV (δηλαδή, που εκφράζει mCherry). Χρησιμοποιούνται μόνο πειράματα στα οποία η έγχυση AAV έχει ως αποτέλεσμα πολύ υψηλή απόδοση μεταγωγής του στρώματος κυττάρων Purkinje (δηλαδή σχεδόν ολόκληρου του στρώματος) σε τουλάχιστον δύο διαδοχικούς παρεγκεφαλιδικούς δακτυλίους. Ο βρόχος που έχει υποστεί μεταγωγή με AAV μικροδιαχωρίστηκε για ολονύκτια μετα-στερέωση (4% PFA και 2,5% γλουταραλδεΰδη σε ρυθμιστικό διάλυμα κοκοϊκού 0,1 M) και υποβλήθηκε σε περαιτέρω επεξεργασία. Για την ενσωμάτωση EPON, ο σταθεροποιημένος ιστός πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα κοκοϊκού νατρίου 0,1 M (Applichem) και επωάστηκε με 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) σε ρυθμιστικό διάλυμα κοκοϊκού νατρίου 0,1 M (Applichem) για 4 ώρες και στη συνέχεια πλύθηκε για 2 ώρες. Επαναλάβετε 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα κοκαμιδίου 0,1 M. Στη συνέχεια, η ανιούσα σειρά αιθανόλης χρησιμοποιήθηκε για την επώαση κάθε διαλύματος αιθανόλης στους 4°C για 15 λεπτά για την αφυδάτωση του ιστού. Ο ιστός μεταφέρθηκε σε προπυλενοξείδιο και επωάστηκε όλη τη νύχτα σε EPON (Sigma-Aldrich) στους 4°C. Τοποθετήστε τον ιστό σε φρέσκο ​​EPON σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες και στη συνέχεια τοποθετήστε τον στους 62°C για 72 ώρες. Χρησιμοποιήστε έναν υπερμικροτόμο (Leica Microsystems, UC6) και ένα διαμαντένιο μαχαίρι (Diatome, Biel, Ελβετία) για να κόψετε εξαιρετικά λεπτές τομές 70 nm και χρωματίστε με 1,5% οξικό ουρανύλιο για 15 λεπτά στους 37°C και χρωματίστε με διάλυμα κιτρικού μολύβδου για 4 λεπτά. Οι ηλεκτρονικές μικρογραφίες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης JEM-2100 Plus (JEOL) εξοπλισμένο με Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) και λογισμικό DigitalMicrograph (Gatan). Για την ανάλυση, ελήφθησαν ηλεκτρονικές μικρογραφίες με ψηφιακό ζουμ 5000× ή 10.000×.
Μορφολογική ανάλυση μιτοχονδρίων. Για όλες τις αναλύσεις, τα περιγράμματα των μεμονωμένων μιτοχονδρίων σκιαγραφήθηκαν χειροκίνητα σε ψηφιακές εικόνες χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Αναλύονται διαφορετικές μορφολογικές παράμετροι. Η μιτοχονδριακή πυκνότητα εκφράζεται ως ποσοστό που λαμβάνεται διαιρώντας τη συνολική μιτοχονδριακή επιφάνεια κάθε κυττάρου με την επιφάνεια του κυτταροπλάσματος (επιφάνεια κυτταροπλάσματος = επιφάνεια κυττάρου-επιφάνεια πυρήνα κυττάρου) × 100. Η στρογγυλότητα των μιτοχονδρίων υπολογίζεται με τον τύπο [4π∙(επιφάνεια/περίμετρος 2)]. Η μορφολογία των μιτοχονδρίων αναλύθηκε και χωρίστηκε σε δύο κατηγορίες («σωληνοειδή» και «φουσκάλα») σύμφωνα με τα κύρια σχήματά τους.
Ανάλυση αριθμού και πυκνότητας αυτοφαγοσωμάτων/λυσοσωμάτων. Χρησιμοποιήστε το λογισμικό ImageJ για να σκιαγραφήσετε χειροκίνητα τα περιγράμματα κάθε αυτοφαγοσώματος/λυσοσώματος στην ψηφιακή εικόνα. Η επιφάνεια του αυτοφαγοσώματος/λυσοσώματος εκφράζεται ως ποσοστό που υπολογίζεται διαιρώντας τη συνολική επιφάνεια δομής αυτοφαγοσώματος/λυσοσώματος κάθε κυττάρου με την επιφάνεια του κυτταροπλάσματος (επιφάνεια κυτταροπλάσματος = επιφάνεια κυττάρου-επιφάνεια πυρήνα) × 100. Η πυκνότητα των αυτοφαγοσωμάτων/λυσοσωμάτων υπολογίζεται διαιρώντας τον συνολικό αριθμό με τον αριθμό των δομών αυτοφαγοσωμάτων/λυσοσωμάτων ανά κύτταρο (σε όρους κυτταροπλασματικής επιφάνειας) (κυτοπλασματική επιφάνεια = επιφάνεια κυττάρου-επιφάνεια πυρήνα).
