Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη για CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Τα νανοσωματίδια ινσουλίνης (NPs) με υψηλή περιεκτικότητα σε φορτίο έχουν βρει διαφορετικές εφαρμογές σε διαφορετικές δοσολογικές μορφές. Αυτή η εργασία στοχεύει στην αξιολόγηση της επίδρασης των διεργασιών λυοφιλίωσης και ξήρανσης με ψεκασμό στη δομή των νανοσωματιδίων χιτοζάνης φορτωμένων με ινσουλίνη, με ή χωρίς μαννιτόλη ως κρυοπροστατευτικό. Αξιολογήσαμε επίσης την ποιότητα αυτών των νανοσωματιδίων επαναδιαλύοντάς τα. Πριν από την αφυδάτωση, το μέγεθος σωματιδίων των νανοσωματιδίων χιτοζάνης/τριπολυφωσφορικού νατρίου/ινσουλίνης με σταυροειδείς δεσμούς βελτιστοποιήθηκε στα 318 nm, ο PDI ήταν 0,18, η απόδοση ενθυλάκωσης ήταν 99,4% και η φόρτωση ήταν 25,01%. Μετά την ανασύσταση, όλα τα νανοσωματίδια, εκτός από αυτά που παρήχθησαν με μέθοδο λυοφιλίωσης χωρίς τη χρήση μαννιτόλης, διατήρησαν τη σφαιρική δομή των σωματιδίων τους. Σε σύγκριση με τα νανοσωματίδια που περιέχουν μαννιτόλη και αφυδατώθηκαν με ψεκασμό, τα νανοσωματίδια που ξηράνθηκαν με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη εμφάνισαν επίσης το μικρότερο μέσο μέγεθος σωματιδίων (376 nm) και την υψηλότερη περιεκτικότητα σε φορτίο. (25,02%) με παρόμοιο ποσοστό ενθυλάκωσης (98,7%) και PDI (0,20) με τεχνικές ξήρανσης ή λυοφιλίωσης. Τα ξηραμένα νανοσωματίδια με ξήρανση με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη είχαν επίσης ως αποτέλεσμα την ταχύτερη απελευθέρωση ινσουλίνης και την υψηλότερη απόδοση κυτταρικής πρόσληψης. Αυτή η εργασία δείχνει ότι η ξήρανση με ψεκασμό μπορεί να αφυδατώσει τα νανοσωματίδια ινσουλίνης χωρίς την ανάγκη κρυοπροστατευτικών σε σύγκριση με τις συμβατικές μεθόδους λυοφιλίωσης, δημιουργώντας μεγαλύτερη χωρητικότητα φόρτωσης, χαμηλότερες απαιτήσεις προσθέτων και σημαντικό πλεονέκτημα στο λειτουργικό κόστος.
Από την ανακάλυψή της το 19221,2,3, η ινσουλίνη και τα φαρμακευτικά της παρασκευάσματα έχουν σώσει τις ζωές ασθενών με διαβήτη τύπου 1 (ΣΔΤ1) και διαβήτη τύπου 2 (ΣΔΤ1). Ωστόσο, λόγω των ιδιοτήτων της ως πρωτεΐνης υψηλού μοριακού βάρους, η ινσουλίνη συσσωματώνεται εύκολα, διασπάται από πρωτεολυτικά ένζυμα και αποβάλλεται με το φαινόμενο πρώτης διόδου. Τα άτομα που έχουν διαγνωστεί με διαβήτη τύπου 1 χρειάζονται ενέσεις ινσουλίνης για το υπόλοιπο της ζωής τους. Πολλοί ασθενείς που αρχικά διαγνώστηκαν με διαβήτη τύπου 2 χρειάζονται επίσης μακροχρόνιες ενέσεις ινσουλίνης. Οι καθημερινές ενέσεις ινσουλίνης αποτελούν σοβαρή πηγή καθημερινού πόνου και δυσφορίας για αυτά τα άτομα, με αρνητικές επιπτώσεις στην ψυχική υγεία. Ως αποτέλεσμα, άλλες μορφές χορήγησης ινσουλίνης που προκαλούν λιγότερη δυσφορία, όπως η χορήγηση ινσουλίνης από το στόμα, μελετώνται εκτενώς5, καθώς έχουν τη δυνατότητα να αποκαταστήσουν την ποιότητα ζωής περίπου 5 δισεκατομμυρίων ανθρώπων με διαβήτη παγκοσμίως.
Η τεχνολογία νανοσωματιδίων έχει προσφέρει σημαντική πρόοδο στις προσπάθειες λήψης ινσουλίνης από το στόμα4,6,7. Μία τεχνολογία που αποτελεσματικά ενθυλακώνει και προστατεύει την ινσουλίνη από την αποικοδόμηση για στοχευμένη χορήγηση σε συγκεκριμένα σημεία του σώματος. Ωστόσο, η χρήση σκευασμάτων νανοσωματιδίων έχει αρκετούς περιορισμούς, κυρίως λόγω ζητημάτων σταθερότητας των εναιωρημάτων σωματιδίων. Μπορεί να εμφανιστεί κάποια συσσωμάτωση κατά την αποθήκευση, η οποία μειώνει τη βιοδιαθεσιμότητα των νανοσωματιδίων που περιέχουν ινσουλίνη8. Επιπλέον, πρέπει επίσης να λαμβάνεται υπόψη η χημική σταθερότητα της πολυμερικής μήτρας των νανοσωματιδίων και της ινσουλίνης για να διασφαλιστεί η σταθερότητα των νανοσωματιδίων ινσουλίνης (NPs). Επί του παρόντος, η τεχνολογία λυοφιλίωσης είναι το χρυσό πρότυπο για τη δημιουργία σταθερών NPs, αποτρέποντας παράλληλα ανεπιθύμητες αλλαγές κατά την αποθήκευση9.
Ωστόσο, η λυοφιλίωση απαιτεί την προσθήκη κρυοπροστατευτικών για να αποτραπεί η επίδραση της σφαιρικής δομής των νανοσωματιδίων από τη μηχανική καταπόνηση των κρυστάλλων πάγου. Αυτό μειώνει σημαντικά τη φόρτωση νανοσωματιδίων ινσουλίνης μετά τη λυοφιλοποίηση, καθώς το κρυοπροστατευτικό καταλαμβάνει το μεγαλύτερο μέρος της αναλογίας βάρους. Επομένως, τα παραγόμενα νανοσωματίδια ινσουλίνης συχνά θεωρούνται ακατάλληλα για την παρασκευή σκευασμάτων ξηρής σκόνης, όπως δισκία για χορήγηση από το στόμα και μεμβράνες για χορήγηση από το στόμα, λόγω της ανάγκης για μεγάλες ποσότητες ξηρών νανοσωματιδίων για την επίτευξη του θεραπευτικού παραθύρου της ινσουλίνης.
