Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για καλύτερα αποτελέσματα, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε μια νεότερη έκδοση του προγράμματος περιήγησής σας (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ ή JavaScript.
Το προπιονικό οξύ (PPA) χρησιμοποιείται για τη μελέτη του ρόλου της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας σε νευροαναπτυξιακές διαταραχές όπως η διαταραχή του φάσματος του αυτισμού. Το PPA είναι γνωστό ότι διαταράσσει τη μιτοχονδριακή βιογένεση, τον μεταβολισμό και την ανακύκλωση. Ωστόσο, οι επιδράσεις του PPA στη μιτοχονδριακή δυναμική, τη σχάση και τη σύντηξη παραμένουν προβληματικές λόγω της πολύπλοκης χρονικής φύσης αυτών των μηχανισμών. Εδώ, χρησιμοποιούμε συμπληρωματικές τεχνικές ποσοτικής απεικόνισης για να διερευνήσουμε πώς το PPA επηρεάζει τη μιτοχονδριακή υπερδομή, τη μορφολογία και τη δυναμική σε νευρωνικά κύτταρα SH-SY5Y. Το PPA (5 mM) προκάλεσε σημαντική μείωση στην μιτοχονδριακή περιοχή (p < 0,01), στη διάμετρο και την περιφέρεια Feret (p < 0,05) και στην περιοχή 2 (p < 0,01). Η ανάλυση εντοπιστή μιτοχονδριακών συμβάντων έδειξε σημαντική αύξηση (p < 0,05) στα συμβάντα σχάσης και σύντηξης, διατηρώντας έτσι την ακεραιότητα του μιτοχονδριακού δικτύου υπό συνθήκες στρες. Επιπλέον, η έκφραση mRNA των cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) και OPA1 (p < 0,05) μειώθηκε σημαντικά. (01). Αυτό καταδεικνύει την αναδιαμόρφωση της μιτοχονδριακής μορφολογίας, της βιογένεσης και της δυναμικής για τη διατήρηση της λειτουργίας υπό συνθήκες στρες. Τα δεδομένα μας παρέχουν νέα στοιχεία για τις επιδράσεις του PPA στη μιτοχονδριακή δυναμική και υπογραμμίζουν τη χρησιμότητα των τεχνικών απεικόνισης για τη μελέτη των πολύπλοκων ρυθμιστικών μηχανισμών που εμπλέκονται στις μιτοχονδριακές αποκρίσεις στο στρες.
Τα μιτοχόνδρια συμμετέχουν αναπόσπαστα σε μια ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών πέρα ​​από τους τυπικούς ρόλους τους στην παραγωγή ενέργειας και τη βιοσύνθεση. Ο μιτοχονδριακός μεταβολισμός είναι ένας βασικός ρυθμιστής της σηματοδότησης ασβεστίου, της μεταβολικής και οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης, της φλεγμονώδους σηματοδότησης, των επιγενετικών τροποποιήσεων, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου1. Συγκεκριμένα, ο μιτοχονδριακός μεταβολισμός είναι κρίσιμος για την ανάπτυξη, την επιβίωση και τη λειτουργία των νευρώνων και εμπλέκεται ευρέως σε διάφορες εκδηλώσεις νευροπαθολογίας2,3,4.
Την τελευταία δεκαετία, η μεταβολική κατάσταση έχει αναδειχθεί ως κεντρικός ρυθμιστής της νευρογένεσης, της διαφοροποίησης, της ωρίμανσης και της πλαστικότητας5,6. Πρόσφατα, η μιτοχονδριακή μορφολογία και δυναμική έχουν γίνει ιδιαίτερα σημαντικά συστατικά της μίτωσης, μιας δυναμικής διαδικασίας που διατηρεί μια δεξαμενή υγιών μιτοχονδρίων μέσα στα κύτταρα. Η μιτοχονδριακή δυναμική ρυθμίζεται από σύνθετες αλληλεξαρτώμενες οδούς που κυμαίνονται από τη μιτοχονδριακή βιογένεση και τη βιοενεργειακή έως τη μιτοχονδριακή σχάση, σύντηξη, μεταφορά και κάθαρση7,8. Η διαταραχή οποιουδήποτε από αυτούς τους μηχανισμούς ενσωμάτωσης επηρεάζει αρνητικά τη διατήρηση υγιών μιτοχονδριακών δικτύων και έχει βαθιές λειτουργικές συνέπειες για τη νευροανάπτυξη9,10. Πράγματι, η δυσλειτουργία της μιτοχονδριακής δυναμικής παρατηρείται σε πολλές ψυχιατρικές, νευροεκφυλιστικές και νευροαναπτυξιακές διαταραχές, συμπεριλαμβανομένων των διαταραχών του φάσματος του αυτισμού (ΔΑΦ)11,12.
Η ΔΑΦ είναι μια ετερογενής νευροαναπτυξιακή διαταραχή με σύνθετη γενετική και επιγενετική αρχιτεκτονική. Η κληρονομικότητα της ΔΑΦ είναι αδιαμφισβήτητη, αλλά η υποκείμενη μοριακή αιτιολογία παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Τα συσσωρευμένα δεδομένα από προκλινικά μοντέλα, κλινικές μελέτες και σύνολα μοριακών δεδομένων πολλαπλών ωμικών παρέχουν αυξανόμενες ενδείξεις μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας στην ΔΑΦ13,14. Προηγουμένως πραγματοποιήσαμε μια διαλογή μεθυλίωσης DNA σε ολόκληρο το γονιδίωμα σε μια ομάδα ασθενών με ΔΑΦ και εντοπίσαμε διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια που συγκεντρώθηκαν κατά μήκος των μιτοχονδριακών μεταβολικών οδών15. Στη συνέχεια, αναφέραμε διαφορική μεθυλίωση κεντρικών ρυθμιστών της μιτοχονδριακής βιογένεσης και δυναμικής, η οποία συσχετίστηκε με αυξημένο αριθμό αντιγράφων του μιτοχονδριακού DNA και αλλοιωμένο μεταβολικό προφίλ ούρων στην ΔΑΦ16. Τα δεδομένα μας παρέχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η μιτοχονδριακή δυναμική και η ομοιόσταση παίζουν κεντρικό ρόλο στην παθοφυσιολογία της ΔΑΦ. Επομένως, η βελτίωση της μηχανιστικής κατανόησης της σχέσης μεταξύ της μιτοχονδριακής δυναμικής, της μορφολογίας και της λειτουργίας αποτελεί βασικό στόχο της συνεχιζόμενης έρευνας σε νευρολογικές ασθένειες που χαρακτηρίζονται από δευτερογενή μιτοχονδριακή δυσλειτουργία.
Οι μοριακές τεχνικές χρησιμοποιούνται συχνά για τη μελέτη του ρόλου συγκεκριμένων γονιδίων στις μιτοχονδριακές αντιδράσεις στο στρες. Ωστόσο, αυτή η προσέγγιση μπορεί να περιορίζεται από την πολύπλευρη και χρονική φύση των μιτωτικών μηχανισμών ελέγχου. Επιπλέον, η διαφορική έκφραση των μιτοχονδριακών γονιδίων αποτελεί έμμεσο δείκτη λειτουργικών αλλαγών, ειδικά επειδή μόνο ένας περιορισμένος αριθμός γονιδίων συνήθως αναλύεται. Επομένως, έχουν προταθεί πιο άμεσες μέθοδοι για τη μελέτη της μιτοχονδριακής λειτουργίας και της βιοενεργητικής17. Η μιτοχονδριακή μορφολογία σχετίζεται στενά με τη μιτοχονδριακή δυναμική. Το μιτοχονδριακό σχήμα, η συνδεσιμότητα και η δομή είναι κρίσιμα για την παραγωγή ενέργειας και την επιβίωση των μιτοχονδρίων και των κυττάρων5,18. Επιπλέον, τα διάφορα συστατικά της μίτωσης επικεντρώνονται σε αλλαγές στη μιτοχονδριακή μορφολογία, οι οποίες μπορούν να χρησιμεύσουν ως χρήσιμα τελικά σημεία της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας και να αποτελέσουν τη βάση για επόμενες μηχανιστικές μελέτες.
Η μιτοχονδριακή μορφολογία μπορεί να παρατηρηθεί άμεσα χρησιμοποιώντας ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (TEM), επιτρέποντας τη λεπτομερή μελέτη της κυτταρικής υπερδομής. Η TEM απεικονίζει άμεσα τη μορφολογία, το σχήμα και τη δομή των μιτοχονδριακών κροσσών στην ανάλυση των μεμονωμένων μιτοχονδρίων, αντί να βασίζεται αποκλειστικά στην μεταγραφή γονιδίων, την έκφραση πρωτεϊνών ή τις λειτουργικές παραμέτρους των μιτοχονδρίων σε κυτταρικούς πληθυσμούς17,19,20. Επιπλέον, η TEM διευκολύνει τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ μιτοχονδρίων και άλλων οργανιδίων, όπως το ενδοπλασματικό δίκτυο και τα αυτοφαγοσώματα, τα οποία παίζουν βασικούς ρόλους στη μιτοχονδριακή λειτουργία και την ομοιόσταση21,22. Έτσι, αυτό καθιστά την TEM ένα καλό σημείο εκκίνησης για τη μελέτη της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας πριν από την εστίαση σε συγκεκριμένες οδούς ή γονίδια. Καθώς η μιτοχονδριακή λειτουργία καθίσταται ολοένα και πιο σχετική με τη νευροπαθολογία, υπάρχει σαφής ανάγκη να είναι δυνατή η άμεση και ποσοτική μελέτη της μιτοχονδριακής μορφολογίας και δυναμικής σε in vitro νευρωνικά μοντέλα.