Επισήμανση για οξεία τομή και προετοιμασία δείγματος. Για πειράματα που απαιτούν επισήμανση με γλυκόζη, μεταφέρετε τις τομές εγκεφάλου οξείας φάσης σε θάλαμο προεπώασης, ο οποίος περιέχει κορεσμένο άνθρακα (95% O2 και 5% CO2), υψηλή περιεκτικότητα σε Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-γλυκόζη, 1,0 mM CaCl2 και 2,0 mM MgCl2, ρυθμισμένο σε pH 7,4 και 310 έως 320 mOsm), στον οποίο η γλυκόζη είναι 13C6- Υποκατάσταση γλυκόζης (Eurisotop, αριθμός καταλόγου CLM-1396). Για πειράματα που απαιτούν σήμανση με πυροσταφυλικό, μεταφέρετε τις τομές οξείας εγκεφαλικής δράσης σε ρυθμιστικό διάλυμα Ca2 + ACSF υψηλότερου Ca2 + (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-γλυκόζη, 1,0 mM CaCl2 και προσθέστε 2,0 mM MgCl2, ρυθμίστε το pH σε 7,4 και 310 έως 320 mOsm) και προσθέστε 1 mM 1-[1-13C]πυροσταφυλικό (Eurisotop, αριθμός καταλόγου CLM-1082). Επωάστε τις τομές για 90 λεπτά στους 37°C. Στο τέλος του πειράματος, οι τομές πλύθηκαν γρήγορα με υδατικό διάλυμα (pH 7,4) που περιείχε 75 mM ανθρακικό αμμώνιο και στη συνέχεια ομογενοποιήθηκαν σε 40:40:20 (v:v:v) ακετονιτρίλιο (ACN): μεθανόλη: νερό. Αφού οι τομές επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 21.000 g για 10 λεπτά στους 4°C και το διαυγές υπερκείμενο υγρό ξηράνθηκε σε συμπυκνωτή SpeedVac. Το προκύπτον ξηρό ίζημα μεταβολίτη αποθηκεύτηκε στους -80°C μέχρι την ανάλυση.
Ανάλυση υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας 13 αμινοξέων επισημασμένων με C. Για την ανάλυση υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (LC-MS), το ίζημα του μεταβολίτη επαναιωρήθηκε σε 75 μl νερού ποιότητας LC-MS (Honeywell). Μετά από φυγοκέντρηση στις 21.000 g για 5 λεπτά στους 4°C, 20 μl του διαυγασμένου υπερκείμενου χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση ροής αμινοξέων, ενώ το υπόλοιπο εκχύλισμα χρησιμοποιήθηκε αμέσως για ανάλυση ανιόντων (βλ. παρακάτω). Η ανάλυση αμινοξέων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το προηγουμένως περιγραφέν πρωτόκολλο παραγώγισης με βενζοϋλοχλωρίδιο (55, 56). Στο πρώτο βήμα, 10 μl ανθρακικού νατρίου 100 mM (Sigma-Aldrich) προστέθηκαν σε 20 μl εκχυλίσματος μεταβολίτη και στη συνέχεια 10 μl βενζοϋλοχλωριδίου 2% (Sigma-Aldrich) προστέθηκαν στο ACN ποιότητας LC. Το δείγμα αναδεύτηκε για λίγο με στροβιλισμό και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 21.000 g για 5 λεπτά στους 20°C. Μεταφέρετε το καθαρισμένο υπερκείμενο σε ένα φιαλίδιο αυτόματου δειγματολήπτη 2 ml με κωνικό γυάλινο ένθετο (όγκος 200 μl). Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα εξαιρετικά υψηλής απόδοσης Acquity iClass LC (Waters) συνδεδεμένο με τον φασματόμετρο μάζας υψηλής ανάλυσης Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Για την ανάλυση, 2 μl του παράγωγου δείγματος εγχύθηκαν σε μια στήλη υψηλής αντοχής πυριτίου T3 100×1,0 mm (Waters) που περιείχε σωματίδια 1,8 μm. Ο ρυθμός ροής είναι 100 μl/min και το σύστημα ρυθμιστικού διαλύματος αποτελείται από το ρυθμιστικό διάλυμα Α (10 mM μυρμηκικό αμμώνιο και 0,15% μυρμηκικό οξύ σε νερό) και το ρυθμιστικό διάλυμα Β (ACN). Η κλίση έχει ως εξής: 0%B στα 0 λεπτά· 0%B. 0 έως 15% Β στα 0 έως 0,1 λεπτά· 15 έως 17% Β στα 0,1 έως 0,5 λεπτά· Β στα 17 έως 55% στα 0,5 έως 14 λεπτά· Β στα 55 έως 70% στα 14 έως 14,5 λεπτά· στα 14,5 έως 70 έως 100% Β στα 18 λεπτά· 100% Β στα 18 έως 19 λεπτά· 100 έως 0% Β στα 19 έως 19,1 λεπτά· 0% Β στα 19,1 έως 28 λεπτά (55, 56). Το φασματόμετρο μάζας QE-HF λειτουργεί σε λειτουργία θετικού ιονισμού με εύρος μάζας m/z (λόγος μάζας/φορτίου) από 50 έως 750. Η εφαρμοζόμενη ανάλυση είναι 60.000 και ο ιοντικός στόχος ελέγχου κέρδους (AGC) που λαμβάνεται είναι 3×106 και ο μέγιστος χρόνος ιόντων είναι 100 χιλιοστά του δευτερολέπτου. Η θερμαινόμενη πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) λειτουργεί με τάση ψεκασμού 3,5 kV, τριχοειδή θερμοκρασία 250°C, ροή αέρα μανδύα 60 AU (αυθαίρετες μονάδες) και βοηθητική ροή αέρα 20 AU. 250°C. Ο φακός S έχει ρυθμιστεί στις 60 AU.