Η ξήρανση με ψεκασμό είναι μια πολύ γνωστή και φθηνή διαδικασία βιομηχανικής κλίμακας για την παραγωγή ξηρών σκονών από υγρές φάσεις στη φαρμακευτική βιομηχανία10,11. Ο έλεγχος της διαδικασίας σχηματισμού σωματιδίων επιτρέπει την σωστή ενθυλάκωση αρκετών βιοδραστικών ενώσεων12, 13. Επιπλέον, έχει γίνει μια αποτελεσματική τεχνική για την παρασκευή ενθυλακωμένων πρωτεϊνών για χορήγηση από το στόμα. Κατά την ξήρανση με ψεκασμό, το νερό εξατμίζεται πολύ γρήγορα, γεγονός που βοηθά στη διατήρηση της χαμηλής θερμοκρασίας του πυρήνα των σωματιδίων11,14, επιτρέποντας την εφαρμογή του για την ενθυλάκωση θερμοευαίσθητων συστατικών. Πριν από την ξήρανση με ψεκασμό, το υλικό επικάλυψης θα πρέπει να ομογενοποιηθεί πλήρως με το διάλυμα που περιέχει τα ενθυλακωμένα συστατικά11,14. Σε αντίθεση με την ξήρανση με κατάψυξη, η ομογενοποίηση πριν από την ενθυλάκωση στην ξήρανση με ψεκασμό βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της ενθυλάκωσης κατά την αφυδάτωση. Δεδομένου ότι η διαδικασία ενθυλάκωσης με ξήρανση με ψεκασμό δεν απαιτεί κρυοπροστατευτικά, η ξήρανση με ψεκασμό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή αποξηραμένων νανοσωματιδίων με υψηλή περιεκτικότητα σε φορτίο.
Αυτή η μελέτη αναφέρει την παραγωγή νανοσωματιδίων φορτωμένων με ινσουλίνη μέσω διασύνδεσης χιτοζάνης και τριπολυφωσφορικού νατρίου χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ιοντικής γέλης. Η ιοντική ζελατινοποίηση είναι μια μέθοδος παρασκευής που επιτρέπει την παραγωγή νανοσωματιδίων μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ δύο ή περισσότερων ιοντικών ειδών υπό ορισμένες συνθήκες. Χρησιμοποιήθηκαν τόσο τεχνικές λυοφιλοποίησης όσο και τεχνικές ψεκασμού για την αφυδάτωση των βελτιστοποιημένων νανοσωματιδίων χιτοζάνης/τριπολυφωσφορικού νατρίου/ινσουλίνης που είχαν διασυνδεθεί. Μετά την αφυδάτωση, η μορφολογία τους αναλύθηκε με SEM. Η ικανότητα ανασυνδυασμού τους αξιολογήθηκε μετρώντας την κατανομή μεγέθους, το επιφανειακό φορτίο, τον PDI, την αποτελεσματικότητα ενθυλάκωσης και την περιεκτικότητα φόρτωσης. Η ποιότητα των επαναδιαλυμένων νανοσωματιδίων που παράγονται με διαφορετικές μεθόδους αφυδάτωσης αξιολογήθηκε επίσης συγκρίνοντας την προστασία τους από την ινσουλίνη, τη συμπεριφορά απελευθέρωσης και την αποτελεσματικότητα κυτταρικής πρόσληψης.
Το pH του μικτού διαλύματος και η αναλογία χιτοζάνης και ινσουλίνης είναι δύο βασικοί παράγοντες που επηρεάζουν το μέγεθος των σωματιδίων και την απόδοση ενθυλάκωσης (EE) των τελικών νανοσωματιδίων, καθώς επηρεάζουν άμεσα τη διαδικασία ιοντοτροπικής ζελατινοποίησης. Το pH του μικτού διαλύματος αποδείχθηκε ότι συσχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με το μέγεθος των σωματιδίων και την απόδοση ενθυλάκωσης (Εικ. 1α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1α, καθώς το pH αυξήθηκε από 4,0 σε 6,0, το μέσο μέγεθος σωματιδίων (nm) μειώθηκε και η EE αυξήθηκε σημαντικά, ενώ όταν το pH αυξήθηκε σε 6,5, το μέσο μέγεθος σωματιδίων άρχισε να αυξάνεται και η EE παρέμεινε αμετάβλητη. Καθώς αυξάνεται η αναλογία χιτοζάνης προς ινσουλίνη, αυξάνεται και το μέσο μέγεθος σωματιδίων. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στην EE όταν τα νανοσωματίδια παρασκευάστηκαν σε αναλογία μάζας χιτοζάνης/ινσουλίνης υψηλότερη από 2,5:1 (w/w) (Εικ. 1β). Επομένως, οι βέλτιστες συνθήκες παρασκευής σε αυτή τη μελέτη (pH 6,0, αναλογία μάζας χιτοζάνης/ινσουλίνης 2,5:1) χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή νανοσωματιδίων φορτωμένων με ινσουλίνη για περαιτέρω μελέτη. Υπό αυτές τις συνθήκες παρασκευής, το μέσο μέγεθος σωματιδίων των νανοσωματιδίων ινσουλίνης βελτιστοποιήθηκε στα 318 nm (Εικ. 1c), ο PDI ήταν 0,18, η απόδοση ενσωμάτωσης ήταν 99,4%, το δυναμικό ζήτα ήταν 9,8 mv και η φόρτωση ινσουλίνης ήταν 25,01% (m/m2). Με βάση τα αποτελέσματα της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης (TEM), τα βελτιστοποιημένα νανοσωματίδια ήταν περίπου σφαιρικά και διακριτά με σχετικά ομοιόμορφο μέγεθος (Εικ. 1d).
Βελτιστοποίηση παραμέτρων νανοσωματιδίων ινσουλίνης: (α) η επίδραση του pH στη μέση διάμετρο και την απόδοση ενθυλάκωσης (EE) των νανοσωματιδίων ινσουλίνης (παρασκευασμένα σε αναλογία μάζας χιτοζάνης και ινσουλίνης 5:1)· (β) χιτοζάνη και επίδραση της αναλογίας μάζας της ινσουλίνης στη μέση διάμετρο και την απόδοση ενθυλάκωσης (EE) των νανοσωματιδίων ινσουλίνης (παρασκευασμένα σε pH 6)· (γ) κατανομή μεγέθους σωματιδίων βελτιστοποιημένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης· (δ) Μικρογραφία TEM βελτιστοποιημένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης.
Είναι γνωστό ότι η χιτοζάνη είναι ένας ασθενής πολυηλεκτρολύτης με pKa 6,5. Είναι θετικά φορτισμένη σε όξινα μέσα επειδή η κύρια αμινομάδα της πρωτονιώνεται από ιόντα υδρογόνου15. Επομένως, χρησιμοποιείται συχνά ως φορέας για την ενθυλάκωση αρνητικά φορτισμένων μακρομορίων. Σε αυτή τη μελέτη, η χιτοζάνη χρησιμοποιήθηκε για την ενθυλάκωση ινσουλίνης με ισοηλεκτρικό σημείο 5,3. Δεδομένου ότι η χιτοζάνη χρησιμοποιείται ως υλικό επικάλυψης, με την αύξηση της αναλογίας της, το πάχος του εξωτερικού στρώματος των νανοσωματιδίων αυξάνεται αντίστοιχα, με αποτέλεσμα ένα μεγαλύτερο μέσο μέγεθος σωματιδίων. Επιπλέον, υψηλότερα επίπεδα χιτοζάνης μπορούν να ενθυλακώσουν περισσότερη ινσουλίνη. Στην περίπτωσή μας, η EE ήταν υψηλότερη όταν η αναλογία χιτοζάνης και ινσουλίνης έφτασε το 2,5:1 και δεν υπήρξε σημαντική αλλαγή στην EE όταν η αναλογία συνέχισε να αυξάνεται.