Σε αυτό το άρθρο, εξετάζουμε τη μιτοχονδριακή δυναμική σε ένα νευρωνικό μοντέλο μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας στη διαταραχή του φάσματος του αυτισμού. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως τη διαφορική μεθυλίωση της προπιονυλ-CoA καρβοξυλάσης βήτα (PCCB) στο ASD15, μια υπομονάδα του μιτοχονδριακού ενζύμου PCC προπιονυλ-CoA καρβοξυλάσης. Η δυσλειτουργία του PCC είναι γνωστό ότι προκαλεί τοξική συσσώρευση παραγώγων προπιονυλίου, συμπεριλαμβανομένου του προπιονικού οξέος (PPA)23,24,25. Το PPA έχει αποδειχθεί ότι διαταράσσει τον νευρωνικό μεταβολισμό και μεταβάλλει τη συμπεριφορά in vivo και αποτελεί ένα καθιερωμένο ζωικό μοντέλο για τη μελέτη των νευροαναπτυξιακών μηχανισμών που εμπλέκονται στο ASD26,27,28. Επιπλέον, το PPA έχει αναφερθεί ότι διαταράσσει το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης, τη βιογένεση και την αναπνοή in vitro και έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη μοντελοποίηση της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας σε νευρώνες29,30. Ωστόσο, η επίδραση της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας που προκαλείται από το PPA στη μιτοχονδριακή μορφολογία και δυναμική παραμένει ελάχιστα κατανοητή.
Αυτή η μελέτη χρησιμοποιεί συμπληρωματικές τεχνικές απεικόνισης για την ποσοτικοποίηση των επιδράσεων του PPA στη μιτοχονδριακή μορφολογία, τη δυναμική και τη λειτουργία στα κύτταρα SH-SY5Y. Αρχικά, αναπτύξαμε μια μέθοδο TEM για την απεικόνιση αλλαγών στη μιτοχονδριακή μορφολογία και την υπερδομή17,31,32. Δεδομένης της δυναμικής φύσης των μιτοχονδρίων33, χρησιμοποιήσαμε επίσης ανάλυση εντοπιστή μιτοχονδριακών συμβάντων (MEL) για να ποσοτικοποιήσουμε τις αλλαγές στην ισορροπία μεταξύ συμβάντων σχάσης και σύντηξης, του αριθμού και του όγκου των μιτοχονδρίων υπό στρες PPA. Τέλος, εξετάσαμε εάν η μιτοχονδριακή μορφολογία και η δυναμική σχετίζονται με αλλαγές στην έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη βιογένεση, τη σχάση και τη σύντηξη. Συνολικά, τα δεδομένα μας καταδεικνύουν την πρόκληση της διευκρίνισης της πολυπλοκότητας των μηχανισμών που ρυθμίζουν τη μιτοχονδριακή δυναμική. Επισημαίνουμε τη χρησιμότητα του TEM στη μελέτη της μιτοχονδριακής μορφολογίας ως μετρήσιμου συγκλίνοντος τελικού σημείου της μίτωσης στα κύτταρα SH-SY5Y. Επιπλέον, επισημαίνουμε ότι τα δεδομένα TEM παρέχουν τις πλουσιότερες πληροφορίες όταν συνδυάζονται με τεχνικές απεικόνισης που καταγράφουν επίσης δυναμικά συμβάντα σε απόκριση στο μεταβολικό στρες. Ο περαιτέρω χαρακτηρισμός των μοριακών ρυθμιστικών μηχανισμών που υποστηρίζουν τη μίτωση των νευρωνικών κυττάρων μπορεί να παράσχει σημαντική εικόνα για το μιτοχονδριακό συστατικό του νευρικού συστήματος και των νευροεκφυλιστικών ασθενειών.
Για την πρόκληση μιτοχονδριακού στρες, τα κύτταρα SH-SY5Y υποβλήθηκαν σε αγωγή με PPA χρησιμοποιώντας 3 mM και 5 mM προπιονικό νάτριο (NaP). Πριν από την TEM, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε κρυογονική προετοιμασία δειγμάτων χρησιμοποιώντας κατάψυξη και κατάψυξη υψηλής πίεσης (Εικ. 1a). Αναπτύξαμε έναν αυτοματοποιημένο αγωγό ανάλυσης μιτοχονδριακής εικόνας για τη μέτρηση οκτώ μορφολογικών παραμέτρων των μιτοχονδριακών πληθυσμών σε τρία βιολογικά αντίγραφα. Διαπιστώσαμε ότι η επεξεργασία με PPA άλλαξε σημαντικά τέσσερις παραμέτρους: την περιοχή 2, την περιοχή, την περίμετρο και τη διάμετρο Feret (Εικ. 1b-e). Η περιοχή 2 μειώθηκε σημαντικά τόσο με την επεξεργασία με 3 mM όσο και με 5 mM PPA (p = 0,0183 και p = 0,002, αντίστοιχα) (Εικ. 1b), ενώ η περιοχή (p = 0,003), η περίμετρος (p = 0,0106) και η διάμετρος Feret μειώθηκαν σημαντικά. Υπήρξε σημαντική μείωση (p = 0,0172) στην ομάδα θεραπείας με 5 mM σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 1c-e). Σημαντικές μειώσεις στην περιοχή και την περιφέρεια έδειξαν ότι τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5 mM PPA είχαν μικρότερα, πιο στρογγυλεμένα μιτοχόνδρια και ότι αυτά τα μιτοχόνδρια ήταν λιγότερο επιμήκη από αυτά των κυττάρων ελέγχου. Αυτό συμφωνεί επίσης με μια σημαντική μείωση στη διάμετρο Feret, μια ανεξάρτητη παράμετρο που υποδεικνύει μείωση στη μεγαλύτερη απόσταση μεταξύ των άκρων των σωματιδίων. Παρατηρήθηκαν αλλαγές στην υπερδομή των κρυστάλλων: οι κρυστάλλοι έγιναν λιγότερο έντονες υπό την επίδραση της τάσης PPA (Εικ. 1α, πάνελ Β). Ωστόσο, δεν αντανακλούσαν όλες οι εικόνες σαφώς την υπερδομή των κρυστάλλων, επομένως δεν πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση αυτών των αλλαγών. Αυτά τα δεδομένα TEM μπορεί να αντανακλούν τρία πιθανά σενάρια: (1) το PPA ενισχύει τη σχάση ή αναστέλλει τη σύντηξη, προκαλώντας συρρίκνωση των υπαρχόντων μιτοχονδρίων σε μέγεθος· (2) η ενισχυμένη βιογένεση δημιουργεί νέα, μικρότερα μιτοχόνδρια ή (3) προκαλεί και τους δύο μηχανισμούς ταυτόχρονα. Αν και αυτές οι συνθήκες δεν μπορούν να διακριθούν από το TEM, σημαντικές μορφολογικές αλλαγές υποδεικνύουν αλλαγές στην μιτοχονδριακή ομοιόσταση και τη δυναμική υπό την τάση PPA. Στη συνέχεια διερευνήσαμε πρόσθετες παραμέτρους για να χαρακτηρίσουμε περαιτέρω αυτές τις δυναμικές και τους πιθανούς μηχανισμούς που τις διέπουν.
Το προπιονικό οξύ (PPA) αναδιαμορφώνει τη μιτοχονδριακή μορφολογία. (α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης (TEM) που δείχνουν ότι το μέγεθος των μιτοχονδρίων μειώνεται και τα μιτοχόνδρια γίνονται μικρότερα και πιο στρογγυλεμένα με την αυξανόμενη επεξεργασία με PPA. 0 mM (μη επεξεργασμένα), 3 mM και 5 mM, αντίστοιχα. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν μιτοχόνδρια. (β-ε) Τα κύτταρα SH-SY5Y που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PPA για 24 ώρες παρασκευάστηκαν για TEM και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Fiji/ImageJ. Τέσσερις από τις οκτώ παραμέτρους έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων ελέγχου (μη επεξεργασμένα, 0 mM PPA) και των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία (3 mM και 5 mM PPA). (β) Περιοχή 2, (γ) Εμβαδόν, (δ) Περίμετρος, (ε) Διάμετρος Feret. Χρησιμοποιήθηκαν μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (έλεγχος έναντι επεξεργασίας) και πολλαπλή δοκιμή σύγκρισης Dunnett για τον προσδιορισμό σημαντικών διαφορών (p < 0,05). Τα σημεία δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση μιτοχονδριακή τιμή για κάθε μεμονωμένο κύτταρο και οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± SEM. Τα δεδομένα που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν n = 3, τουλάχιστον 24 κύτταρα ανά επανάληψη. Αναλύθηκαν συνολικά 266 εικόνες. Το * υποδεικνύει p < 0,05, το ** υποδεικνύει p < 0,01.