Ανάλυση ανιοντικής χρωματογραφίας-MS οργανικών οξέων σημασμένων με 13C. Το υπόλοιπο ίζημα μεταβολίτη (55 μl) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ιοντικής χρωματογραφίας Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) συνδεδεμένο με ένα φασματόμετρο μάζας QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Εν ολίγοις, 5 μl εκχυλίσματος μεταβολίτη εγχύθηκαν σε μια στήλη Dionex IonPac AS11-HC εξοπλισμένη με HPLC (2 mm×250 mm, μέγεθος σωματιδίων 4μm, Thermo Fisher Scientific) σε λειτουργία μερικού βρόχου push-in με λόγο πλήρωσης 1.) Στήλη προστασίας Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Η θερμοκρασία της στήλης διατηρείται στους 30°C και ο αυτόματος δειγματολήπτης ρυθμίζεται στους 6°C. Χρησιμοποιήστε ένα φυσίγγιο υδροξειδίου του καλίου που παρέχεται με απιονισμένο νερό για να δημιουργήσετε μια βαθμίδα υδροξειδίου του καλίου μέσω της γεννήτριας έκλουσης. Διαχωρισμός μεταβολιτών με ρυθμό ροής 380 μl/min, εφαρμόζοντας την ακόλουθη διαβάθμιση: 0 έως 3 λεπτά, 10 mM KOH· 3 έως 12 λεπτά, 10 έως 50 mM KOH· 12 έως 19 λεπτά, 50 έως 100 mM KOH· 19 έως 21 λεπτά, 100 mM KOH· 21 έως 21,5 λεπτά, 100 έως 10 mM KOH. Η στήλη επανισορροπήθηκε υπό 10 mM KOH για 8,5 λεπτά.
Οι εκλουσμένοι μεταβολίτες συνδυάζονται με ένα ρεύμα συμπληρώματος ισοπροπανόλης 150μl/min μετά τη στήλη και στη συνέχεια κατευθύνονται σε ένα φασματόμετρο μάζας υψηλής ανάλυσης που λειτουργεί σε λειτουργία αρνητικού ιονισμού. Το MS παρακολουθεί το εύρος μάζας από m/z 50 έως 750 με ανάλυση 60.000. Το AGC έχει ρυθμιστεί σε 1×106 και ο μέγιστος χρόνος ιόντων διατηρείται στα 100 ms. Η θερμαινόμενη πηγή ESI λειτουργούσε με τάση ψεκασμού 3,5 kV. Οι άλλες ρυθμίσεις της πηγής ιόντων είναι οι εξής: τριχοειδής θερμοκρασία 275°C, ροή αερίου θήκης, 60 AU, ροή βοηθητικού αερίου, 20 AU στους 300°C και ρύθμιση φακού S στις 60 AU.
Ανάλυση δεδομένων μεταβολιτών με σήμανση 13C. Χρησιμοποιήστε το λογισμικό TraceFinder (έκδοση 4.2, Thermo Fisher Scientific) για την ανάλυση δεδομένων της αναλογίας ισοτόπων. Η ταυτότητα κάθε ένωσης επαληθεύτηκε από μια αξιόπιστη ένωση αναφοράς και αναλύθηκε ανεξάρτητα. Για την εκτέλεση ανάλυσης εμπλουτισμού ισοτόπων, η περιοχή του εκχυλισμένου ιοντικού χρωματογραφήματος (XIC) κάθε ισοτόπου 13C (Mn) εκχυλίστηκε από [M + H]+, όπου n είναι ο αριθμός άνθρακα της ένωσης-στόχου, που χρησιμοποιείται για την ανάλυση αμινοξέων ή [MH]+ χρησιμοποιείται για την ανάλυση ανιόντων. Η ακρίβεια μάζας του XIC είναι μικρότερη από πέντε μέρη ανά εκατομμύριο και η ακρίβεια του χρόνου RT είναι 0,05 λεπτά. Η ανάλυση εμπλουτισμού εκτελείται υπολογίζοντας την αναλογία κάθε ανιχνευόμενου ισοτόπου προς το άθροισμα όλων των ισοτόπων της αντίστοιχης ένωσης. Αυτές οι αναλογίες δίνονται ως ποσοστιαίες τιμές για κάθε ισότοπο και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μοριακό ποσοστό εμπλουτισμού (MPE), όπως περιγράφηκε προηγουμένως (42).
Το κατεψυγμένο ίζημα νευρώνων ομογενοποιήθηκε σε παγωμένη μεθανόλη 80% (v/v), στροβιλίστηκε και επωάστηκε στους -20°C για 30 λεπτά. Ανακινήστε ξανά το δείγμα σε στροβιλισμό και ανακατέψτε στους +4°C για 30 λεπτά. Το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις 21.000 g για 5 λεπτά στους 4°C και στη συνέχεια το υπερκείμενο υγρό που προέκυψε συλλέχθηκε και ξηράνθηκε χρησιμοποιώντας συμπυκνωτή SpeedVac στους 25°C για επακόλουθη ανάλυση. Όπως περιγράφεται παραπάνω, πραγματοποιήθηκε ανάλυση LC-MS στα αμινοξέα των ταξινομημένων κυττάρων. Χρησιμοποιώντας το TraceFinder (έκδοση 4.2, Thermo Fisher Scientific), η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μονοισοτοπική μάζα κάθε ένωσης. Η ομαλοποίηση των δεδομένων μεταβολιτών σε ποσοστιαία βάση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού preprocessCore (57).
Προετοιμασία τομής. Το ποντίκι αναισθητοποιήθηκε γρήγορα με διοξείδιο του άνθρακα και αποκεφαλίστηκε, ο εγκέφαλος αφαιρέθηκε γρήγορα από το κρανίο και χρησιμοποιήθηκε το γεμάτο με πάγο δονούμενο μαχαίρι (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Γερμανία) για να κοπεί σε οβελιαίες τομές 300 έως 375 μm. Αεριοποίηση ψυχρού άνθρακα (95% O2 και 5% CO2). Χαμηλή περιεκτικότητα σε Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-γλυκόζη, 1,0 mM CaCl2 και 6,0 mM MgCl2. Ρύθμιση pH σε 7,4 και 310 έως 330 mOsm). Μεταφέρετε τις ληφθείσες τομές εγκεφάλου σε θάλαμο που περιέχει υψηλότερη περιεκτικότητα σε Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-γλυκόζη, 4,0 mM CaCl2 και mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 και 310 έως 320 mOsm). Αποθηκεύστε τις τομές για 20 έως 30 λεπτά, ώστε να μπορούν να αποκατασταθούν πριν από την καταγραφή.