Εκτός από την αναλογία χιτοζάνης και ινσουλίνης, το pH έπαιξε επίσης κρίσιμο ρόλο στην παρασκευή νανοσωματιδίων. Οι Gan et al. 17 μελέτησαν την επίδραση του pH στο μέγεθος των σωματιδίων των νανοσωματιδίων χιτοζάνης. Διαπίστωσαν μια συνεχή μείωση στο μέγεθος των σωματιδίων μέχρι το pH να φτάσει στο 6,0, και παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στο μέγεθος των σωματιδίων σε pH > 6,0, η οποία είναι σύμφωνη με τις παρατηρήσεις μας. Αυτό το φαινόμενο οφείλεται στο γεγονός ότι με την αύξηση του pH, το μόριο ινσουλίνης αποκτά αρνητικό επιφανειακό φορτίο, ευνοώντας έτσι τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις με το σύμπλοκο χιτοζάνης/τριπολυφωσφορικού νατρίου (TPP), με αποτέλεσμα μικρό μέγεθος σωματιδίων και υψηλή EE. Ωστόσο, όταν το pH ρυθμίστηκε στο 6,5, οι αμινομάδες στη χιτοζάνη αποπρωτονιώθηκαν, με αποτέλεσμα την αναδίπλωση της χιτοζάνης. Έτσι, το υψηλό pH έχει ως αποτέλεσμα μικρότερη έκθεση των αμινο-ιόντων στην TPP και την ινσουλίνη, με αποτέλεσμα χαμηλότερη διασύνδεση, μεγαλύτερο τελικό μέσο μέγεθος σωματιδίων και χαμηλότερη EE.
Η ανάλυση των μορφολογικών ιδιοτήτων των λυοφιλιωμένων και ψεκασμένων νανοσωματιδίων (NPs) μπορεί να καθοδηγήσει την επιλογή καλύτερων τεχνικών αφυδάτωσης και σχηματισμού σκόνης. Η προτιμώμενη μέθοδος θα πρέπει να παρέχει σταθερότητα φαρμάκου, ομοιόμορφο σχήμα σωματιδίων, υψηλό φορτίο φαρμάκου και καλή διαλυτότητα στο αρχικό διάλυμα. Σε αυτή τη μελέτη, για την καλύτερη σύγκριση των δύο τεχνικών, χρησιμοποιήθηκαν νανοσωματίδια ινσουλίνης με ή χωρίς 1% μαννιτόλη κατά την αφυδάτωση. Η μαννιτόλη χρησιμοποιείται ως παράγοντας διογκώσεως ή κρυοπροστατευτικό σε διάφορες συνθέσεις ξηρής σκόνης για λυοφιλοποίηση και ξήρανση με ψεκασμό. Για τα λυοφιλοποιημένα νανοσωματίδια ινσουλίνης χωρίς μαννιτόλη, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2α, παρατηρήθηκε μια εξαιρετικά πορώδης δομή σκόνης με μεγάλες, ακανόνιστες και τραχιές επιφάνειες υπό ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM). Λίγα διακριτά σωματίδια ανιχνεύθηκαν στη σκόνη μετά την αφυδάτωση (Εικ. 2ε). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα περισσότερα νανοσωματίδια αποσυντέθηκαν κατά την λυοφιλοποίηση χωρίς κανένα κρυοπροστατευτικό. Για τα λυοφιλιωμένα και ψεκασμένα νανοσωματίδια ινσουλίνης που περιείχαν 1% μαννιτόλη, παρατηρήθηκαν σφαιρικά νανοσωματίδια με λείες επιφάνειες (Εικ. 2b,d,f,h). Τα νανοσωματίδια ινσουλίνης που ξηράνθηκαν με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη παρέμειναν σφαιρικά αλλά ζαρωμένα στην επιφάνεια (Εικ. 2c). Οι σφαιρικές και ζαρωμένες επιφάνειες συζητούνται περαιτέρω στις δοκιμές συμπεριφοράς απελευθέρωσης και κυτταρικής πρόσληψης παρακάτω. Με βάση την ορατή εμφάνιση των ξηραμένων νανοσωματιδίων, τόσο τα νανοσωματίδια που ξηράνθηκαν με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη όσο και τα νανοσωματίδια που ξηράνθηκαν με κατάψυξη και τα νανοσωματίδια που ξηράνθηκαν με ψεκασμό με μαννιτόλη απέδωσαν λεπτές σκόνες νανοσωματιδίων (Εικ. 2f,g,h). Όσο μεγαλύτερη είναι η επιφάνεια μεταξύ των επιφανειών των σωματιδίων, τόσο υψηλότερη είναι η διαλυτότητα και επομένως τόσο υψηλότερος είναι ο ρυθμός απελευθέρωσης.
Μορφολογία διαφορετικών αφυδατωμένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης: (α) Εικόνα SEM λυοφιλοποιημένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης χωρίς μαννιτόλη· (β) Εικόνα SEM λυοφιλοποιημένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης με μαννιτόλη· (γ) νανοσωματίδια ινσουλίνης ξηραμένα με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη. Εικόνα SEM του · (δ) Εικόνα SEM νανοσωματιδίων ινσουλίνης ξηραμένα με ψεκασμό με μαννιτόλη· (ε) εικόνα λυοφιλοποιημένης σκόνης νανοσωματιδίων ινσουλίνης χωρίς μαννιτόλη· (στ) εικόνα λυοφιλοποιημένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης με μαννιτόλη· (ζ) Εικόνα σκόνης νανοσωματιδίων ινσουλίνης ξηραμένης με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη· (η) εικόνα σκόνης νανοσωματιδίων ινσουλίνης ξηραμένης με ψεκασμό με μαννιτόλη.
Κατά την λυοφιλίωση, η μαννιτόλη δρα ως κρυοπροστατευτικό, διατηρώντας τα νανοσωματίδια (NPs) σε άμορφη μορφή και αποτρέποντας τη βλάβη από κρυστάλλους πάγου19. Αντίθετα, δεν υπάρχει στάδιο κατάψυξης κατά την ψεκαστική ξήρανση. Επομένως, η μαννιτόλη δεν απαιτείται σε αυτή τη μέθοδο. Στην πραγματικότητα, τα νανοσωματίδια που ξηράνθηκαν με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη απέδωσαν λεπτότερα νανοσωματίδια όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Ωστόσο, η μαννιτόλη μπορεί ακόμα να λειτουργήσει ως πληρωτικό στη διαδικασία ψεκαστικής ξήρανσης για να δώσει στα νανοσωματίδια μια πιο σφαιρική δομή20 (Εικ. 2δ), η οποία βοηθά στην επίτευξη ομοιόμορφης συμπεριφοράς απελευθέρωσης τέτοιων ενθυλακωμένων νανοσωματιδίων. Επιπλέον, είναι σαφές ότι ορισμένα μεγάλα σωματίδια μπορούν να ανιχνευθούν τόσο σε λυοφιλιωμένα όσο και σε ψεκαζόμενα νανοσωματίδια ινσουλίνης που περιέχουν μαννιτόλη (Εικ. 2β,δ), κάτι που μπορεί να οφείλεται στη συσσώρευση μαννιτόλης στον πυρήνα των σωματιδίων μαζί με την ενθυλακωμένη ινσουλίνη. Προς. Στρώμα χιτοζάνης. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε αυτή τη μελέτη, προκειμένου να διασφαλιστεί ότι η σφαιρική δομή παραμένει άθικτη μετά την αφυδάτωση, η αναλογία μαννιτόλης και χιτοζάνης διατηρείται στο 5:1, έτσι ώστε μια μεγάλη ποσότητα πληρωτικού να μπορεί επίσης να μεγεθύνει το μέγεθος των σωματιδίων των αποξηραμένων νανοσωματιδίων.