Για να χαρακτηρίσουμε περαιτέρω τον τρόπο με τον οποίο η μιτοχονδριακή δυναμική ανταποκρίνεται στην PPA, χρωματίσαμε τα μιτοχόνδρια με αιθυλεστέρα τετραμεθυλοροδαμίνης (TMRE) και χρησιμοποιήσαμε μικροσκοπία χρονικής καθυστέρησης και ανάλυση MEL για να εντοπίσουμε και να ποσοτικοποιήσουμε τα μιτοχόνδρια μετά από 24 ώρες στα 3 και 5 mM PPA. Επεξεργασία συμβάντων σχάσης και σύντηξης. (Εικ. 2α). Μετά την ανάλυση MEL, τα μιτοχόνδρια αναλύθηκαν περαιτέρω για να ποσοτικοποιήσουμε τον αριθμό των μιτοχονδριακών δομών και τον μέσο όγκο τους. Παρατηρήσαμε μια μικρή αλλά σημαντική αύξηση στον αριθμό των συμβάντων σχάσης που εμφανίστηκαν στα 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] σε σύγκριση με τη σχάση [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] και τη σύντηξη [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] και τη σύντηξη [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] τα συμβάντα αυξήθηκαν σημαντικά στα 5 mM σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 3b). Ο αριθμός των μιτοχονδρίων αυξήθηκε σημαντικά τόσο στα 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] όσο και στα 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Εικ. 3c), ενώ ο μέσος όγκος κάθε μιτοχονδριακής δομής παρέμεινε αμετάβλητος (Εικ. 3c). Συνολικά, αυτό υποδηλώνει ότι η αναδιαμόρφωση της μιτοχονδριακής δυναμικής χρησιμεύει ως αντισταθμιστική απόκριση που διατηρεί με επιτυχία την ακεραιότητα του μιτοχονδριακού δικτύου. Η αύξηση του αριθμού των συμβάντων σχάσης στα 3 mM PPA υποδηλώνει ότι η αύξηση του μιτοχονδριακού αριθμού οφείλεται εν μέρει στη μιτοχονδριακή σχάση, αλλά δεδομένου ότι ο μέσος μιτοχονδριακός όγκος παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητος, η βιογένεση δεν μπορεί να αποκλειστεί ως πρόσθετη αντισταθμιστική απόκριση. Ωστόσο, αυτά τα δεδομένα είναι σύμφωνα με τις μικρότερες, στρογγυλές μιτοχονδριακές δομές που παρατηρούνται από την TEM και επίσης καταδεικνύουν σημαντικές αλλαγές στη μιτοχονδριακή δυναμική που προκαλείται από την PPA.
Το προπιονικό οξύ (PPA) προκαλεί δυναμική μιτοχονδριακή αναδιαμόρφωση για τη διατήρηση της ακεραιότητας του δικτύου. Τα κύτταρα SH-SY5Y καλλιεργήθηκαν, υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 και 5 mM PPA για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με TMRE και Hoechst 33342 ακολουθούμενα από ανάλυση MEL. (α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες μικροσκοπίας time-lapse που απεικονίζουν έγχρωμες και δυαδικές προβολές μέγιστης έντασης στον χρόνο 2 (t2) για κάθε συνθήκη. Οι επιλεγμένες περιοχές που υποδεικνύονται σε κάθε δυαδική εικόνα είναι ενισχυμένες και εμφανίζονται σε 3D σε τρία διαφορετικά χρονικά πλαίσια (t1-t3) για να απεικονίσουν τη δυναμική με την πάροδο του χρόνου. Τα συμβάντα σύντηξης επισημαίνονται με πράσινο χρώμα. Τα συμβάντα σχάσης επισημαίνονται με πράσινο χρώμα. Εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα. (β) Μέσος αριθμός δυναμικών συμβάντων ανά συνθήκη. (γ) Μέσος αριθμός μιτοχονδριακών δομών ανά κύτταρο. (δ) Μέσος όγκος (µm3) κάθε μιτοχονδριακής δομής ανά κύτταρο. Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι αντιπροσωπευτικά n = 15 κυττάρων ανά ομάδα θεραπείας. Οι γραμμές σφάλματος που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SEM, γραμμή κλίμακας = 10 μm, * p < 0,05.
Το προπιονικό οξύ (PPA) προκαλεί μεταγραφική καταστολή γονιδίων που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή δυναμική. Τα κύτταρα SH-SY5Y υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 και 5 mM PPA για 24 ώρες. Η σχετική ποσοτικοποίηση γονιδίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας RT-qPCR και ομαλοποιήθηκε σε B2M. Γονίδια μιτοχονδριακής βιογένεσης (α) cMYC, (β) TFAM, (γ) NRF1 και (δ) NFE2L2. Γονίδια μιτοχονδριακής σύντηξης και σχάσης (ε) STOML2, (στ) OPA1, (ζ) MFN1, (η) MFN2 και (θ) DRP1. Σημαντικές διαφορές (p < 0,05) ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA (έλεγχος έναντι θεραπείας) και πολλαπλή δοκιμή σύγκρισης Dunnett: * υποδεικνύει p < 0,05, ** υποδεικνύει p < 0,01 και **** υποδεικνύει p < 0,0001. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση έκφραση ± SEM. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) και n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) βιολογικά αντίγραφα.
Τα δεδομένα από τις αναλύσεις TEM και MEL μαζί δείχνουν ότι η PPA μεταβάλλει τη μιτοχονδριακή μορφολογία και δυναμική. Ωστόσο, αυτές οι τεχνικές απεικόνισης δεν παρέχουν πληροφορίες για τους υποκείμενους μηχανισμούς που καθοδηγούν αυτές τις διεργασίες. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε την έκφραση mRNA εννέα βασικών ρυθμιστών της μιτοχονδριακής δυναμικής, της βιογένεσης και της μίτωσης σε απόκριση στη θεραπεία με PPA. Ποσοτικοποιήσαμε το ογκογονίδιο του κυτταρικού μυελώματος (cMYC), τον πυρηνικό αναπνευστικό παράγοντα (NRF1), τον μιτοχονδριακό μεταγραφικό παράγοντα 1 (TFAM), τον μεταγραφικό παράγοντα τύπου NFE2 BZIP (NFE2L2), την πρωτεΐνη τύπου γαστρίνης 2 (STOML2), την ατροφία οπτικού νεύρου 1 (OPA1), τη μιτοφουσίνη 1 (MFN1), τη μιτοφουσίνη 2 (MFN2) και την πρωτεΐνη 1 που σχετίζεται με τη δυναμίνη (DRP1) μετά από 24 ώρες θεραπείας με 3 mM και 5 mM PPA. Παρατηρήσαμε 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 και p < 0,0001, αντίστοιχα) και 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) θεραπεία με PPA. (Εικ. 3a-c). Η μείωση στην έκφραση του mRNA ήταν δοσοεξαρτώμενη: η έκφραση των cMYC, NRF1 και TFAM μειώθηκε κατά 5,7, 2,6 και 1,9 φορές στα 3 mM, αντίστοιχα, και κατά 11,2, 3 και 2,2 φορές στα 5 mM. Αντίθετα, το γονίδιο κεντρικής οξειδοαναγωγικής βιογένεσης NFE2L2 δεν μεταβλήθηκε σε καμία συγκέντρωση PPA, αν και παρατηρήθηκε μια παρόμοια δοσοεξαρτώμενη τάση μειωμένης έκφρασης (Εικ. 3d).