καταγραφή. Για όλες τις καταγραφές χρησιμοποιήθηκε μια σκηνή μικροσκοπίου εξοπλισμένη με σταθερό θάλαμο καταγραφής και έναν αντικειμενικό φακό εμβάπτισης στο νερό 20x (Scientifica). Τα πιθανολογούμενα κύτταρα Purkinje ταυτοποιήθηκαν με βάση (i) το μέγεθος του σώματος, (ii) την ανατομική θέση της παρεγκεφαλίδας και (iii) την έκφραση του φθορίζοντος γονιδίου αναφοράς mtYFP. Η πιπέτα patch με αντίσταση στην άκρη από 5 έως 11 megohms εξάγεται από ένα τριχοειδές βοριοπυριτικό γυαλί (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Γερμανία) και μια οριζόντια πιπέτα Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Όλες οι καταγραφές πραγματοποιήθηκαν από τον ενισχυτή σφιγκτήρα npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Γερμανία), ο οποίος ελέγχθηκε από το λογισμικό Signal (έκδοση 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο). Το πείραμα καταγράφηκε με ρυθμό δειγματοληψίας 12,5 kHz. Το σήμα φιλτράρεται με δύο φίλτρα Bessel βραχείας διέλευσης με συχνότητες αποκοπής 1,3 και 10 kHz αντίστοιχα. Η χωρητικότητα της μεμβράνης και της πιπέτας αντισταθμίζεται από το κύκλωμα αντιστάθμισης χρησιμοποιώντας τον ενισχυτή. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν υπό τον έλεγχο μιας κάμερας Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Γερμανία), η οποία ελέγχθηκε από το λογισμικό Hokawo (έκδοση 2.8, Hamamatsu, Gerden, Γερμανία).
Συνήθης διαμόρφωση και ανάλυση ολόκληρου του κυττάρου. Αμέσως πριν από την καταγραφή, γεμίστε την πιπέτα με το εσωτερικό διάλυμα που περιέχει τις ακόλουθες ουσίες: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM γλυκονικό κάλιο, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM τριφωσφορική γουανοσίνη (GTP) (Na) και 10,0 mM φωσφορική κρεατινίνη. Το pH ρυθμίστηκε σε 7,25 και η οσμωτική πίεση ήταν 290 mOsm (σακχαρόζη). Αμέσως μετά την εφαρμογή δύναμης 0 pA για τη ρήξη της μεμβράνης, μετρήθηκε το δυναμικό ηρεμίας της μεμβράνης. Η αντίσταση εισόδου μετράται εφαρμόζοντας υπερπολωμένα ρεύματα -40, -30, -20 και -10 pA. Μετρήστε το μέγεθος της απόκρισης τάσης και χρησιμοποιήστε τον νόμο του Ohm για να υπολογίσετε την αντίσταση εισόδου. Η αυθόρμητη δραστηριότητα καταγράφηκε σε μια αμπεροτσιμπίδα τάσης για 5 λεπτά και η sPSC αναγνωρίστηκε και μετρήθηκε στο Igor Pro (έκδοση 32 7.01, WaveMetrics, Λίμνη Oswego, Όρεγκον, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας ένα ημιαυτόματο σενάριο αναγνώρισης. Η καμπύλη IV και το ρεύμα σταθερής κατάστασης μετρώνται αμπεροτσιμπώντας την μπαταρία σε διαφορετικά δυναμικά (ξεκινώντας από -110 mV) και αυξάνοντας την τάση σε βήματα των 5 mV. Η παραγωγή AP δοκιμάστηκε εφαρμόζοντας ένα ρεύμα αποπόλωσης. Ακαμποτσιμπήστε το στοιχείο στα -70 mV ενώ εφαρμόζετε έναν παλμό ρεύματος αποπόλωσης. Ρυθμίστε το μέγεθος βήματος κάθε μονάδας καταγραφής ξεχωριστά (10 έως 60 pA). Υπολογίστε τη μέγιστη συχνότητα AP μετρώντας χειροκίνητα τις αιχμές παλμού που προκαλούν την υψηλότερη συχνότητα AP. Το κατώφλι AP αναλύεται χρησιμοποιώντας τη δεύτερη παράγωγο του παλμού αποπόλωσης που ενεργοποιεί πρώτα ένα ή περισσότερα AP.
