Το άρθρο αποτελεί μέρος του ερευνητικού θέματος «Βελτίωση της αντοχής των ψυχανθών σε παθογόνα και παράσιτα», δείτε και τα 5 άρθρα
Ο αιτιολογικός παράγοντας της νέκρωσης της μυκητιασικής ασθένειας των φυτών Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary χρησιμοποιεί μια πολυεπίπεδη στρατηγική για να μολύνει διαφορετικά φυτά ξενιστές. Αυτή η μελέτη προτείνει τη χρήση της διαμίνης L-ορνιθίνης, ενός μη πρωτεϊνικού αμινοξέος που διεγείρει τη σύνθεση άλλων απαραίτητων αμινοξέων, ως εναλλακτική στρατηγική διαχείρισης για την ενίσχυση των μοριακών, φυσιολογικών και βιοχημικών αποκρίσεων του Phaseolus vulgaris L. στη λευκή μούχλα που προκαλείται από το Pseudomonas sclerotiorum. Πειράματα in vitro έδειξαν ότι η L-ορνιθίνη ανέστειλε σημαντικά την μυκηλιακή ανάπτυξη του S. pyrenoidosa με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά τη σοβαρότητα της λευκής μούχλας σε συνθήκες θερμοκηπίου. Επιπλέον, η L-ορνιθίνη διεγείρει την ανάπτυξη των φυτών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία, υποδεικνύοντας ότι οι δοκιμασμένες συγκεντρώσεις L-ορνιθίνης δεν ήταν φυτοτοξικές για τα φυτά που υποβλήθηκαν σε θεραπεία. Επιπλέον, η L-ορνιθίνη ενίσχυσε την έκφραση μη ενζυματικών αντιοξειδωτικών (ολικά διαλυτά φαινολικά και φλαβονοειδή) και ενζυματικών αντιοξειδωτικών (καταλάση (CAT), υπεροξειδάση (POX) και πολυφαινολοξειδάση (PPO)), και αύξησε την έκφραση τριών γονιδίων που σχετίζονται με αντιοξειδωτικά (PvCAT1, PvSOD και PvGR). Επιπλέον, η ανάλυση in silico αποκάλυψε την παρουσία μιας πιθανής πρωτεΐνης οξαλοξεικής ακετυλοϋδρολάσης (SsOAH) στο γονιδίωμα του S. sclerotiorum, η οποία ήταν πολύ παρόμοια με τις πρωτεΐνες οξαλοξεικής ακετυλοϋδρολάσης (SsOAH) των Aspergillus fijiensis (AfOAH) και Penicillium sp. (PlOAH) όσον αφορά τη λειτουργική ανάλυση, τους διατηρημένους τομείς και την τοπολογία. Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη L-ορνιθίνης σε μέσο ζωμού δεξτρόζης πατάτας (PDB) μείωσε σημαντικά την έκφραση του γονιδίου SsOAH στα μυκήλια του S. sclerotiorum. Ομοίως, η εξωγενής εφαρμογή L-ορνιθίνης μείωσε σημαντικά την έκφραση του γονιδίου SsOAH σε μυκητιακά μυκήλια που συλλέχθηκαν από φυτά που υποβλήθηκαν σε θεραπεία. Τέλος, η εφαρμογή L-ορνιθίνης μείωσε σημαντικά την έκκριση οξαλικού οξέος τόσο στο μέσο PDB όσο και στα μολυσμένα φύλλα. Συμπερασματικά, η L-ορνιθίνη παίζει βασικό ρόλο στη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης καθώς και στην ενίσχυση της αμυντικής απόκρισης των μολυσμένων φυτών. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης μπορούν να βοηθήσουν στην ανάπτυξη καινοτόμων, φιλικών προς το περιβάλλον μεθόδων για τον έλεγχο της λευκής μούχλας και τον μετριασμό των επιπτώσεών της στην παραγωγή φασολιών και άλλων καλλιεργειών.
Η λευκή μούχλα, που προκαλείται από τον νεκροτροφικό μύκητα Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, είναι μια καταστροφική ασθένεια που μειώνει την απόδοση και αποτελεί σοβαρή απειλή για την παγκόσμια παραγωγή φασολιών (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Η Sclerotinia sclerotiorum είναι ένα από τα πιο δύσκολα στον έλεγχο μυκητιακά παθογόνα των φυτών που μεταδίδονται στο έδαφος, με ένα ευρύ φάσμα ξενιστών με πάνω από 600 είδη φυτών και την ικανότητα να διαβρέχει γρήγορα τους ιστούς του ξενιστή με μη ειδικό τρόπο (Liang and Rollins, 2018). Υπό δυσμενείς συνθήκες, περνάει από μια κρίσιμη φάση του κύκλου ζωής της, παραμένοντας αδρανής για μεγάλα χρονικά διαστήματα ως μαύρες, σκληρές, σπόρια-σαν δομές που ονομάζονται «σκληρώτια» στο έδαφος ή ως λευκές, αφράτες αναπτύξεις στο μυκήλιο ή στην εντερική βλάστηση των μολυσμένων φυτών (Schwartz et al., 2005). Το S. sclerotiorum είναι ικανό να σχηματίζει σκληρώτια, τα οποία του επιτρέπουν να επιβιώνει σε μολυσμένα χωράφια για μεγάλα χρονικά διαστήματα και να επιμένει κατά τη διάρκεια της ασθένειας (Schwartz et al., 2005). Τα σκληρώτια είναι πλούσια σε θρεπτικά συστατικά, μπορούν να επιβιώσουν στο έδαφος για μεγάλα χρονικά διαστήματα και να χρησιμεύουν ως το κύριο μολυσματικό υλικό για επακόλουθες μολύνσεις (Schwartz et al., 2005). Υπό ευνοϊκές συνθήκες, τα σκληρώτια βλασταίνουν και παράγουν αερομεταφερόμενα σπόρια που μπορούν να μολύνουν όλα τα υπέργεια μέρη του φυτού, συμπεριλαμβανομένων, ενδεικτικά, των λουλουδιών, των στελεχών ή των λοβών (Schwartz et al., 2005).