Εξετάσαμε επίσης την έκφραση κλασικών γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της σχάσης και της σύντηξης. Το STOML2 πιστεύεται ότι εμπλέκεται στη σύντηξη, τη μιτοφαγία και τη βιογένεση, και η έκφρασή του μειώθηκε σημαντικά (p < 0,0001) κατά 3 mM (2,4 φορές αλλαγή) και 5 mM (2,8 φορές αλλαγή) PPA (Εικ. 1). 3d). Ομοίως, η έκφραση του γονιδίου σύντηξης OPA1 μειώθηκε στα 3 mM (1,6 φορές αλλαγή) και 5 mM (1,9 φορές αλλαγή) PPA (p = 0,006 και p = 0,0024, αντίστοιχα) (Εικ. 3f). Ωστόσο, δεν βρήκαμε σημαντικές διαφορές στην έκφραση των γονιδίων σύντηξης MFN1, MFN2 ή του γονιδίου σχάσης DRP1 υπό 24ωρη καταπόνηση PPA (Εικ. 3g-i). Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι τα επίπεδα τεσσάρων πρωτεϊνών σύντηξης και σχάσης (OPA1, MFN1, MFN2 και DRP1) δεν άλλαξαν υπό τις ίδιες συνθήκες (Εικ. 4α-δ). ​​Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι αυτά τα δεδομένα αντικατοπτρίζουν ένα μόνο χρονικό σημείο και μπορεί να μην αντικατοπτρίζουν αλλαγές στην έκφραση ή τα επίπεδα δραστηριότητας των πρωτεϊνών κατά τα πρώιμα στάδια του στρες από PPA. Ωστόσο, σημαντικές μειώσεις στην έκφραση των cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 και OPA1 υποδεικνύουν σημαντική μεταγραφική δυσλειτουργία του μιτοχονδριακού μεταβολισμού, της βιογένεσης και της δυναμικής. Επιπλέον, αυτά τα δεδομένα υπογραμμίζουν τη χρησιμότητα των τεχνικών απεικόνισης για την άμεση μελέτη των αλλαγών στην τελική κατάσταση της μιτοχονδριακής λειτουργίας.
Τα επίπεδα πρωτεΐνης παράγοντα σύντηξης και σχάσης δεν άλλαξαν μετά την επεξεργασία με προπιονικό οξύ (PPA). Τα κύτταρα SH-SY5Y υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 και 5 mM PPA για 24 ώρες. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση Western blot και τα επίπεδα έκφρασης ομαλοποιήθηκαν ως προς τη συνολική πρωτεΐνη. Εμφανίζονται η μέση έκφραση πρωτεΐνης και αντιπροσωπευτικά Western blots της πρωτεΐνης-στόχου και της συνολικής πρωτεΐνης. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± SEM και τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά n = 3 βιολογικών αντιγράφων. Πραγματοποιήθηκαν πολλαπλές συγκρίσεις (p < 0,05) χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης και δοκιμή Dunnett. Το αρχικό πήκτωμα και το στύπωμα φαίνονται στο Σχήμα S1.
Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία σχετίζεται με πολυσυστημικές ασθένειες που κυμαίνονται από μεταβολικές, καρδιαγγειακές και μυϊκές ασθένειες έως νευρολογικές ασθένειες1,10. Πολλές νευροεκφυλιστικές και νευροεκφυλιστικές ασθένειες σχετίζονται με μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, υπογραμμίζοντας τη σημασία αυτών των οργανιδίων καθ' όλη τη διάρκεια ζωής του εγκεφάλου. Αυτές οι ασθένειες περιλαμβάνουν τη νόσο Πάρκινσον, τη νόσο Αλτσχάιμερ και την ASD3,4,18. Ωστόσο, η πρόσβαση στον εγκεφαλικό ιστό για τη μελέτη αυτών των ασθενειών είναι δύσκολη, ειδικά σε μηχανιστικό επίπεδο, καθιστώντας τα κυτταρικά συστήματα μοντέλων μια απαραίτητη εναλλακτική λύση. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε ένα κυτταρικό σύστημα μοντέλων που χρησιμοποιεί κύτταρα SH-SY5Y επεξεργασμένα με PPA για να ανακεφαλαιώσουμε τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία που παρατηρείται σε νευρωνικές ασθένειες, ιδιαίτερα σε διαταραχές του φάσματος του αυτισμού. Η χρήση αυτού του μοντέλου PPA για τη μελέτη της μιτοχονδριακής δυναμικής στους νευρώνες μπορεί να παρέχει πληροφορίες για την αιτιολογία της ASD.
Διερευνήσαμε τη δυνατότητα χρήσης της TEM για την παρατήρηση αλλαγών στη μιτοχονδριακή μορφολογία. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η TEM πρέπει να χρησιμοποιείται σωστά για να μεγιστοποιηθεί η αποτελεσματικότητά της. Η προετοιμασία κρυο-δειγμάτων επιτρέπει την καλύτερη διατήρηση των νευρωνικών δομών, σταθεροποιώντας ταυτόχρονα τα κυτταρικά συστατικά και μειώνοντας τον σχηματισμό τεχνουργημάτων34. Σε συμφωνία με αυτό, παρατηρήσαμε ότι τα νευρωνοειδή κύτταρα SH-SY5Y είχαν άθικτα υποκυτταρικά οργανίδια και επιμήκη μιτοχόνδρια (Εικ. 1α). Αυτό υπογραμμίζει τη χρησιμότητα των τεχνικών κρυογονικής προετοιμασίας για τη μελέτη της μιτοχονδριακής μορφολογίας σε μοντέλα νευρωνικών κυττάρων. Αν και οι ποσοτικές μετρήσεις είναι κρίσιμες για την αντικειμενική ανάλυση των δεδομένων TEM, δεν υπάρχει ακόμη συναίνεση σχετικά με το ποιες συγκεκριμένες παράμετροι θα πρέπει να μετρώνται για την επιβεβαίωση των μιτοχονδριακών μορφολογικών αλλαγών. Με βάση έναν μεγάλο αριθμό μελετών που έχουν εξετάσει ποσοτικά τη μιτοχονδριακή μορφολογία17,31,32, αναπτύξαμε έναν αυτοματοποιημένο αγωγό ανάλυσης μιτοχονδριακών εικόνων που μετρά οκτώ μορφολογικές παραμέτρους, συγκεκριμένα: εμβαδόν, εμβαδόν2, λόγο διαστάσεων, περίμετρο, κυκλικότητα, βαθμό, διάμετρο Feret και στρογγυλότητα.
Μεταξύ αυτών, η PPA μείωσε σημαντικά την περιοχή 2, την περιοχή, την περίμετρο και τη διάμετρο Feret (Εικ. 1b-e). Αυτό έδειξε ότι τα μιτοχόνδρια έγιναν μικρότερα και πιο στρογγυλεμένα, κάτι που συμφωνεί με προηγούμενες μελέτες που έδειξαν μείωση στην περιοχή των μιτοχονδρίων μετά από 72 ώρες μιτοχονδριακού στρες που προκαλείται από την PPA30. Αυτά τα μορφολογικά χαρακτηριστικά μπορεί να υποδηλώνουν μιτοχονδριακή σχάση, μια απαραίτητη διαδικασία για την απομόνωση των κατεστραμμένων συστατικών από το μιτοχονδριακό δίκτυο για την προώθηση της αποδόμησής τους μέσω της μιτοφαγίας35,36,37. Από την άλλη πλευρά, η μείωση του μέσου μεγέθους των μιτοχονδρίων μπορεί να σχετίζεται με αυξημένη βιογένεση, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό μικρών νεοσύστατων μιτοχονδρίων. Η αυξημένη σχάση ή βιογένεση αντιπροσωπεύει μια αντισταθμιστική απόκριση για τη διατήρηση της μίτωσης έναντι του μιτοχονδριακού στρες. Ωστόσο, δεν μπορούν να αποκλειστούν η μειωμένη μιτοχονδριακή ανάπτυξη, η μειωμένη σύντηξη ή άλλες καταστάσεις.
Παρόλο που οι εικόνες υψηλής ανάλυσης που δημιουργούνται από την TEM επιτρέπουν τον προσδιορισμό μορφολογικών χαρακτηριστικών στο επίπεδο των μεμονωμένων μιτοχονδρίων, αυτή η μέθοδος παράγει δισδιάστατα στιγμιότυπα σε ένα μόνο χρονικό σημείο. Για να μελετήσουμε τις δυναμικές αποκρίσεις στο μεταβολικό στρες, βάψαμε τα μιτοχόνδρια με TMRE και χρησιμοποιήσαμε μικροσκοπία time-lapse με ανάλυση MEL, η οποία επιτρέπει την τρισδιάστατη απεικόνιση υψηλής απόδοσης των αλλαγών στο μιτοχονδριακό δίκτυο με την πάροδο του χρόνου33,38. Παρατηρήσαμε ανεπαίσθητες αλλά σημαντικές αλλαγές στη μιτοχονδριακή δυναμική υπό στρες PPA (Εικ. 2). Στα 3 mM, ο αριθμός των συμβάντων σχάσης αυξήθηκε σημαντικά, ενώ τα συμβάντα σύντηξης παρέμειναν τα ίδια όπως στον έλεγχο. Αύξηση στον αριθμό τόσο των συμβάντων σχάσης όσο και των συμβάντων σύντηξης παρατηρήθηκε στα 5 mM PPA, αλλά αυτές οι αλλαγές ήταν περίπου ανάλογες, υποδηλώνοντας ότι η κινητική της σχάσης και της σύντηξης φτάνουν σε ισορροπία σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (Εικ. 2b). Ο μέσος όγκος των μιτοχονδρίων παρέμεινε αμετάβλητος τόσο στα 3 όσο και στα 5 mM PPA, υποδεικνύοντας ότι η ακεραιότητα του μιτοχονδριακού δικτύου διατηρήθηκε (Εικ. 2d). Αυτό αντικατοπτρίζει την ικανότητα των δυναμικών μιτοχονδριακών δικτύων να ανταποκρίνονται σε ήπιο μεταβολικό στρες για να διατηρούν αποτελεσματικά την ομοιόσταση χωρίς να προκαλούν κατακερματισμό του δικτύου. Στα 3 mM PPA, η αύξηση της σχάσης είναι επαρκής για να προωθήσει τη μετάβαση σε μια νέα ισορροπία, αλλά απαιτείται πιο βαθιά κινητική αναδιαμόρφωση σε απόκριση στο στρες που προκαλείται από υψηλότερες συγκεντρώσεις PPA.