Διαμόρφωση και ανάλυση διάτρητου επιθέματος. Πραγματοποιήστε καταγραφή διάτρητου επιθέματος χρησιμοποιώντας τυπικά πρωτόκολλα. Χρησιμοποιήστε μια πιπέτα χωρίς ATP και GTP που δεν περιέχει τα ακόλουθα συστατικά: 128 mM γλυκονικό Κ, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA και 2 mM MgCl2 και ρυθμίστε το pH σε 7,2 (χρησιμοποιώντας KOH). Το ATP και το GTP παραλείπονται από το ενδοκυτταρικό διάλυμα για να αποφευχθεί η ανεξέλεγκτη διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης. Η πιπέτα του επιθέματος γεμίζεται με ένα εσωτερικό διάλυμα που περιέχει αμφοτερικίνη (περίπου 200 έως 250μg/ml· G4888, Sigma-Aldrich) για να ληφθεί μια καταγραφή διάτρητου επιθέματος. Η αμφοτερικίνη διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (τελική συγκέντρωση: 0,1 έως 0,3%· DMSO· D8418, Sigma-Aldrich). Η συγκέντρωση του DMSO που χρησιμοποιήθηκε δεν είχε σημαντική επίδραση στους νευρώνες που μελετήθηκαν. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας διάτρησης, η αντίσταση του καναλιού (Ra) παρακολουθούνταν συνεχώς και το πείραμα ξεκίνησε αφού σταθεροποιήθηκε το πλάτος του Ra και το AP (20-40 λεπτά). Η αυθόρμητη δραστηριότητα μετρήθηκε σε μια αμπεροτσιμπίδα τάσης ή/και ρεύματος για 2 έως 5 λεπτά. Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Igor Pro (έκδοση 7.05.2, WaveMetrics, ΗΠΑ), το Excel (έκδοση 2010, Microsoft Corporation, Redmond, ΗΠΑ) και το GraphPad Prism (έκδοση 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Για την αναγνώριση αυθόρμητων AP, χρησιμοποιείται το πρόσθετο NeuroMatic v3.0c της IgorPro. Αυτόματη αναγνώριση AP χρησιμοποιώντας ένα δεδομένο όριο, το οποίο ρυθμίζεται ξεχωριστά για κάθε εγγραφή. Χρησιμοποιώντας το διάστημα αιχμής, προσδιορίστε τη συχνότητα αιχμής με τη μέγιστη στιγμιαία συχνότητα αιχμής και τη μέση συχνότητα αιχμής.
Απομόνωση PN. Προσαρμόζοντας το προηγουμένως δημοσιευμένο πρωτόκολλο, τα PN καθαρίστηκαν από την παρεγκεφαλίδα ποντικού σε ένα συγκεκριμένο στάδιο (58). Εν ολίγοις, η παρεγκεφαλίδα ανατομήθηκε και τεμαχίστηκε σε παγωμένο μέσο διάσπασης [χωρίς HBSS Ca2+ και Mg2+, συμπληρωμένο με 20 mM γλυκόζη, πενικιλίνη (50 U/ml) και στρεπτομυκίνη (0,05 mg/ml)] και στη συνέχεια το μέσο χωνεύτηκε σε παπαΐνη [HBSS, συμπληρωμένο με 1-κυστεΐνη·HCl (1 mg/ml), παπαΐνη (16 U/ml) και δεοξυριβονουκλεάση Ι (DNase I· 0,1 mg/ml)]. Υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 30 λεπτά στους 30°C. Αρχικά, πλύνετε τους ιστούς σε μέσο HBSS που περιέχει βλέννα αυγού (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) και DNase (0,1 mg/ml) σε θερμοκρασία δωματίου για να αποτρέψετε την ενζυμική πέψη και, στη συνέχεια, στο μέσο HBSS που περιέχει 20 mM γλυκόζη. Η απαλή άλεση σε HBSS, πενικιλίνης (50 U/ml), στρεπτομυκίνης (0,05 mg/ml) και DNase (0,1 mg/ml) απελευθερώνει μεμονωμένα κύτταρα. Το προκύπτον κυτταρικό εναιώρημα διηθήθηκε μέσω φίλτρου κυττάρων 70 μm, στη συνέχεια τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση (11-10 rpm, 5 λεπτά, 4°C) και επαναιωρήθηκαν σε μέσο διαλογής [HBSS, συμπληρωμένο με 20 mM γλυκόζη, 20% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλίνη (50 U/ml) και στρεπτομυκίνη (0,05 mg/ml)]. Αξιολογήστε τη βιωσιμότητα των κυττάρων με ιωδιούχο προπίδιο και προσαρμόστε την πυκνότητα των κυττάρων σε 1×106 έως 2×106 κύτταρα/ml. Πριν από την κυτταρομετρία ροής, το εναιώρημα διηθήθηκε μέσω ενός φίλτρου κυττάρων 50 μm.
Κυτταρομετρητής ροής. Η διαλογή κυττάρων πραγματοποιήθηκε στους 4°C χρησιμοποιώντας το μηχάνημα FACSAria III (BD Biosciences) και το λογισμικό FACSDiva (BD Biosciences, έκδοση 8.0.1). Το κυτταρικό εναιώρημα ταξινομήθηκε χρησιμοποιώντας ακροφύσιο 100 μm υπό πίεση 20 psi με ρυθμό ~2800 συμβάντων/δευτερόλεπτο. Δεδομένου ότι τα παραδοσιακά κριτήρια ελέγχου (μέγεθος κυττάρου, διτροπική διάκριση και χαρακτηριστικά σκέδασης) δεν μπορούν να διασφαλίσουν τη σωστή απομόνωση του PN από άλλους τύπους κυττάρων, η στρατηγική ελέγχου καθορίζεται με βάση την άμεση σύγκριση της έντασης και του αυτοφθορισμού YFP σε ποντίκια mitoYFP+ ​​​​και ελέγχου mitoYFP −. Το YFP διεγείρεται ακτινοβολώντας το δείγμα με μια γραμμή λέιζερ 488 nm και το σήμα ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο ζώνης διέλευσης 530/30 nm. Σε ποντίκια mitoYFP+ ​​​​, η σχετική ισχύς του γονιδίου αναφοράς Rosa26-mitoYFP χρησιμοποιείται επίσης για τη διάκριση θραυσμάτων νευρωνικού σώματος και νευραξόνων. Το 7-AAD διεγείρεται με κίτρινο λέιζερ 561 nm και ανιχνεύεται με ζωνοπερατό φίλτρο 675/20 nm για τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων. Προκειμένου να διαχωριστούν ταυτόχρονα τα αστροκύτταρα, το κυτταρικό εναιώρημα χρωματίστηκε με ACSA-2-APC, στη συνέχεια το δείγμα ακτινοβολήθηκε με γραμμή λέιζερ 640 nm και χρησιμοποιήθηκε ζωνοπερατό φίλτρο 660/20 nm για την ανίχνευση του σήματος.