Το Sclerotinia sclerotiorum χρησιμοποιεί μια πολυεπίπεδη στρατηγική για να μολύνει τα φυτά ξενιστές του, η οποία περιλαμβάνει μια σειρά συντονισμένων γεγονότων από τη σκληρωτική βλάστηση έως την ανάπτυξη συμπτωμάτων. Αρχικά, το S. sclerotiorum παράγει αιωρούμενα σπόρια (που ονομάζονται ασκοσπόρια) από δομές που μοιάζουν με μανιτάρια και ονομάζονται αποθέκια, τα οποία μεταφέρονται στον αέρα και αναπτύσσονται σε μη κινητικά σκληρώτια σε μολυσμένα φυτικά υπολείμματα (Bolton et al., 2006). Στη συνέχεια, ο μύκητας εκκρίνει οξαλικό οξύ, έναν παράγοντα λοιμογόνου δράσης, για να ελέγξει το pH του κυτταρικού τοιχώματος των φυτών, να προωθήσει την ενζυμική αποικοδόμηση και την εισβολή στους ιστούς (Hegedus and Rimmer, 2005) και να καταστείλει την οξειδωτική έκρηξη του φυτού ξενιστή. Αυτή η διαδικασία οξίνισης αποδυναμώνει το κυτταρικό τοίχωμα των φυτών, παρέχοντας ένα ευνοϊκό περιβάλλον για την κανονική και αποτελεσματική λειτουργία των ενζύμων αποικοδόμησης του κυτταρικού τοιχώματος των μυκήτων (CWDEs), επιτρέποντας στο παθογόνο να ξεπεράσει το φυσικό φράγμα και να διεισδύσει στους ιστούς του ξενιστή (Marciano et al., 1983). Μόλις διεισδύσει, το S. sclerotiorum εκκρίνει έναν αριθμό CWDEs, όπως πολυγαλακτουρονάση και κυτταρινάση, τα οποία διευκολύνουν τη διασπορά του σε μολυσμένους ιστούς και προκαλούν νέκρωση ιστών. Η εξέλιξη των αλλοιώσεων και των υφικών επιφανειών οδηγεί στα χαρακτηριστικά συμπτώματα της λευκής μούχλας (Hegedus και Rimmer, 2005). Εν τω μεταξύ, τα φυτά ξενιστές αναγνωρίζουν τα μοριακά πρότυπα που σχετίζονται με παθογόνα (PAMPs) μέσω υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων (PRRs), ενεργοποιώντας μια σειρά από σηματοδοτικά συμβάντα που τελικά ενεργοποιούν αμυντικές αποκρίσεις.
Παρά τις δεκαετίες προσπαθειών ελέγχου των ασθενειών, οι ελλείψεις επαρκούς ανθεκτικού γενετικού υλικού παραμένουν στα φασόλια, όπως και σε άλλες εμπορικές καλλιέργειες, λόγω της αντοχής, της επιβίωσης και της προσαρμοστικότητας του παθογόνου. Η διαχείριση των ασθενειών είναι επομένως εξαιρετικά δύσκολη και απαιτεί μια ολοκληρωμένη, πολύπλευρη στρατηγική που περιλαμβάνει έναν συνδυασμό καλλιεργητικών πρακτικών, βιολογικού ελέγχου και χημικών μυκητοκτόνων (O'Sullivan et al., 2021). Ο χημικός έλεγχος της λευκής μούχλας είναι ο πιο αποτελεσματικός, επειδή τα μυκητοκτόνα, όταν εφαρμόζονται σωστά και την κατάλληλη στιγμή, μπορούν να ελέγξουν αποτελεσματικά την εξάπλωση της ασθένειας, να μειώσουν τη σοβαρότητα της μόλυνσης και να ελαχιστοποιήσουν τις απώλειες στην απόδοση. Ωστόσο, η υπερβολική χρήση και η υπερβολική εξάρτηση από μυκητοκτόνα μπορεί να οδηγήσει στην εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών του S. sclerotiorum και να επηρεάσει αρνητικά τους μη στοχευόμενους οργανισμούς, την υγεία του εδάφους και την ποιότητα του νερού (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Επομένως, η εύρεση φιλικών προς το περιβάλλον εναλλακτικών λύσεων έχει καταστεί ύψιστη προτεραιότητα.