Ο αριθμός των μιτοχονδρίων αυξήθηκε και στις δύο συγκεντρώσεις στρες PPA, αλλά ο μέσος μιτοχονδριακός όγκος δεν άλλαξε σημαντικά (Εικ. 2c). Αυτό μπορεί να οφείλεται σε αυξημένη βιογένεση ή αυξημένη διαίρεση. Ωστόσο, ελλείψει σημαντικής μείωσης του μέσου μιτοχονδριακού όγκου, είναι πιο πιθανό να αυξάνεται η βιοσύνθεση. Ωστόσο, τα δεδομένα στο Σχήμα 2 υποστηρίζουν την ύπαρξη δύο αντισταθμιστικών μηχανισμών: αύξηση στον αριθμό των συμβάντων σχάσης, που συνάδει με την ανοδική ρύθμιση της μιτοχονδριακής σχάσης, και αύξηση στον αριθμό των συμβάντων, που συνάδει με τη μιτοχονδριακή βιογένεση. Τελικά, η δυναμική αντιστάθμιση για ήπιο στρες μπορεί να συνίσταται σε ταυτόχρονες διεργασίες που περιλαμβάνουν σχάση, σύντηξη, βιογένεση και μιτοφαγία. Αν και προηγούμενοι συγγραφείς έχουν δείξει ότι η PPA ενισχύει τη μίτωση30,39 και τη μιτοφαγία29, παρέχουμε στοιχεία για την αναδιαμόρφωση της μιτοχονδριακής σχάσης και τη δυναμική σύντηξης σε απόκριση στην PPA. Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώνουν τις μορφολογικές αλλαγές που παρατηρούνται από την TEM και παρέχουν περαιτέρω πληροφορίες για τους μηχανισμούς που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία που προκαλείται από την PPA.
Επειδή ούτε η ανάλυση TEM ούτε η ανάλυση MEL παρείχαν άμεσες ενδείξεις των μηχανισμών ρύθμισης των γονιδίων που διέπουν τις παρατηρούμενες μορφολογικές αλλαγές, εξετάσαμε την έκφραση RNA των γονιδίων που εμπλέκονται στον μιτοχονδριακό μεταβολισμό, τη βιογένεση και τη δυναμική. Το πρωτοογκογονίδιο cMYC είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που εμπλέκεται στη ρύθμιση των μιτοχονδρίων, της γλυκόλυσης, του μεταβολισμού των αμινοξέων και των λιπαρών οξέων40. Επιπλέον, το cMYC είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την έκφραση σχεδόν 600 μιτοχονδριακών γονιδίων που εμπλέκονται στη μιτοχονδριακή μεταγραφή, τη μετάφραση και τη συναρμολόγηση συμπλόκων, συμπεριλαμβανομένων των NRF1 και TFAM41. Τα NRF1 και TFAM είναι δύο κεντρικοί ρυθμιστές της μίτωσης, που δρουν κατάντη του PGC-1α για να ενεργοποιήσουν την αντιγραφή του μιτοχονδριακού DNA. Αυτή η οδός ενεργοποιείται από την σηματοδότηση cAMP και AMPK και είναι ευαίσθητη στην ενεργειακή δαπάνη και το μεταβολικό στρες. Εξετάσαμε επίσης το NFE2L2, έναν οξειδοαναγωγικό ρυθμιστή της μιτοχονδριακής βιογένεσης, για να προσδιορίσουμε εάν οι επιδράσεις του PPA θα μπορούσαν να προκαλούνται από οξειδωτικό στρες.
Παρόλο που η έκφραση του NFE2L2 παρέμεινε αμετάβλητη, διαπιστώσαμε μια συνεπή δοσοεξαρτώμενη μείωση στην έκφραση των cMYC, NRF1 και TFAM μετά από 24 ώρες θεραπείας με 3 mM και 5 mM PPA (Εικ. 3a-c). Η μείωση της έκφρασης του cMYC έχει αναφερθεί προηγουμένως ως απόκριση στο μιτοχονδριακό στρες42, και αντίστροφα, η μείωση της έκφρασης του cMYC μπορεί να προκαλέσει μιτοχονδριακή δυσλειτουργία αναδιαμορφώνοντας τον μιτοχονδριακό μεταβολισμό, τη συνδεσιμότητα δικτύου και την πόλωση της μεμβράνης43. Είναι ενδιαφέρον ότι το cMYC εμπλέκεται επίσης στη ρύθμιση της μιτοχονδριακής σχάσης και σύντηξης42,43 και είναι γνωστό ότι αυξάνει τη φωσφορυλίωση της DRP1 και τον μιτοχονδριακό εντοπισμό κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης44, καθώς και μεσολαβεί στη μιτοχονδριακή μορφολογική αναδιαμόρφωση σε νευρωνικά βλαστοκύτταρα45. Πράγματι, οι ινοβλάστες με έλλειψη cMYC εμφανίζουν μειωμένο μιτοχονδριακό μέγεθος, σύμφωνα με τις αλλαγές που προκαλούνται από το στρες του PPA43. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν μια ενδιαφέρουσα αλλά προς το παρόν ασαφή σχέση μεταξύ του cMYC και της μιτοχονδριακής δυναμικής, παρέχοντας έναν ενδιαφέροντα στόχο για μελλοντικές μελέτες της αναδιαμόρφωσης που προκαλείται από το στρες του PPA.
Η μείωση των NRF1 και TFAM είναι συνεπής με τον ρόλο του cMYC ως σημαντικού ενεργοποιητή μεταγραφής. Αυτά τα δεδομένα είναι επίσης συνεπή με προηγούμενες μελέτες σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου που δείχνουν ότι το PPA μείωσε την έκφραση mRNA του NRF1 στις 22 ώρες, η οποία συσχετίστηκε με την εξάντληση του ATP και την αύξηση του ROS46. Αυτοί οι συγγραφείς ανέφεραν επίσης ότι η έκφραση του TFAM αυξήθηκε στις 8,5 ώρες αλλά επέστρεψε στα αρχικά επίπεδα στις 22 ώρες. Αντίθετα, οι Kim et al. (2019) έδειξαν ότι η έκφραση mRNA του TFAM μειώθηκε σημαντικά μετά από 4 ώρες στρες PPA σε κύτταρα SH-SY5Y. Ωστόσο, μετά από 72 ώρες, η έκφραση της πρωτεΐνης TFAM αυξήθηκε σημαντικά και ο αριθμός αντιγράφων του mtDNA αυξήθηκε σημαντικά. Έτσι, η μείωση στον αριθμό των γονιδίων βιογένεσης μιτοχονδρίων που παρατηρήσαμε μετά από 24 ώρες δεν αποκλείει την πιθανότητα η αύξηση στον αριθμό των μιτοχονδρίων να σχετίζεται με την ενεργοποίηση της βιογένεσης σε προηγούμενα χρονικά σημεία. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το PPA αυξάνει σημαντικά το mRNA και την πρωτεΐνη του PGC-1α σε κύτταρα SH-SY5Y στις 4 ώρες και 30 λεπτά, ενώ το προπιονικό οξύ ενισχύει τη μιτοχονδριακή βιογένεση σε ηπατοκύτταρα μοσχαριού μέσω του PGC-1α στις 12 ώρες και 39 λεπτά. Είναι ενδιαφέρον ότι το PGC-1α δεν είναι μόνο ένας άμεσος μεταγραφικός ρυθμιστής του NRF1 και του TFAM, αλλά έχει επίσης αποδειχθεί ότι ρυθμίζει τη δραστηριότητα του MFN2 και του DRP1 ρυθμίζοντας τη σχάση και τη σύντηξη47. Συνολικά, αυτό υπογραμμίζει τη στενή σύζευξη των μηχανισμών που ρυθμίζουν τις μιτοχονδριακές αντισταθμιστικές αποκρίσεις που προκαλούνται από το PPA. Επιπλέον, τα δεδομένα μας αντικατοπτρίζουν σημαντική δυσλειτουργία της μεταγραφικής ρύθμισης της βιογένεσης και του μεταβολισμού υπό το στρες του PPA.