Τα συλλεγμένα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση (1110 rpm, 5 λεπτά, 4°C) και αποθηκεύτηκαν στους -80°C μέχρι τη χρήση. Τα ποντίκια Mfn2cKO και τα νεογνά τους ταξινομήθηκαν την ίδια ημέρα για την ελαχιστοποίηση της διαδικαστικής μεταβλητότητας. Η παρουσίαση και η ανάλυση δεδομένων FACS πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Όπως αναφέρθηκε παραπάνω (59), η PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιείται για την απομόνωση του DNA από τους ταξινομημένους νευρώνες για επακόλουθη ποσοτικοποίηση του mtDNA. Η γραμμικότητα και η ευαισθησία κατωφλίου ελέγχθηκαν αρχικά με την εκτέλεση qPCR σε διαφορετικούς αριθμούς κυττάρων. Εν ολίγοις, συλλέξτε 300 PN σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που αποτελείται από 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 και πρωτεϊνάση Κ (200 ng/ml) και επωάστε τα στους 55°C για 120 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω στους 95°C για 10 λεπτά για να διασφαλιστεί η πλήρης απενεργοποίηση της πρωτεϊνάσης Κ. Χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή TaqMan (Thermo Fisher) ειδικό για το mt-Nd1, το mtDNA μετρήθηκε με ημιποσοτική PCR στο σύστημα PCR πραγματικού χρόνου 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Science, αριθμός καταλόγου Mm04225274_s1), γονίδια mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, αριθμός καταλόγου AIVI3E8) και γονίδια 18S (Thermo Fisher Scientific, αριθμός καταλόγου Hs99999901_s1).
Παρασκευή δείγματος πρωτεώματος. Με θέρμανση του διαλύματος στους 95°C για 10 λεπτά και υπερήχηση, στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [6 M χλωριούχος γουανιδίνη, 10 mM υδροχλωρική τρις(2-καρβοξυαιθυλ)φωσφίνη, 10 mM χλωροακεταμίδιο και 100 mM κατεψυγμένα σφαιρίδια νευρώνων tris-Lyse σε HCl]. Σε Bioruptor (Diagenode) για 10 λεπτά (30 δευτερόλεπτα παλμός / 30 δευτερόλεπτα παύση). Το δείγμα αραιώθηκε 1:10 σε 20 mM tris-HCl (pH 8,0), αναμίχθηκε με 300 ng χρυσού τρυψίνης (Promega) και επωάστηκε όλη τη νύχτα στους 37°C για να επιτευχθεί πλήρης πέψη. Τη δεύτερη ημέρα, το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις 20.000 g για 20 λεπτά. Το υπερκείμενο αραιώθηκε με 0,1% μυρμηκικό οξύ και το διάλυμα αφαλατώθηκε με αυτοσχέδια StageTips. Το δείγμα ξηράνθηκε σε όργανο SpeedVac (συγκέντρωση Eppendorf plus 5305) στους 45°C και στη συνέχεια το πεπτίδιο αιωρήθηκε σε μυρμηκικό οξύ 0,1%. Όλα τα δείγματα παρασκευάστηκαν ταυτόχρονα από το ίδιο άτομο. Για την ανάλυση δειγμάτων αστροκυττάρων, 4 μg αφαλατωμένων πεπτιδίων επισημάνθηκαν με μια ετικέτα μάζας tandem (TMT10plex, αριθμός καταλόγου 90110, Thermo Fisher Scientific) με αναλογία πεπτιδίου προς αντιδραστήριο TMT 1:20. Για την επισήμανση TMT, 0,8 mg αντιδραστηρίου TMT επαναιωρήθηκαν σε 70 μl άνυδρου ACN και το ξηρό πεπτίδιο ανασυστάθηκε σε 9 μl TEAB (διττανθρακικό τριαιθυλαμμώνιο) 0,1 M, στο οποίο προστέθηκαν 7 μl αντιδραστηρίου TMT σε ACN. Η συγκέντρωση ήταν 43,75%. Μετά από 60 λεπτά επώασης, η αντίδραση σβήστηκε με 2 μl υδροξυλαμίνης 5%. Τα επισημασμένα πεπτίδια συλλέχθηκαν, ξηράνθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε 200 μl μυρμηκικού οξέος (FA) 0,1%, διαιρέθηκαν σε δύο μέρη και στη συνέχεια αφαλατώθηκαν χρησιμοποιώντας αυτοσχέδιες StageTips. Χρησιμοποιώντας υγρό χρωματογράφο εξαιρετικά υψηλής απόδοσης UltiMate 3000 (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), το ένα από τα δύο μισά κλασματώθηκε σε χρωματογραφική στήλη Acquity 1 mm x 150 mm γεμάτη με σωματίδια C18 130Å1,7 μm (Waters, αρ. καταλόγου SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Διαχωρίστε τα πεπτίδια με ρυθμό ροής 30 μl/min, διαχωρίστε από το ρυθμιστικό διάλυμα Β 1% έως 50% για 85 λεπτά με σταδιακή κλίση 96 λεπτών, από το ρυθμιστικό διάλυμα Β 50% έως 95% για 3 λεπτά και στη συνέχεια 8 λεπτά για το ρυθμιστικό διάλυμα Β 95%. Το ρυθμιστικό διάλυμα Α είναι 5% ACN και 10 mM όξινο ανθρακικό αμμώνιο (ABC), και το ρυθμιστικό διάλυμα Β είναι 80% ACN και 10 mM ABC. Συλλέγετε τα κλάσματα κάθε 3 λεπτά και συνδυάστε τα σε δύο ομάδες (1 + 17, 2 + 18, κ.λπ.) και ξηράνετε τα σε φυγόκεντρο κενού.