Η φασματοσκοπία FTIR-ATR (υπέρυθρη εξασθενημένη ολική ανάκλαση) με μετασχηματισμό Fourier χαρακτήρισε το φυσικό μείγμα ελεύθερης ινσουλίνης, χιτοζάνης, χιτοζάνης, TPP και ινσουλίνης. Όλα τα αφυδατωμένα νανοσωματίδια χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία FTIR-ATR. Αξιοσημείωτα, παρατηρήθηκαν εντάσεις ζωνών 1641, 1543 και 1412 cm-1 σε ενθυλακωμένα νανοσωματίδια που λυοφιλιώθηκαν με μαννιτόλη και σε νανοσωματίδια που ξηράνθηκαν με ψεκασμό με και χωρίς μαννιτόλη (Εικ. 3). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, αυτές οι αυξήσεις στην ισχύ συσχετίστηκαν με διασταυρούμενη σύνδεση μεταξύ χιτοζάνης, TPP και ινσουλίνης. Η διερεύνηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ χιτοζάνης και ινσουλίνης έδειξε ότι στα φάσματα FTIR των νανοσωματιδίων χιτοζάνης φορτωμένων με ινσουλίνη, η ζώνη χιτοζάνης επικαλύπτεται με αυτή της ινσουλίνης, αυξάνοντας την ένταση καρβονυλίου (1641 cm-1) και την ζώνη αμίνης (1543 cm-1). Οι τριπολυφωσφορικές ομάδες της TPP συνδέονται με ομάδες αμμωνίου στη χιτοζάνη, σχηματίζοντας μια ζώνη στα 1412 cm-1.
Φάσματα FTIR-ATR ελεύθερης ινσουλίνης, χιτοζάνης, φυσικών μειγμάτων χιτοζάνης/TPP/ινσουλίνης και νανοσωματιδίων αφυδατωμένα με διαφορετικές μεθόδους.
Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με αυτά που παρουσιάζονται στο SEM, το οποίο έδειξε ότι τα ενθυλακωμένα νανοσωματίδια παρέμειναν άθικτα τόσο όταν ψεκάστηκαν όσο και όταν λυοφιλοποιήθηκαν με μαννιτόλη, αλλά απουσία μαννιτόλης, μόνο η ξήρανση με ψεκασμό παρήγαγε ενθυλακωμένα σωματίδια. Αντίθετα, τα φασματικά αποτελέσματα FTIR-ATR των νανοσωματιδίων που λυοφιλοποιήθηκαν χωρίς μαννιτόλη ήταν πολύ παρόμοια με το φυσικό μείγμα χιτοζάνης, TPP και ινσουλίνης. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι οι διασταυρούμενες συνδέσεις μεταξύ χιτοζάνης, TPP και ινσουλίνης δεν υπάρχουν πλέον σε νανοσωματίδια που λυοφιλοποιήθηκαν χωρίς μαννιτόλη. Η δομή των νανοσωματιδίων καταστράφηκε κατά την λυοφιλοποίηση χωρίς κρυοπροστατευτικό, κάτι που φαίνεται στα αποτελέσματα SEM (Εικ. 2α). Με βάση τη μορφολογία και τα αποτελέσματα FTIR των αφυδατωμένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης, μόνο λυοφιλοποιημένα, ξηραμένα με ψεκασμό και χωρίς μαννιτόλη νανοσωματίδια χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα ανασύστασης και νανοσωματίδια χωρίς μαννιτόλη λόγω της αποσύνθεσης των νανοσωματιδίων χωρίς μαννιτόλη κατά την αφυδάτωση. Συζητήστε.
Η αφυδάτωση χρησιμοποιείται για μακροχρόνια αποθήκευση και επανεπεξεργασία σε άλλα σκευάσματα. Η ικανότητα των ξηρών νανοσωματιδίων να ανασυσταθούν μετά την αποθήκευση είναι κρίσιμη για τη χρήση τους σε διαφορετικά σκευάσματα, όπως δισκία και μεμβράνες. Παρατηρήσαμε ότι το μέσο μέγεθος σωματιδίων των νανοσωματιδίων ινσουλίνης που ξηράνθηκαν με ψεκασμό απουσία μαννιτόλης αυξήθηκε μόνο ελαφρώς μετά την ανασύσταση. Από την άλλη πλευρά, το μέγεθος σωματιδίων των νανοσωματιδίων ινσουλίνης που ξηράνθηκαν με ψεκασμό και λυοφιλοποιήθηκαν με μαννιτόλη αυξήθηκε σημαντικά (Πίνακας 1). Ο PDI και η EE δεν άλλαξαν σημαντικά (p > 0,05) μετά τον ανασυνδυασμό όλων των νανοσωματιδίων σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας 1). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι τα περισσότερα από τα σωματίδια παρέμειναν άθικτα μετά την επαναδιάλυση. Ωστόσο, η προσθήκη μαννιτόλης είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του φορτίου ινσουλίνης των λυοφιλοποιημένων και ξηραμένων με ψεκασμό νανοσωματιδίων μαννιτόλης (Πίνακας 1). Αντίθετα, η περιεκτικότητα σε φορτίο ινσουλίνης των νανοσωματιδίων που ξηράνθηκαν με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη παρέμεινε η ίδια όπως πριν (Πίνακας 1).
Είναι γνωστό ότι η φόρτωση νανοσωματιδίων είναι κρίσιμη όταν χρησιμοποιείται για σκοπούς χορήγησης φαρμάκων. Για νανοσωματίδια με χαμηλά φορτία, απαιτούνται πολύ μεγάλες ποσότητες υλικού για να επιτευχθεί το θεραπευτικό όριο. Ωστόσο, το υψηλό ιξώδες τέτοιων υψηλών συγκεντρώσεων νανοσωματιδίων οδηγεί σε ταλαιπωρία και δυσκολία στην από του στόματος χορήγηση και στα ενέσιμα σκευάσματα, αντίστοιχα 22. Επιπλέον, τα νανοσωματίδια ινσουλίνης μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την παρασκευή δισκίων και ιξωδών βιοφίλμ 23, 24, κάτι που απαιτεί τη χρήση μεγάλων ποσοτήτων νανοσωματιδίων σε χαμηλά επίπεδα φόρτωσης, με αποτέλεσμα μεγάλα δισκία και παχιά βιοφίλμ που δεν είναι κατάλληλα για από του στόματος εφαρμογές. Επομένως, τα αφυδατωμένα νανοσωματίδια με υψηλό φορτίο ινσουλίνης είναι ιδιαίτερα επιθυμητά. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το υψηλό φορτίο ινσουλίνης των νανοσωματιδίων που έχουν ξηρανθεί με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη μπορεί να προσφέρει πολλά ελκυστικά πλεονεκτήματα για αυτές τις εναλλακτικές μεθόδους χορήγησης.
Όλα τα αφυδατωμένα νανοσωματίδια (ΝΑ) διατηρήθηκαν στο ψυγείο για τρεις μήνες. Τα αποτελέσματα της Ηλεκτρομαγνητικής Τομογραφίας (SEM) έδειξαν ότι η μορφολογία όλων των αφυδατωμένων νανοσωματιδίων δεν άλλαξε σημαντικά κατά τη διάρκεια της τρίμηνης αποθήκευσης (Εικ. 4). Μετά την ανασύσταση σε νερό, όλα τα νανοσωματίδια παρουσίασαν ελαφρά μείωση στην EE και απελευθέρωσαν περίπου μια μικρή ποσότητα (~5%) ινσουλίνης κατά τη διάρκεια της τρίμηνης περιόδου αποθήκευσης (Πίνακας 2). Ωστόσο, το μέσο μέγεθος σωματιδίων όλων των νανοσωματιδίων αυξήθηκε. Το μέγεθος σωματιδίων των νανοσωματιδίων που ξηράνθηκαν με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη αυξήθηκε στα 525 nm, ενώ αυτό των νανοσωματιδίων που ξηράνθηκαν με ψεκασμό και των νανοσωματιδίων που ξηράνθηκαν με κατάψυξη με μαννιτόλη αυξήθηκε στα 872 και 921 nm, αντίστοιχα (Πίνακας 2).