Τα γονίδια STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 και DRP1 συγκαταλέγονται στους κεντρικούς ρυθμιστές της μιτοχονδριακής σχάσης, σύντηξης και δυναμικής37,48,49. Υπάρχουν πολλά άλλα γονίδια που εμπλέκονται στη μιτοχονδριακή δυναμική, ωστόσο, τα STOML2, OPA1 και MFN2 έχουν προηγουμένως βρεθεί ότι μεθυλιώνονται διαφορετικά σε ομάδες ASD,16 και αρκετές ανεξάρτητες μελέτες έχουν αναφέρει αλλαγές σε αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής σε απόκριση στο μιτοχονδριακό στρες50,51. 52. Η έκφραση τόσο του OPA1 όσο και του STOML2 μειώθηκε σημαντικά με την αγωγή με 3 mM και 5 mM PPA (Εικ. 3ε, στ). Το OPA1 είναι ένας από τους κλασικούς ρυθμιστές της μιτοχονδριακής σύντηξης μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με τα MFN1 και 2 και παίζει ρόλο στην αναδιαμόρφωση των κρυστάλλων και στη μιτοχονδριακή μορφολογία53. Ο ακριβής ρόλος του STOML2 στη μιτοχονδριακή δυναμική παραμένει ασαφής, αλλά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι παίζει ρόλο στη μιτοχονδριακή σύντηξη, τη βιογένεση και τη μιτοφαγία.
Η STOML2 εμπλέκεται στη διατήρηση της μιτοχονδριακής αναπνευστικής σύζευξης και του σχηματισμού συμπλεγμάτων αναπνευστικής αλυσίδας54,55 και έχει αποδειχθεί ότι μεταβάλλει ριζικά τα μεταβολικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων56. Μελέτες έχουν δείξει ότι η STOML2 προάγει το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης και τη βιογένεση μέσω της αλληλεπίδρασης με το BAN και την καρδιολιπίνη 55, 57, 58. Επιπλέον, ανεξάρτητες μελέτες έχουν δείξει ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ STOML2 και PINK1 ρυθμίζει τη μιτοφαγία59,60. Αξίζει να σημειωθεί ότι η STOML2 έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά άμεσα με και σταθεροποιεί την MFN2 και παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση των μακρών ισομορφών OPA1 αναστέλλοντας την πρωτεάση που είναι υπεύθυνη για την αποικοδόμηση της OPA153,61,62. Η μείωση της έκφρασης STOML2 που παρατηρείται στις αντιδράσεις PPA μπορεί να κάνει αυτές τις πρωτεΐνες σύντηξης πιο ευάλωτες στην αποικοδόμηση μέσω οδών που εξαρτώνται από την ουβικιτίνη και το πρωτεάσωμα48. Αν και ο ακριβής ρόλος των STOML2 και OPA1 στη δυναμική απόκριση στο PPA είναι ασαφής, η μειωμένη έκφραση αυτών των γονιδίων σύντηξης (Σχήμα 3) μπορεί να διαταράξει την ισορροπία μεταξύ σχάσης και σύντηξης και να οδηγήσει σε μειωμένο μέγεθος μιτοχονδρίων (Σχήμα 3). 1).
Από την άλλη πλευρά, η έκφραση της πρωτεΐνης OPA1 παρέμεινε αμετάβλητη μετά από 24 ώρες, ενώ τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης των MFN1, MFN2 ή DRP1 δεν άλλαξαν σημαντικά μετά την επεξεργασία με PPA (Εικ. 3g-i, Εικ. 4). Αυτό μπορεί να υποδηλώνει ότι δεν υπάρχουν αλλαγές στη ρύθμιση αυτών των παραγόντων που εμπλέκονται στη μιτοχονδριακή σύντηξη και σχάση. Ωστόσο, αξίζει να σημειωθεί ότι καθένα από αυτά τα τέσσερα γονίδια ρυθμίζεται επίσης από μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις (PTMs) που ελέγχουν την πρωτεϊνική δραστηριότητα. Το OPA1 έχει οκτώ εναλλακτικές παραλλαγές συρραφής που διασπώνται πρωτεολυτικά στα μιτοχόνδρια για να παράγουν δύο διακριτές ισομορφές 63. Η ισορροπία μεταξύ μακρών και βραχέων ισομορφών καθορίζει τελικά τον ρόλο του OPA1 στη μιτοχονδριακή σύντηξη και τη διατήρηση του μιτοχονδριακού δικτύου 64. Η δραστηριότητα της DRP1 ρυθμίζεται από τη φωσφορυλίωση της πρωτεϊνικής κινάσης II που εξαρτάται από το ασβέστιο/καλμοδουλίνη (CaMKII), ενώ η αποικοδόμηση της DRP1 ρυθμίζεται από την ουβικιτίνη και την SUMOylation 65. Τέλος, τόσο η DRP1 όσο και η MFN1/2 είναι GTPάσες, επομένως η δραστικότητα μπορεί να επηρεάζεται από τον ρυθμό παραγωγής GTP στα μιτοχόνδρια 66. Επομένως, αν και η έκφραση αυτών των πρωτεϊνών παραμένει σταθερή, αυτό μπορεί να μην αντανακλά την αμετάβλητη πρωτεϊνική δραστικότητα ή τον εντοπισμό 67,68. Πράγματι, τα υπάρχοντα ρεπερτόρια πρωτεϊνών PTM συχνά χρησιμεύουν ως η πρώτη γραμμή άμυνας που είναι υπεύθυνη για τη μεσολάβηση οξέων αντιδράσεων στο στρες. Παρουσία μέτριου μεταβολικού στρες στο μοντέλο μας, είναι πιθανό η PTM να προάγει την αυξημένη δραστικότητα των πρωτεϊνών σύντηξης και σχάσης για την επαρκή αποκατάσταση της μιτοχονδριακής ακεραιότητας χωρίς να απαιτείται πρόσθετη ενεργοποίηση αυτών των γονιδίων σε επίπεδο mRNA ή πρωτεΐνης.
Συνολικά, τα παραπάνω δεδομένα υπογραμμίζουν την πολύπλοκη και χρονικά εξαρτώμενη ρύθμιση της μιτοχονδριακής μορφολογίας και τις προκλήσεις της διευκρίνισης αυτών των μηχανισμών. Για να μελετηθεί η γονιδιακή έκφραση, είναι πρώτα απαραίτητο να εντοπιστούν συγκεκριμένα γονίδια-στόχοι στην οδό. Ωστόσο, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τα γονίδια στην ίδια οδό δεν ανταποκρίνονται με τον ίδιο τρόπο στο ίδιο στρες. Στην πραγματικότητα, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι διαφορετικά γονίδια στην ίδια οδό μπορεί να εμφανίζουν διαφορετικά χρονικά προφίλ απόκρισης30,46. Επιπλέον, υπάρχουν πολύπλοκοι μετα-μεταγραφικοί μηχανισμοί που διαταράσσουν τη σχέση μεταξύ μεταγραφής και γονιδιακής λειτουργίας. Οι πρωτεωμικές μελέτες μπορούν να παρέχουν πληροφορίες για τον αντίκτυπο των PTM και της πρωτεϊνικής λειτουργίας, αλλά θέτουν επίσης προκλήσεις, όπως μεθόδους χαμηλής απόδοσης, υψηλές αναλογίες σήματος προς θόρυβο και χαμηλή ανάλυση.
Σε αυτό το πλαίσιο, η μελέτη της μιτοχονδριακής μορφολογίας χρησιμοποιώντας TEM και MEL έχει μεγάλες δυνατότητες να απαντήσει σε θεμελιώδη ερωτήματα σχετικά με τη σχέση μεταξύ της μιτοχονδριακής δυναμικής και λειτουργίας και πώς αυτή επηρεάζει τις ασθένειες. Το πιο σημαντικό, η TEM παρέχει μια άμεση μέθοδο για τη μέτρηση της μιτοχονδριακής μορφολογίας ως συγκλίνον τελικό σημείο της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας και δυναμικής51. Η MEL παρέχει επίσης μια άμεση μέθοδο για την απεικόνιση γεγονότων σχάσης και σύντηξης σε ένα τρισδιάστατο κυτταρικό περιβάλλον, επιτρέποντας την ποσοτικοποίηση της δυναμικής μιτοχονδριακής αναδιαμόρφωσης ακόμη και απουσία αλλαγών στην γονιδιακή έκφραση33. Εδώ επισημαίνουμε τη χρησιμότητα των τεχνικών μιτοχονδριακής απεικόνισης σε δευτερογενείς μιτοχονδριακές ασθένειες. Αυτές οι ασθένειες συνήθως χαρακτηρίζονται από χρόνιο ήπιο μεταβολικό στρες που χαρακτηρίζεται από ανεπαίσθητη αναδιαμόρφωση των μιτοχονδριακών δικτύων και όχι από οξεία μιτοχονδριακή βλάβη. Ωστόσο, η μιτοχονδριακή αντιστάθμιση που απαιτείται για τη διατήρηση της μίτωσης υπό χρόνιο στρες έχει βαθιές λειτουργικές συνέπειες. Στο πλαίσιο της νευροεπιστήμης, η καλύτερη κατανόηση αυτών των αντισταθμιστικών μηχανισμών μπορεί να παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την πλειοτροπική νευροπαθολογία που σχετίζεται με τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία.