Ανάλυση LC-MS/MS. Για φασματομετρία μάζας, τα πεπτίδια (αριθμός r119.aq) διαχωρίστηκαν σε αναλυτική στήλη PicoFrit 25 cm και εσωτερικής διαμέτρου 75 μm (νέος αντικειμενικός φακός, αριθμός εξαρτήματος PF7508250) εξοπλισμένη με μέσο ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), χρησιμοποιώντας EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Γερμανία). Η στήλη διατηρήθηκε στους 50°C. Τα ρυθμιστικά διαλύματα Α και Β είναι 0,1% μυρμηκικό οξύ σε νερό και 0,1% μυρμηκικό οξύ σε 80% ACN, αντίστοιχα. Τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν από ρυθμιστικό διάλυμα Β 6% έως 31% για 65 λεπτά και από ρυθμιστικό διάλυμα Β 31% έως 50% για 5 λεπτά με διαβάθμιση 200 nl/min. Τα εκλουσμένα πεπτίδια αναλύθηκαν σε φασματόμετρο μάζας Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Η μέτρηση m/z του προδρόμου πεπτιδίου πραγματοποιείται με ανάλυση 120.000 στην περιοχή από 350 έως 1500 m/z. Χρησιμοποιώντας 27% κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης, ο ισχυρότερος πρόδρομος με κατάσταση φορτίου από 2 έως 6 επιλέγεται για διάσπαση υψηλής ενέργειας με παγίδα C (HCD). Ο χρόνος κύκλου ορίζεται σε 1 s. Η τιμή m/z του πεπτιδικού θραύσματος μετρήθηκε στην παγίδα ιόντων χρησιμοποιώντας τον μικρότερο στόχο AGC 5×104 και τον μέγιστο χρόνο έγχυσης 86 ms. Μετά τον κατακερματισμό, ο πρόδρομος τοποθετήθηκε στη λίστα δυναμικού αποκλεισμού για 45 s. Τα πεπτίδια που έχουν επισημανθεί με TMT διαχωρίστηκαν σε μια στήλη Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, αριθμός καταλόγου 164942) και τα φάσματα μετανάστευσης αναλύθηκαν σε ένα φασματόμετρο μάζας Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) εξοπλισμένο με εξοπλισμό ιόντων ασύμμετρης κυματομορφής υψηλού πεδίου (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) που λειτουργεί σε δύο τάσεις αντιστάθμισης −50 και −70 V. Το MS3 που επιλέχθηκε με βάση τον πρόδρομο συγχρονισμού χρησιμοποιείται για τη μέτρηση σήματος ιόντων αναφοράς TMT. Ο διαχωρισμός πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε στο EASY-nLC 1200, χρησιμοποιώντας γραμμική έκλουση βαθμίδωσης 90%, με συγκέντρωση ρυθμιστικού διαλύματος 6% έως 31%. το ρυθμιστικό διάλυμα Α ήταν 0,1% FA και το ρυθμιστικό διάλυμα Β ήταν 0,1% FA και 80% ACN. Η αναλυτική στήλη λειτουργεί στους 50°C. Χρησιμοποιήστε το FreeStyle (έκδοση 1.6, Thermo Fisher Scientific) για να διαχωρίσετε το αρχικό αρχείο σύμφωνα με την τάση αντιστάθμισης FAIMS.
Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών. Χρησιμοποιώντας την ενσωματωμένη μηχανή αναζήτησης Andromeda, τα αρχικά δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το MaxQuant έκδοση 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Εκτός από τις αλληλουχίες Cre recombinase και YFP που ελήφθησαν από την Aequorea victoria, αναζητήθηκαν φάσματα θραυσμάτων πεπτιδίων για την κανονική αλληλουχία και την αλληλουχία ισομορφών του πρωτεώματος αναφοράς ποντικού (Proteome ID UP000000589, ληφθείσα από την UniProt τον Μάιο του 2017). Η οξείδωση μεθειονίνης και η ακετυλίωση στο Ν-τελικό άκρο της πρωτεΐνης ορίστηκαν ως μεταβλητές τροποποιήσεις. Η μεθυλίωση κυστεΐνης καρβαμοϋλίου ορίστηκε ως σταθερές τροποποιήσεις. Οι παράμετροι πέψης ορίζονται σε «ειδικότητα» και «θρυψίνη/P». Ο ελάχιστος αριθμός πεπτιδίων και πεπτιδίων ξυραφιού που χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών είναι 1. Ο ελάχιστος αριθμός μοναδικών πεπτιδίων είναι 0. Υπό τις συνθήκες αντιστοίχισης χάρτη πεπτιδίων, ο ρυθμός ταυτοποίησης πρωτεϊνών ήταν 0,01. Η επιλογή «Δεύτερο Πεπτίδιο» είναι ενεργοποιημένη. Χρησιμοποιήστε την επιλογή «match between runs» (αντιστοίχιση μεταξύ εκτελέσεων) για να μεταφέρετε επιτυχημένες ταυτοποιήσεις μεταξύ διαφορετικών αρχικών αρχείων. Χρησιμοποιήστε την ελάχιστη αναλογία LFQ με αριθμό 1 για ποσοτικοποίηση χωρίς ετικέτα (LFQ) (60). Η ένταση του LFQ φιλτράρεται για τουλάχιστον δύο έγκυρες τιμές σε τουλάχιστον μία ομάδα γονότυπου σε κάθε χρονικό σημείο και παρεκβάλλεται από μια κανονική κατανομή με πλάτος 0,3 και μετακίνηση προς τα κάτω 1,8. Χρησιμοποιήστε την υπολογιστική πλατφόρμα Perseus (https://maxquant.net/perseus/) και το R (https://r-project.org/) για την ανάλυση των αποτελεσμάτων του LFQ. Για την ανάλυση διαφορικής έκφρασης χρησιμοποιήθηκε μια αμφίδρομη δοκιμή μέτριας t από το πακέτο λογισμικού limma (61). Η διερευνητική