Μορφολογία διαφορετικών αφυδατωμένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης που αποθηκεύτηκαν για τρεις μήνες: (α) Εικόνα SEM λυοφιλοποιημένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης με μαννιτόλη· (β) Εικόνα SEM νανοσωματιδίων ινσουλίνης που έχουν ξηρανθεί με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη· (γ) χωρίς μαννιτόλη Εικόνες SEM νανοσωματιδίων ινσουλίνης που έχουν ξηρανθεί με ψεκασμό.
Επιπλέον, παρατηρήθηκαν ιζήματα στα ανασυσταμένα νανοσωματίδια ινσουλίνης που ξηράνθηκαν με ψεκασμό με μαννιτόλη και λυοφιλοποιήθηκαν (Εικ. S2). Αυτό μπορεί να οφείλεται σε μεγάλα σωματίδια που δεν αιωρούνται σωστά στο νερό. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η τεχνική ξήρανσης με ψεκασμό μπορεί να προστατεύσει τα νανοσωματίδια ινσουλίνης από την αφυδάτωση και ότι μπορούν να ληφθούν υψηλά φορτία νανοσωματιδίων ινσουλίνης χωρίς πληρωτικά ή κρυοπροστατευτικά.
Η κατακράτηση ινσουλίνης δοκιμάστηκε σε μέσο pH = 2,5 με πεψίνη, τρυψίνη και α-χυμοθρυψίνη για να αποδειχθεί η προστατευτική ικανότητα των νανοσωματιδίων έναντι της ενζυματικής πέψης μετά την αφυδάτωση. Η κατακράτηση ινσουλίνης των αφυδατωμένων νανοσωματιδίων συγκρίθηκε με αυτή των φρεσκοπαρασκευασμένων νανοσωματιδίων και η ελεύθερη ινσουλίνη χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Σε αυτή τη μελέτη, η ελεύθερη ινσουλίνη έδειξε ταχεία αποβολή ινσουλίνης εντός 4 ωρών και στις τρεις ενζυματικές επεξεργασίες (Εικ. 5α-γ). Αντίθετα, η δοκιμή αποβολής ινσουλίνης νανοσωματιδίων που λυοφιλοποιήθηκαν με μαννιτόλη και νανοσωματιδίων που ξηράνθηκαν με ψεκασμό με ή χωρίς μαννιτόλη έδειξε σημαντικά υψηλότερη προστασία αυτών των νανοσωματιδίων έναντι της ενζυματικής πέψης, η οποία ήταν παρόμοια με αυτή των φρεσκοπαρασκευασμένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης (εικόνα 1).5α-γ). Με τη βοήθεια νανοσωματιδίων σε πεψίνη, τρυψίνη και α-χυμοθρυψίνη, περισσότερο από 50%, 60% και 75% της ινσουλίνης μπορούσε να προστατευθεί εντός 4 ωρών, αντίστοιχα (Εικ. 5α-γ). Αυτή η προστατευτική ικανότητα της ινσουλίνης μπορεί να αυξήσει την πιθανότητα υψηλότερης απορρόφησης ινσουλίνης στο στην κυκλοφορία του αίματος25. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ξήρανση με ψεκασμό με ή χωρίς μαννιτόλη και η λυοφιλοποίηση με μαννιτόλη μπορούν να διατηρήσουν την ινσουλινοπροστατευτική ικανότητα των νανοσωματιδίων μετά την αφυδάτωση.
Προστασία και συμπεριφορά απελευθέρωσης αφυδατωμένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης: (α) προστασία της ινσουλίνης σε διάλυμα πεψίνης· (β) προστασία της ινσουλίνης σε διάλυμα θρυψίνης· (γ) προστασία της ινσουλίνης από διάλυμα α-χυμοθρυψίνης· (δ) Η συμπεριφορά απελευθέρωσης αφυδατωμένων νανοσωματιδίων σε διάλυμα pH = 2,5· (ε) η συμπεριφορά απελευθέρωσης αφυδατωμένων νανοσωματιδίων σε διάλυμα pH = 6,6· (στ) η συμπεριφορά απελευθέρωσης αφυδατωμένων νανοσωματιδίων σε διάλυμα pH = 7,0.
Φρεσκοπαρασκευασμένα και ανασυσταθέντα ξηρά νανοσωματίδια ινσουλίνης επωάστηκαν σε διάφορα ρυθμιστικά διαλύματα (pH = 2,5, 6,6, 7,0) στους 37 °C, προσομοιώνοντας το pH του περιβάλλοντος του στομάχου, του δωδεκαδακτύλου και του άνω λεπτού εντέρου, για να εξεταστεί η επίδραση της ινσουλίνης στην αντίσταση στην ινσουλίνη. Συμπεριφορά απελευθέρωσης σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Τμήμα του γαστρεντερικού σωλήνα. Σε pH = 2,5, τα νανοσωματίδια με ινσουλίνη και τα επαναδιαλυτοποιημένα νανοσωματίδια ξηρής ινσουλίνης έδειξαν μια αρχική έκρηξη απελευθέρωσης εντός της πρώτης ώρας, ακολουθούμενη από αργή απελευθέρωση κατά τις επόμενες 5 ώρες (Εικ. 5δ). Αυτή η ταχεία απελευθέρωση στην αρχή είναι πιθανότατα αποτέλεσμα της ταχείας επιφανειακής εκρόφησης πρωτεϊνικών μορίων που δεν είναι πλήρως ακινητοποιημένα στην εσωτερική δομή του σωματιδίου. Σε pH = 6,5, τα νανοσωματίδια με ινσουλίνη και τα ανασυσταμένα νανοσωματίδια ξηρής ινσουλίνης έδειξαν ομαλή και αργή απελευθέρωση σε διάστημα 6 ωρών, καθώς το pH του διαλύματος δοκιμής ήταν παρόμοιο με αυτό του διαλύματος που παρασκευάστηκε με νανοσωματίδια (Εικ. 5ε). Σε pH = 7, τα νανοσωματίδια ήταν ασταθή και σχεδόν αποσυντέθηκαν πλήρως εντός των πρώτων δύο ωρών (Εικ. 5στ). Αυτό συμβαίνει επειδή η αποπρωτονίωση της χιτοζάνης συμβαίνει σε υψηλότερο pH, γεγονός που οδηγεί σε ένα λιγότερο συμπαγές δίκτυο πολυμερών και απελευθέρωση φορτωμένης ινσουλίνης.
Επιπλέον, τα νανοσωματίδια ινσουλίνης που ξηράνθηκαν με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη έδειξαν ταχύτερο προφίλ απελευθέρωσης από τα άλλα αφυδατωμένα νανοσωματίδια (Εικ. 5δ-στ). Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, τα ανασυσταμένα νανοσωματίδια ινσουλίνης που ξηράνθηκαν χωρίς μαννιτόλη έδειξαν το μικρότερο μέγεθος σωματιδίων. Τα μικρά σωματίδια παρέχουν μεγαλύτερη επιφάνεια, επομένως το μεγαλύτερο μέρος του σχετικού φαρμάκου θα βρίσκεται στην επιφάνεια του σωματιδίου ή κοντά σε αυτήν, με αποτέλεσμα την ταχεία απελευθέρωση του φαρμάκου26.