Τελικά, τα δεδομένα μας υπογραμμίζουν τη χρησιμότητα των τεχνικών απεικόνισης για την κατανόηση των λειτουργικών συνεπειών των σύνθετων αλληλεπιδράσεων μεταξύ της γονιδιακής έκφρασης, των τροποποιήσεων πρωτεϊνών και της πρωτεϊνικής δραστηριότητας που ελέγχουν τη νευρωνική μιτοχονδριακή δυναμική. Χρησιμοποιήσαμε την PPA για να μοντελοποιήσουμε τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία σε ένα μοντέλο νευρωνικών κυττάρων για να αποκτήσουμε εικόνα για το μιτοχονδριακό συστατικό της ASD. Τα κύτταρα SH-SY5Y που υποβλήθηκαν σε αγωγή με PPA έδειξαν αλλαγές στη μιτοχονδριακή μορφολογία: τα μιτοχόνδρια έγιναν μικρά και στρογγυλά, και οι κροσσοί ήταν κακώς καθορισμένοι όταν παρατηρήθηκαν με TEM. Η ανάλυση MEL δείχνει ότι αυτές οι αλλαγές συμβαίνουν ταυτόχρονα με την αύξηση των συμβάντων σχάσης και σύντηξης για να διατηρηθεί το μιτοχονδριακό δίκτυο σε απόκριση σε ήπιο μεταβολικό στρες. Επιπλέον, η PPA διαταράσσει σημαντικά τη μεταγραφική ρύθμιση του μιτοχονδριακού μεταβολισμού και της ομοιόστασης. Εντοπίσαμε τα cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 και OPA1 ως βασικούς μιτοχονδριακούς ρυθμιστές που διαταράσσονται από το στρες της PPA και μπορεί να παίζουν ρόλο στη διαμεσολάβηση των αλλαγών που προκαλούνται από την PPA στη μιτοχονδριακή μορφολογία και λειτουργία. Απαιτούνται μελλοντικές μελέτες για τον καλύτερο χαρακτηρισμό των χρονικών αλλαγών που προκαλούνται από την PPA στην γονιδιακή έκφραση και την πρωτεϊνική δραστηριότητα, τον εντοπισμό και τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Τα δεδομένα μας υπογραμμίζουν την πολυπλοκότητα και την αλληλεξάρτηση των ρυθμιστικών μηχανισμών που μεσολαβούν στην απόκριση στο μιτοχονδριακό στρες και καταδεικνύουν τη χρησιμότητα της TEM και άλλων τεχνικών απεικόνισης για πιο στοχευμένες μηχανιστικές μελέτες.
Η κυτταρική σειρά SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich. Τα κύτταρα SH-SY5Y αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μείγμα θρεπτικών συστατικών Dulbecco's medium/F-12 (DMEM/F-12) και L-γλουταμίνης (SC09411, ScienCell) σε φιάλες των 25 cm2 συμπληρωμένες με 20% εμβρυϊκό ορό βοοειδών (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) στους 37 °C, 5% CO2. Τα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν σε 80% συρροή χρησιμοποιώντας 0,05% θρυψίνη-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), φυγοκεντρήθηκαν στα 300 g και τοποθετήθηκαν σε πλάκες σε πυκνότητα περίπου 7 × 105 κύτταρα/ml. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε αδιαφοροποίητα κύτταρα SH-SY5Y μεταξύ των περασμάτων 19-22. Το PPA χορηγείται ως NaP. Διαλύστε τη σκόνη NaP (CAS No. 137-40-6, χημικός τύπος C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) σε ζεστό νερό MilliQ σε συγκέντρωση 1 M και φυλάξτε το στους 4 °C. Την ημέρα της θεραπείας, αραιώστε αυτό το διάλυμα με 1 M PPA σε 3 mM και 5 mM PPA σε μέσο χωρίς ορό (DMEM/F-12 με L-γλουταμίνη). Οι συγκεντρώσεις θεραπείας για όλα τα πειράματα ήταν χωρίς PPA (0 mM, έλεγχος), 3 mM και 5 mM PPA. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τρία βιολογικά αντίγραφα.
Τα κύτταρα SH-SY5Y εμβολιάστηκαν σε φιάλες των 25 cm5 με ρυθμό 5,5 × 105 κύτταρα/ml και αναπτύχθηκαν για 24 ώρες. Η επεξεργασία με PPA προστέθηκε στη φιάλη πριν από 24 ώρες επώασης. Συλλέξτε τα σφαιρίδια κυττάρων ακολουθώντας τα κανονικά πρωτόκολλα υποκαλλιέργειας ιστών θηλαστικών (που περιγράφονται παραπάνω). Επαναιωρήστε το σφαιρίδιο κυττάρων σε 100 µl 2,5% γλουταραλδεΰδης, 1× PBS και φυλάξτε το στους 4 °C μέχρι την επεξεργασία. Τα κύτταρα SH-SY5Y φυγοκεντρήθηκαν σύντομα για να σφαιροποιηθούν τα κύτταρα και να απομακρυνθεί το διάλυμα 2,5% γλουταραλδεΰδης, 1× PBS. Επαναιωρήστε το ίζημα σε πήκτωμα αγαρόζης 4% που παρασκευάστηκε σε απεσταγμένο νερό (η αναλογία αγαρόζης προς όγκο ιζήματος είναι 1:1). Τα τεμάχια αγαρόζης τοποθετήθηκαν σε πλέγματα σε επίπεδες πλάκες και επικαλύφθηκαν με 1-δεκαεξένιο πριν από την κατάψυξη υψηλής πίεσης. Τα δείγματα καταψύχθηκαν σε 100% ξηρή ακετόνη στους -90°C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, η θερμοκρασία αυξήθηκε στους -80°C και προστέθηκε διάλυμα 1% τετροξειδίου του οσμίου και 0,1% γλουταραλδεΰδης. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80°C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, η θερμοκρασία αυξήθηκε σταδιακά σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετές ημέρες: από – 80 °C σε – 50 °C για 24 ώρες, σε – 30 °C για 24 ώρες, σε – 10 °C για 24 ώρες και τέλος σε θερμοκρασία δωματίου.
Μετά την κρυογονική παρασκευή, τα δείγματα εμποτίστηκαν με ρητίνη και κατασκευάστηκαν εξαιρετικά λεπτές τομές (∼100 nm) χρησιμοποιώντας έναν υπερμικροτόμο Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Οι τομές χρωματίστηκαν με 2% οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο. Τα δείγματα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (πρώην FEI), Αϊντχόφεν, Ολλανδία) που λειτουργούσε στα 200 kV (πομπός Lab6) και μια κάμερα Gatan CCD (Gatan, Ηνωμένο Βασίλειο) εξοπλισμένη με ένα ενεργειακό φίλτρο Tridiem.
Σε κάθε τεχνική επανάληψη, ελήφθησαν τουλάχιστον 24 εικόνες μεμονωμένων κυττάρων, για ένα σύνολο 266 εικόνων. Όλες οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μακροεντολή Περιοχής Ενδιαφέροντος (ROI) και τη μακροεντολή Μιτοχόνδρια. Η μακροεντολή μιτοχονδρίων βασίζεται σε δημοσιευμένες μεθόδους17,31,32 και επιτρέπει την ημιαυτόματη επεξεργασία παρτίδων εικόνων TEM στα Φίτζι/ImageJ69. Με λίγα λόγια: η εικόνα αντιστρέφεται και αναστρέφεται χρησιμοποιώντας αφαίρεση φόντου με κυλιόμενη μπάλα (ακτίνα 60 pixel) και ένα φίλτρο ζώνης διέλευσης FFT (χρησιμοποιώντας άνω και κάτω όρια 60 και 8 pixel αντίστοιχα) και καταστολή κάθετης γραμμής με ανοχή προσανατολισμού 5%. Η επεξεργασμένη εικόνα τίθεται αυτόματα σε κατώφλι χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο μέγιστης εντροπίας και δημιουργείται μια δυαδική μάσκα. Εξήχθησαν περιοχές εικόνας που σχετίζονται με χειροκίνητα επιλεγμένες ROI σε ακατέργαστες εικόνες TEM, χαρακτηρίζοντας τα μιτοχόνδρια και εξαιρώντας την πλασματική μεμβράνη και άλλες περιοχές υψηλής αντίθεσης. Για κάθε εξαγόμενη απόδοση επένδυσης (ROI), αναλύθηκαν δυαδικά σωματίδια μεγαλύτερα από 600 pixel και μετρήθηκε η επιφάνεια των σωματιδίων, η περίμετρος, οι κύριοι και δευτερεύοντες άξονες, η διάμετρος Feret, η στρογγυλότητα και η κυκλικότητα χρησιμοποιώντας τις ενσωματωμένες συναρτήσεις μέτρησης των Fiji/ImageJ. Σύμφωνα με τους Merrill, Flippo και Strack (2017), η επιφάνεια 2, ο λόγος διαστάσεων των σωματιδίων (λόγος κύριου προς δευτερεύοντα άξονα) και ο συντελεστής σχήματος (FF) υπολογίστηκαν από αυτά τα δεδομένα, όπου FF = περίμετρος 2/4pi x επιφάνεια. Ο ορισμός του παραμετρικού τύπου μπορεί να βρεθεί στους Merrill, Flippo και Strack (2017). Οι μακροεντολές που αναφέρονται είναι διαθέσιμες στο GitHub (βλ. Δήλωση Διαθεσιμότητας Δεδομένων). Κατά μέσο όρο, αναλύθηκαν περίπου 5.600 σωματίδια ανά επεξεργασία PPA, για συνολικά περίπου 17.000 σωματίδια (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται).