ανάλυση δεδομένων πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally και pheatmap. Τα πρωτεωμικά δεδομένα που βασίζονται σε TMT αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το MaxQuant έκδοση 1.6.10.43. Αναζητήστε ακατέργαστα δεδομένα πρωτεωμικής από τη βάση δεδομένων ανθρώπινης πρωτεωμικής της UniProt, η οποία λήφθηκε τον Σεπτέμβριο του 2018. Η ανάλυση περιλαμβάνει τον συντελεστή διόρθωσης καθαρότητας ισοτόπων που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Χρησιμοποιήστε το limma σε R για ανάλυση διαφορικής έκφρασης. Τα αρχικά δεδομένα, τα αποτελέσματα αναζήτησης βάσης δεδομένων και η ροή εργασίας και τα αποτελέσματα ανάλυσης δεδομένων αποθηκεύονται όλα στη συμμαχία ProteomeXchange μέσω του αποθετηρίου συνεργατών PRIDE με το αναγνωριστικό συνόλου δεδομένων PXD019690.
Οι λειτουργικές σχολιασμοί εμπλουτίζουν την ανάλυση. Το εργαλείο Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του πλούτου των όρων λειτουργικής σχολίασης του συνόλου δεδομένων στις 8 εβδομάδες (Σχήμα 1). Εν ολίγοις, η ποσοτική λίστα πρωτεϊνών που ελήφθη από την ανάλυση δεδομένων LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) χρησιμοποιείται με τα ακόλουθα κριτήρια φίλτρου: Το Mus musculus επιλέγεται ως το είδος και το υπόβαθρο και η κατηγορία δείχνει ότι η τιμή P που έχει προσαρμοστεί από τον Benjamini για εμπλουτισμό 0,05 ή χαμηλότερο θεωρείται σημαντική. Για αυτό το γράφημα, εμφανίζονται οι πέντε κορυφαίες κατηγορίες πλεονάζουσας πρωτεΐνης σε κάθε ομάδα με βάση την προσαρμοσμένη τιμή P. Χρησιμοποιώντας πολλαπλά t-test, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα γραμμικής ενίσχυσης δύο σταδίων των Benjamini, Krieger και Yekutieli (Q = 5%), η ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης σε σχέση με την χρονική πορεία πραγματοποιείται στους σημαντικούς υποψηφίους που προσδιορίζονται σε κάθε κατηγορία και κάθε σειρά αναλύεται ξεχωριστά. Δεν υπάρχει ανάγκη υιοθέτησης μιας συνεπούς τυπικής απόκλισης.
Προκειμένου να συγκρίνουμε τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης με δημοσιευμένες βάσεις δεδομένων και να δημιουργήσουμε ένα διάγραμμα Venn στο Σχήμα 1, συνδυάσαμε την ποσοτική λίστα πρωτεϊνών με τις σχολιασμούς του MitoCarta 2.0 (24). Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό εργαλείο Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) για να δημιουργήσουμε το διάγραμμα.
Για λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τις στατιστικές διαδικασίες που χρησιμοποιούνται για την πρωτεωμική ανάλυση, ανατρέξτε στην αντίστοιχη ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Για όλα τα άλλα πειράματα, λεπτομερείς πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στην αντίστοιχη λεζάντα. Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM και όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 8.1.2.
Για συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο, ανατρέξτε στη διεύθυνση http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης που διανέμεται σύμφωνα με τους όρους της Άδειας Creative Commons Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση, η οποία επιτρέπει τη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​εφόσον η τελική χρήση δεν αποσκοπεί σε εμπορικό κέρδος και η προϋπόθεση είναι ότι το πρωτότυπο έργο είναι σωστό. Αναφορά.
Σημείωση: Σας ζητάμε μόνο να δώσετε τη διεύθυνση email σας, ώστε το άτομο που προτείνετε στη σελίδα να γνωρίζει ότι θέλετε να δει το email και ότι δεν είναι ανεπιθύμητο. Δεν θα καταγράψουμε καμία διεύθυνση email.
Αυτή η ερώτηση χρησιμοποιείται για να ελεγχθεί εάν είστε επισκέπτης και να αποτραπεί η αυτόματη υποβολή ανεπιθύμητων μηνυμάτων.
Από τους E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Ο Λάρσον
Η πρωτεωμική ανάλυση δυσλειτουργικών νευρώνων αποκάλυψε ότι ενεργοποιούνται μεταβολικά προγράμματα για την αντιμετώπιση της νευροεκφύλισης.
Από τους E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Ο Λάρσον
Η πρωτεωμική ανάλυση δυσλειτουργικών νευρώνων αποκάλυψε ότι ενεργοποιούνται μεταβολικά προγράμματα για την αντιμετώπιση της νευροεκφύλισης.
©2020 American Association for the Advancement of Science. διατηρούνται όλα τα δικαιώματα. Η AAAS είναι συνεργάτης των HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef και COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.