Η κυτταροτοξικότητα των νανοσωματιδίων (NPs) διερευνήθηκε με δοκιμασία MTT. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S4, όλα τα αφυδατωμένα νανοσωματίδια βρέθηκαν να μην έχουν σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων σε συγκεντρώσεις 50-500 μg/ml, γεγονός που υποδηλώνει ότι όλα τα αφυδατωμένα νανοσωματίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν με ασφάλεια για την επίτευξη του θεραπευτικού παραθύρου.
Το ήπαρ είναι το κύριο όργανο μέσω του οποίου η ινσουλίνη ασκεί τις φυσιολογικές της λειτουργίες. Τα κύτταρα HepG2 είναι μια κυτταρική σειρά ανθρώπινου ηπατώματος που χρησιμοποιείται συνήθως ως μοντέλο πρόσληψης ηπατοκυττάρων in vitro. Εδώ, τα κύτταρα HepG2 χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της κυτταρικής πρόσληψης αφυδατωμένων νανοσωματιδίων χρησιμοποιώντας μεθόδους λυοφιλοποίησης και ξήρανσης με ψεκασμό. Η κυτταρική πρόσληψη με ομοεστιακή σάρωση λέιζερ χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής και όραση μετά από αρκετές ώρες επώασης με ελεύθερη ινσουλίνη FITC σε συγκέντρωση 25 μg/mL, φρεσκοπαρασκευασμένα νανοσωματίδια φορτωμένα με ινσουλίνη FITC και αφυδατωμένα νανοσωματίδια φορτωμένα με ινσουλίνη FITC σε ίσες συγκεντρώσεις ινσουλίνης. Πραγματοποιήθηκαν ποσοτικές παρατηρήσεις μικροσκοπίας (CLSM). Τα λυοφιλοποιημένα νανοσωματίδια χωρίς μαννιτόλη καταστράφηκαν κατά την αφυδάτωση και δεν αξιολογήθηκαν σε αυτή τη δοκιμή. Οι εντάσεις ενδοκυτταρικού φθορισμού φρεσκοπαρασκευασμένων νανοσωματιδίων φορτωμένων με ινσουλίνη, λυοφιλοποιημένων νανοσωματιδίων με μαννιτόλη και ξηραμένων νανοσωματιδίων με και χωρίς μαννιτόλη (Εικ. 6α) ήταν 4,3, 2,6, 2,4 και 4,1 φορές υψηλότερα από τα ελεύθερα. Ομάδα FITC-ινσουλίνης, αντίστοιχα (Εικ. 6b). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενθυλακωμένη ινσουλίνη είναι πιο ισχυρή στην κυτταρική πρόσληψη από την ελεύθερη ινσουλίνη, κυρίως λόγω του μικρότερου μεγέθους των νανοσωματιδίων που είναι φορτωμένα με ινσουλίνη και παράγονται στη μελέτη.
Πρόσληψη από κύτταρα HepG2 μετά από επώαση 4 ωρών με φρεσκοπαρασκευασμένα νανοσωματίδια και αφυδατωμένα νανοσωματίδια: (α) Κατανομή της πρόσληψης FITC-ινσουλίνης από κύτταρα HepG2. (β) Γεωμετρικός μέσος όρος των εντάσεων φθορισμού που αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (n = 3), *P < 0,05 σε σύγκριση με την ελεύθερη ινσουλίνη.
Ομοίως, οι εικόνες CLSM έδειξαν ότι οι εντάσεις φθορισμού FITC των φρεσκοπαρασκευασμένων νανοσωματιδίων φορτωμένων με ινσουλίνη FITC και των νανοσωματιδίων ξηραμένων με ψεκασμό φορτωμένων με ινσουλίνη FITC (χωρίς μαννιτόλη) ήταν πολύ ισχυρότερες από αυτές των άλλων δειγμάτων (Εικ. 6α). Επιπλέον, με την προσθήκη μαννιτόλης, το υψηλότερο ιξώδες του διαλύματος αύξησε την αντίσταση στην κυτταρική πρόσληψη, με αποτέλεσμα τη μείωση του πολλαπλασιασμού της ινσουλίνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα νανοσωματίδια ξηραμένα με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη εμφάνισαν την υψηλότερη αποτελεσματικότητα κυτταρικής πρόσληψης επειδή το μέγεθος των σωματιδίων τους ήταν μικρότερο από αυτό των νανοσωματιδίων που ξηράνθηκαν με κατάψυξη μετά την επαναδιάλυση.
Η χιτοζάνη (μέσο μοριακό βάρος 100 KDa, 75–85% αποακετυλιωμένη) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Καναδάς). Το τριπολυφωσφορικό νάτριο (TPP) αγοράστηκε από την VWR (Radnor, Pennsylvania, ΗΠΑ). Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ινσουλίνη που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη ήταν από την Fisher Scientific (Waltham, MA, ΗΠΑ). Η ανθρώπινη ινσουλίνη με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) και το διυδροχλωρίδιο 4',6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης (DAPI) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Καναδάς). Η κυτταρική σειρά HepG2 αγοράστηκε από την ATCC (Manassas, Virginia, ΗΠΑ). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικής ή χρωματογραφικής καθαρότητας.
Παρασκευάστε ένα διάλυμα CS 1 mg/ml διαλύοντάς το σε διπλά απεσταγμένο νερό (νερό DD) που περιέχει 0,1% οξικό οξύ. Παρασκευάστε διαλύματα 1 mg/ml TPP και ινσουλίνης διαλύοντάς τα σε νερό DD και 0,1% οξικό οξύ, αντίστοιχα. Το προγαλάκτωμα παρασκευάστηκε με ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, ΗΠΑ). Η διαδικασία παρασκευής έχει ως εξής: πρώτα, 2 ml διαλύματος TPP προστίθενται σε 4 ml διαλύματος ινσουλίνης και το μείγμα αναδεύεται για 30 λεπτά και αναμειγνύεται πλήρως. Στη συνέχεια, το μεικτό διάλυμα προστέθηκε στάγδην στο διάλυμα CS μέσω σύριγγας υπό ανάδευση υψηλής ταχύτητας (10.000 rpm). Τα μείγματα διατηρήθηκαν υπό ανάδευση υψηλής ταχύτητας (15.000 rpm) σε παγόλουτρο για 30 λεπτά και ρυθμίστηκαν σε ένα ορισμένο pH για να ληφθούν διασυνδεδεμένα νανοσωματίδια ινσουλίνης. Για περαιτέρω ομογενοποίηση και μείωση του μεγέθους των νανοσωματιδίων ινσουλίνης, υποβλήθηκαν σε υπερήχους για επιπλέον 30 λεπτά. σε παγόλουτρο χρησιμοποιώντας υπερηχητικό μηχάνημα τύπου ανιχνευτή (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Γερμανία).