Τα κύτταρα SH-SH5Y τοποθετήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 8 θαλάμων (ThermoFisher, #155411) για να επιτραπεί η προσκόλληση όλη τη νύχτα και στη συνέχεια επωάστηκαν με TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) και Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας λέιζερ 405 nm και 561 nm σε περιβάλλον 10 λεπτών και οι ακατέργαστες εικόνες ελήφθησαν ως z-stacks που περιείχαν 10 μικρογραφίες εικόνας με βήμα az 0,2 μm μεταξύ των καρέ εικόνας σε 12 διαδοχικά χρονικά σημεία. Οι εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας μια πλατφόρμα υπερ-ανάλυσης Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία) χρησιμοποιώντας έναν φακό LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Οι εικόνες αναλύθηκαν στο ImageJ χρησιμοποιώντας έναν προηγουμένως περιγραφόμενο αγωγό και το πρόσθετο ImageJ για τη μέτρηση συμβάντων σύντηξης και σχάσης, του μέσου αριθμού μιτοχονδριακών δομών και του μέσου όγκου μιτοχονδρίων ανά κύτταρο33. Οι μακροεντολές MEL είναι διαθέσιμες στο GitHub (βλ. Δήλωση Διαθεσιμότητας Δεδομένων).
Τα κύτταρα SH-SY5Y αναπτύχθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα 0,3 × 106 κύτταρα/mL για 24 ώρες πριν από την επεξεργασία. Το RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) με μικρές τροποποιήσεις: προσθήκη 300 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης RNA σε κάθε φρεάτιο πριν από την αφαίρεση και λύση κάθε δείγματος ως τελικό βήμα με 30 μl έκλουσης DNase/RNase. νερό χωρίς DNase. Όλα τα δείγματα ελέγχθηκαν για ποσότητα και ποιότητα χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο UV-Vis NanoDrop ND-1000. Η συνολική πρωτεΐνη από τα κυτταρικά λύματα ελήφθη χρησιμοποιώντας 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης RIPA και η συγκέντρωση πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford70.
Η σύνθεση cDNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με ορισμένες τροποποιήσεις. Το cDNA συντέθηκε σε αντιδράσεις των 20 μl χρησιμοποιώντας 0,7 έως 1 μg ολικού RNA. Τα εκκινητές επιλέχθηκαν από προηγουμένως δημοσιευμένες εργασίες 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Πίνακας S1) και οι συνοδευτικοί ανιχνευτές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο PrimerQuest από την Integrated DNA Technologies. Όλα τα γονίδια ενδιαφέροντος ομαλοποιήθηκαν στο πυρηνικό γονίδιο B2M. Η γονιδιακή έκφραση των STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC και OPA1 μετρήθηκε με RT-qPCR. Το κύριο μείγμα περιελάμβανε LUNA Taq πολυμεράση (M3003L, New England Biolabs), 10 μM εμπρόσθιους και ανάστροφους εκκινητές, cDNA και νερό ποιότητας PCR για να δώσει τελικό όγκο 10 μL για κάθε αντίδραση. Η έκφραση των γονιδίων διαίρεσης και σχάσης (DRP1, MFN1/2) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας πολλαπλές δοκιμασίες TaqMan. Το Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με μικρές τροποποιήσεις. Το πολλαπλό κύριο μείγμα RT-qPCR περιλαμβάνει 1X LUNA Taq πολυμεράση, 10 μM εμπρόσθιους και ανάστροφους εκκινητές, 10 μM ανιχνευτή, cDNA και νερό ποιότητας PCR, με αποτέλεσμα τελικό όγκο 20 μL για κάθε αντίδραση. Η RT-qPCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—σειριακός αριθμός: R0618110). Οι συνθήκες κυκλικής κυκλοφορίας παρουσιάζονται στον Πίνακα S1. Όλα τα δείγματα cDNA ενισχύθηκαν εις τριπλούν και δημιουργήθηκε μια πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιώντας μια σειρά δεκαπλάσιων αραιώσεων. Οι ακραίες τιμές σε τριπλά δείγματα με τυπική απόκλιση κατωφλίου κύκλου (Ct) >0,5 αφαιρέθηκαν από την ανάλυση για να διασφαλιστεί η αναπαραγωγιμότητα των δεδομένων30,72. Η σχετική γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCt79.
Δείγματα πρωτεΐνης (60 μg) αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης Laemmli σε αναλογία 2:1 και εκτελέστηκαν σε άχρωμη πρωτεϊνική γέλη 12% (Bio-Rad #1610184). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (φθοριούχο πολυβινυλιδένιο) (#170-84156, Bio-Rad) χρησιμοποιώντας το σύστημα Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε και επωάστηκε με τα κατάλληλα πρωτογενή αντισώματα (OPA1, MFN1, MFN2 και DRP1) (αραιωμένα 1:1000) για 48 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση με δευτερογενή αντισώματα (1:10.000) για 1 ώρα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) και καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Bio-Rad ChemiDoc MP. Για την ανάλυση Western blot χρησιμοποιήθηκε η ImageLab έκδοση 6.1. Το αρχικό πήκτωμα και το στύπωμα παρουσιάζονται στο Σχήμα S1. Πληροφορίες για τα αντισώματα παρέχονται στον Πίνακα S2.
Τα σύνολα δεδομένων παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος και το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM) τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων δειγμάτων. Τα σύνολα δεδομένων ελέγχθηκαν για κανονικότητα χρησιμοποιώντας το τεστ Shapiro-Wilks (εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά) πριν από την υπόθεση μιας Γκαουσιανής κατανομής και ίσων τυπικών αποκλίσεων και τη συνέχιση των αναλύσεων. Εκτός από την ανάλυση του συνόλου δεδομένων χρησιμοποιώντας το Fisher's MEL LSD (p < 0,05), την μονόδρομη ANOVA (μέσος όρος θεραπείας έναντι ελέγχου) και το τεστ πολλαπλής σύγκρισης Dunnett για τον προσδιορισμό της σημαντικότητας (p < 0,05). Οι σημαντικές τιμές p εμφανίζονται στο γράφημα ως *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις και τα γραφήματα πραγματοποιήθηκαν και δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 9.4.0.
Οι μακροεντολές Fiji/ImageJ για ανάλυση εικόνας TEM είναι δημόσια διαθέσιμες στο GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Η μακροεντολή Mitochondrial Event Locator (MEL) είναι δημόσια διαθέσιμη στο GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM και Vijaya A. Μιτοχόνδρια: κύριοι ρυθμιστές του μεταβολισμού, της ομοιόστασης, του στρες, της γήρανσης και της επιγενετικής. Ινδονησιακά. Βιοϊατρική Επιστήμη. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Πολύπλευρη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία στη σχιζοφρένεια, το σύμπλεγμα Ι ως πιθανός παθολογικός στόχος. Schizophrenia. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. και Beal, MF Μιτοχονδριακή δυσλειτουργία στη νόσο του Πάρκινσον. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG και Mehta V. Μιτοχόνδρια υπό πίεση: στόχοι εισβολής στη νόσο Αλτσχάιμερ. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF και Ferreira GK Μιτοχόνδρια και εγκέφαλος: βιοενεργειακή και άλλα. Νευροτοξίνες. resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Πλειοτροπικά μιτοχόνδρια: η επίδραση των μιτοχονδρίων στην νευρωνική ανάπτυξη και τις ασθένειες. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. και Morais, VA Μιτοχονδριακή βιογένεση σε νευρώνες: πώς και πού. Διεθνισμός. J. Mohr. η επιστήμη. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. και Zhao, J. Ρύθμιση της μιτοχονδριακής δυναμικής των θηλαστικών: ευκαιρίες και προκλήσεις. front. endocrine. (Λωζάνη) 11, 374 (2020).
Khacho, M. και Slack, RS Μιτοχονδριακή δυναμική στη ρύθμιση της νευρογένεσης: από τον αναπτυσσόμενο έως τον ενήλικο εγκέφαλο. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).