Τα νανοσωματίδια ινσουλίνης (NPS) ελέγχθηκαν για τη μέση διάμετρο Z, τον δείκτη πολυδιασποράς (PDI) και το δυναμικό ζήτα χρησιμοποιώντας μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) χρησιμοποιώντας ένα Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Αυστρία) αραιώνοντάς τα σε νερό DD στους 25°C. Η μορφολογία και η κατανομή μεγέθους χαρακτηρίστηκαν από ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης Hitachi H7600 (TEM) (Hitachi, Τόκιο, Ιαπωνία) και οι εικόνες στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό απεικόνισης Hitachi (Hitachi, Τόκιο, Ιαπωνία). Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα ενθυλάκωσης (EE) και η ικανότητα φόρτωσης (LC) των νανοσωματιδίων ινσουλίνης, τα νανοσωματίδια μεταφέρθηκαν με πιπέτα σε σωλήνες υπερδιήθησης με όριο μοριακού βάρους 100 kDa και φυγοκεντρήθηκαν στα 500 xg για 30 λεπτά. Η μη ενθυλακωμένη ινσουλίνη στο διήθημα ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα HPLC Agilent 1100 Series (Agilent, Santa Clara, Καλιφόρνια, ΗΠΑ) που αποτελείται από μια τεταρτοταγή αντλία, αυτόματο δειγματολήπτη, θερμαντήρα στήλης και Ανιχνευτής DAD. Η ινσουλίνη αναλύθηκε με στήλη C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) και ανιχνεύθηκε στα 214 nm. Η κινητή φάση ήταν ακετονιτρίλιο και νερό, που περιείχε 0,1% TFA, αναλογίες κλίσης από 10/90 έως 100/0, και λειτούργησε για 10 λεπτά. Η κινητή φάση αντλήθηκε με ρυθμό ροής 1,0 ml/min. Η θερμοκρασία της στήλης ρυθμίστηκε στους 20 °C. Υπολογίστε τα ποσοστά EE και LC χρησιμοποιώντας τις εξισώσεις (1) και την εξίσωση (2).
Διάφορες αναλογίες CS/ινσουλίνης, που κυμαίνονταν από 2,0 έως 4,0, δοκιμάστηκαν για τη βελτιστοποίηση των νανοσωματιδίων ινσουλίνης. Προστέθηκαν διαφορετικές ποσότητες διαλύματος CS κατά την παρασκευή, ενώ το μείγμα ινσουλίνης/TPP διατηρήθηκε σταθερό. Τα νανοσωματίδια ινσουλίνης παρασκευάστηκαν στην περιοχή pH από 4,0 έως 6,5 ελέγχοντας προσεκτικά το pH του μείγματος μετά την προσθήκη όλων των διαλυμάτων (ινσουλίνη, TPP και CS). Η EE και το μέγεθος των σωματιδίων των νανοσωματιδίων ινσουλίνης αξιολογήθηκαν σε διαφορετικές τιμές pH και αναλογίες μάζας CS/ινσουλίνης για τη βελτιστοποίηση του σχηματισμού νανοσωματιδίων ινσουλίνης.
Τα βελτιστοποιημένα νανοσωματίδια ινσουλίνης τοποθετήθηκαν στο αλουμινένιο δοχείο και καλύφθηκαν με χαρτομάντιλο σφιγμένο με ταινία. Στη συνέχεια, τα βιδωμένα δοχεία τοποθετήθηκαν σε λυοφιλιωτή συσκευή Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, ΗΠΑ) εξοπλισμένη με ξηραντήρα δίσκου. Η θερμοκρασία και η πίεση κενού ρυθμίστηκαν στους -10 °C, 0,350 Torr για τις πρώτες 2 ώρες και στους 0 °C και 0,120 Torr για τις υπόλοιπες 22 ώρες του 24ωρου για να ληφθούν ξηρά νανοσωματίδια ινσουλίνης.
Για την παραγωγή ενθυλακωμένης ινσουλίνης χρησιμοποιήθηκε ο μίνι ξηραντήρας ψεκασμού Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Ελβετία). Οι επιλεγμένες παράμετροι ξήρανσης ήταν: θερμοκρασία 100 °C, ροή τροφοδοσίας 3 L/min και ροή αερίου 4 L/min.
Τα νανοσωματίδια ινσουλίνης πριν και μετά την αφυδάτωση χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία FTIR-ATR. Τα αφυδατωμένα νανοσωματίδια καθώς και η ελεύθερη ινσουλίνη και η χιτοζάνη αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) εξοπλισμένο με ένα καθολικό εξάρτημα δειγματοληψίας ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Οι μέσοι όροι σήματος ελήφθησαν από 16 σαρώσεις με ανάλυση 4 cm2 στην περιοχή συχνοτήτων 4000-600 cm2.
Η μορφολογία των ξηρών νανοσωματιδίων ινσουλίνης αξιολογήθηκε με εικόνες SEM λυοφιλιωμένων και ξηραμένων με ψεκασμό νανοσωματιδίων ινσουλίνης που καταγράφηκαν από ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης δέσμης ιόντων Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Όρεγκον, ΗΠΑ). Η κύρια παράμετρος που χρησιμοποιήθηκε ήταν η τάση 5 keV και το ρεύμα 30 mA.
Όλα τα αφυδατωμένα νανοσωματίδια ινσουλίνης επαναδιαλύθηκαν σε νερό χωρίς προσθήκη υγρού. Το μέγεθος των σωματιδίων, η PDI, η EE και η LC ελέγχθηκαν ξανά χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο που αναφέρθηκε προηγουμένως για να αξιολογηθεί η ποιότητά τους μετά την αφυδάτωση. Η σταθερότητα των νανοσωματιδίων ανυδροινσουλίνης μετρήθηκε επίσης ελέγχοντας τις ιδιότητες των νανοσωματιδίων μετά από παρατεταμένη αποθήκευση. Σε αυτή τη μελέτη, όλα τα νανοσωματίδια μετά την αφυδάτωση αποθηκεύτηκαν στο ψυγείο για τρεις μήνες. Μετά από τρεις μήνες αποθήκευσης, τα νανοσωματίδια ελέγχθηκαν για μορφολογικό μέγεθος σωματιδίων, PDI, EE και LC.
Διαλύστε 5 mL ανασυσταμένων νανοσωματιδίων σε 45 mL που περιέχουν προσομοιωμένο γαστρικό υγρό (pH 1,2, που περιέχει 1% πεψίνη), εντερικό υγρό (pH 6,8, που περιέχει 1% θρυψίνη) ή διάλυμα χυμοθρυψίνης (100 g/mL, σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pH 7,8) για να αξιολογήσετε την αποτελεσματικότητα της ινσουλίνης στην προστασία των νανοσωματιδίων μετά την αφυδάτωση. Επωάστηκαν στους 37°C με ταχύτητα ανάδευσης 100 rpm. Συλλέχθηκαν 500 μL του διαλύματος σε διαφορετικά χρονικά σημεία και η συγκέντρωση ινσουλίνης προσδιορίστηκε με HPLC.
Η συμπεριφορά απελευθέρωσης in vitro φρεσκοπαρασκευασμένων και αφυδατωμένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης δοκιμάστηκε με τη μέθοδο σάκου διαπίδυσης (οριακή τιμή μοριακού βάρους 100 kDa, Spectra Por Inc.). Φρεσκοπαρασκευασμένα και ανασυσταθέντα ξηρά νανοσωματίδια διαπιδύθηκαν σε υγρά με pH 2,5, pH 6,6 και pH 7,0 (φυσιολογικός ορός με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 0,1 M, PBS) για την προσομοίωση του περιβάλλοντος pH του στομάχου, του δωδεκαδακτύλου και του άνω λεπτού εντέρου, αντίστοιχα. Όλα τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 °C με συνεχή ανακίνηση στις 200 rpm. Αναρροφήστε το υγρό έξω από τον σάκο διαπίδυσης των 5 mL στις ακόλουθες χρονικές στιγμές: 0,5, 1, 2, 3, 4 και 6 ώρες και αναπληρώστε αμέσως τον όγκο με φρέσκο ​​διάλυμα διαπίδυσης. Η μόλυνση ινσουλίνης στο υγρό αναλύθηκε με HPLC και ο ρυθμός απελευθέρωσης ινσουλίνης από τα νανοσωματίδια υπολογίστηκε από την αναλογία της ελεύθερης ινσουλίνης που απελευθερώθηκε προς τη συνολική ινσουλίνη που ενθυλακώθηκε στα νανοσωματίδια (Εξίσωση 3).
Κύτταρα HepG2 ανθρώπινης κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος αναπτύχθηκαν σε τρυβλία διαμέτρου 60 mm χρησιμοποιώντας Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) που περιείχε 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδών, 100 IU/mL πενικιλίνη και 100 μg/mL στρεπτομυκίνη29. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37°C, 95% σχετική υγρασία και 5% CO2. Για τις δοκιμασίες πρόσληψης, τα κύτταρα HepG2 εμβολιάστηκαν με συγκέντρωση 1 × 105 κύτταρα/ml σε ένα σύστημα θαλάμου Nunc Lab-Tek 8 φρεατίων (Thermo Fisher, NY, USA). Για τις δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας, εμβολιάστηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων (Corning, NY, USA) με πυκνότητα 5 × 104 κύτταρα/ml.
Η δοκιμασία MTT χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας των φρεσκοπαρασκευασμένων και αφυδατωμένων νανοσωματιδίων ινσουλίνης30. Τα κύτταρα HepG2 τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5 × 104 κύτταρα/mL και καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες πριν από τη δοκιμή. Τα νανοσωματίδια ινσουλίνης αραιώθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις (50 έως 500 μg/mL) σε μέσο καλλιέργειας και στη συνέχεια χορηγήθηκαν στα κύτταρα. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με PBS και επωάστηκαν με μέσο που περιείχε 0,5 mg/ml MTT για επιπλέον 4 ώρες. Η κυτταροτοξικότητα αξιολογήθηκε μετρώντας την ενζυμική αναγωγή του κίτρινου τετραζολίου MTT σε μωβ φορμαζάνη στα 570 nm χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης πλακών φασματοφωτόμετρου Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Ελβετία).
Η αποτελεσματικότητα της κυτταρικής πρόσληψης των νανοσωματιδίων (NPs) ελέγχθηκε με μικροσκοπία σάρωσης ομοεστιακού λέιζερ και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Κάθε φρεάτιο του συστήματος αντικειμενοφόρων θαλάμων Nunc Lab-Tek υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ελεύθερη ινσουλίνη FITC, νανοσωματίδια φορτωμένα με ινσουλίνη FITC και ανασυστάθηκαν 25 μg/mL αφυδατωμένων νανοσωματιδίων FITC-ινσουλίνης στην ίδια συγκέντρωση και επωάστηκαν για 4 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με 4',6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI). Ο εντοπισμός της ινσουλίνης παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ/δύο φωτονίων Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Τόκιο, Ιαπωνία). Για την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, προστέθηκαν οι ίδιες συγκεντρώσεις 10 μg/mL ελεύθερης ινσουλίνης FITC, νανοσωματιδίων φορτωμένων με ινσουλίνη FITC και επαναδιαλυμένων αφυδατωμένων νανοσωματιδίων FITC-ινσουλίνης. Πλάκες 96 φρεατίων εμβολιάστηκαν με κύτταρα HepG2 και επωάστηκαν για 4 ώρες. Μετά από 4 ώρες επώασης, τα κύτταρα αφαιρέθηκαν και πλύθηκαν 3 φορές με FBS. 5 × 104 κύτταρα ανά δείγμα αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Ηνωμένες Πολιτείες).
Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Οι συγκρίσεις μεταξύ όλων των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA ή t-test από το IBM SPSS Statistics 26 για Mac (IBM, Endicott, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) και το p < 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντικό.
Αυτή η μελέτη καταδεικνύει την ευελιξία και την ικανότητα της ξήρανσης με ψεκασμό να αφυδατώνει διασυνδεδεμένα νανοσωματίδια χιτοζάνης/TPP/ινσουλίνης με καλύτερη ανασύσταση σε σύγκριση με τις τυπικές μεθόδους λυοφιλοποίησης χρησιμοποιώντας παράγοντες διογκώσεως ή κρυοπροστατευτικά, χωρητικότητα και υψηλότερη χωρητικότητα φορτίου. Τα βελτιστοποιημένα νανοσωματίδια ινσουλίνης απέδωσαν μέσο μέγεθος σωματιδίων 318 nm και απόδοση ενθυλάκωσης 99,4%. Τα αποτελέσματα SEM και FTIR μετά την αφυδάτωση έδειξαν ότι η σφαιρική δομή διατηρήθηκε μόνο σε νανοσωματίδια που ξηράνθηκαν με ψεκασμό με και χωρίς μαννιτόλη και λυοφιλοποιήθηκαν με μαννιτόλη, αλλά τα λυοφιλοποιημένα νανοσωματίδια χωρίς μαννιτόλη αποσυντέθηκαν κατά την αφυδάτωση. Στη δοκιμή ικανότητας ανασύστασης, τα νανοσωματίδια ινσουλίνης που ξηράνθηκαν με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη έδειξαν το μικρότερο μέσο μέγεθος σωματιδίων και το υψηλότερο φορτίο κατά την ανασύσταση. Οι συμπεριφορές απελευθέρωσης όλων αυτών των αφυδατωμένων νανοσωματιδίων έδειξαν ότι απελευθερώθηκαν ταχέως σε διαλύματα pH = 2,5 και pH = 7, και πολύ σταθερά σε διάλυμα pH = 6,5. Σε σύγκριση με άλλα επαναδιαλυμένα αφυδατωμένα νανοσωματίδια, το Τα νανοσωματίδια ινσουλίνης που ξηράνθηκαν με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη παρουσίασαν την ταχύτερη απελευθέρωση. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με αυτό που παρατηρήθηκε στη δοκιμασία κυτταρικής πρόσληψης, καθώς τα νανοσωματίδια που ξηράνθηκαν με ψεκασμό απουσία μαννιτόλης διατήρησαν σχεδόν πλήρως την αποτελεσματικότητα κυτταρικής πρόσληψης των φρεσκοπαρασκευασμένων νανοσωματιδίων. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα ξηρά νανοσωματίδια ινσουλίνης που παρασκευάζονται με ξήρανση με ψεκασμό χωρίς μαννιτόλη είναι τα πιο κατάλληλα για περαιτέρω επεξεργασία σε άλλες άνυδρες δοσολογικές μορφές, όπως δισκία για χορήγηση από το στόμα ή βιοσυγκολλητικές μεμβράνες.
Λόγω ζητημάτων πνευματικής ιδιοκτησίας, τα σύνολα δεδομένων που δημιουργήθηκαν ή/και αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια της παρούσας μελέτης δεν είναι δημόσια διαθέσιμα, αλλά είναι διαθέσιμα από τους αντίστοιχους συγγραφείς κατόπιν εύλογου αιτήματος.
Kagan, A. Διαβήτης τύπου 2: κοινωνική και επιστημονική προέλευση, ιατρικές επιπλοκές και επιπτώσεις για τους ασθενείς και άλλους. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Η ανάπτυξη της ενθυλάκωσης ινσουλίνης: είναι πλέον δυνατή η χορήγηση από το στόμα; J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Πρόσφατες εξελίξεις στα συστήματα χορήγησης λιποσωμάτων φορτωμένων με ινσουλίνη για τη θεραπεία του διαβήτη. Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).