Οι πολυαμίνες (PAs), όπως η πουτρεσκίνη, η σπερμιδίνη, η σπερμίνη και η καδαβερίνη, μπορούν να χρησιμεύσουν ως πολλά υποσχόμενες εναλλακτικές λύσεις έναντι των παθογόνων των φυτών που μεταδίδονται στο έδαφος, μειώνοντας έτσι πλήρως ή εν μέρει τη χρήση επικίνδυνων χημικών μυκητοκτόνων (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Στα ανώτερα φυτά, οι PAs εμπλέκονται σε πολλές φυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένων, ενδεικτικά, της κυτταρικής διαίρεσης, της διαφοροποίησης και της απόκρισης σε αβιοτικές και βιοτικές καταπονήσεις (Kiliny and Nehela, 2020). Μπορούν να δράσουν ως αντιοξειδωτικά, να βοηθήσουν στην απομάκρυνση των δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), να διατηρήσουν την ομοιόσταση της οξειδοαναγωγής (Nehela and Killiny, 2023), να προκαλέσουν γονίδια που σχετίζονται με την άμυνα (Romero et al., 2018), να ρυθμίσουν διάφορες μεταβολικές οδούς (Nehela and Killiny, 2023), να τροποποιήσουν ενδογενείς φυτοορμόνες (Nehela and Killiny, 2019), να δημιουργήσουν συστηματική επίκτητη αντοχή (SAR) και να ρυθμίσουν τις αλληλεπιδράσεις φυτοπαθογόνων (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι συγκεκριμένοι μηχανισμοί και οι ρόλοι των PA στην άμυνα των φυτών ποικίλλουν ανάλογα με το είδος του φυτού, τα παθογόνα και τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Η πιο άφθονη PA στα φυτά βιοσυντίθεται από την απαραίτητη πολυαμίνη L-ορνιθίνη (Kiliny and Nehela, 2020).
Η L-ορνιθίνη παίζει πολλαπλούς ρόλους στην ανάπτυξη και εξέλιξη των φυτών. Για παράδειγμα, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι στο ρύζι (Oryza sativa), η ορνιθίνη μπορεί να σχετίζεται με την ανακύκλωση του αζώτου (Liu et al., 2018), την απόδοση, την ποιότητα και το άρωμα του ρυζιού (Lu et al., 2020) και την απόκριση στο στρες από το νερό (Yang et al., 2000). Επιπλέον, η εξωγενής εφαρμογή L-ορνιθίνης βελτίωσε σημαντικά την ανοχή στην ξηρασία στα ζαχαρότευτλα (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) και μείωσε το στρες από το αλάτι στα φυτά κρεμμυδιού (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu και Çavuşoǧlu, 2021) και κάσιους (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Ο πιθανός ρόλος της L-ορνιθίνης στην άμυνα κατά του αβιοτικού στρες μπορεί να οφείλεται στη συμμετοχή της στη συσσώρευση προλίνης στα φυτά που έχουν υποστεί αγωγή. Για παράδειγμα, γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό της προλίνης, όπως τα γονίδια της ορνιθίνης δέλτα αμινοτρανσφεράσης (δέλτα-OAT) και της προλινικής αφυδρογονάσης (ProDH1 και ProDH2), έχουν αναφερθεί προηγουμένως ότι εμπλέκονται στην άμυνα των Nicotiana benthamiana και Arabidopsis thaliana έναντι στελεχών Pseudomonas syringae που δεν προέρχονται από τον ξενιστή (Senthil-Kumar και Mysore, 2012). Από την άλλη πλευρά, η μυκητιακή ορνιθίνη δεκαρβοξυλάση (ODC) είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη παθογόνων (Singh et al., 2020). Η στόχευση της ODC του Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici μέσω της γονιδιακής σίγασης που προκαλείται από τον ξενιστή (HIGS) ενίσχυσε σημαντικά την αντοχή των φυτών τομάτας στο Fusarium wilt (Singh et al., 2020). Ωστόσο, ο πιθανός ρόλος της εξωγενούς εφαρμογής ορνιθίνης έναντι βιοτικών στρες όπως τα φυτοπαθογόνα δεν έχει μελετηθεί επαρκώς. Το πιο σημαντικό είναι ότι οι επιδράσεις της ορνιθίνης στην αντοχή στις ασθένειες και τα σχετικά βιοχημικά και φυσιολογικά φαινόμενα παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητες.
Η κατανόηση της πολυπλοκότητας της μόλυνσης των ψυχανθών από S. sclerotiorum είναι σημαντική για την ανάπτυξη αποτελεσματικών στρατηγικών ελέγχου. Σε αυτή τη μελέτη, στόχος μας ήταν να εντοπίσουμε τον πιθανό ρόλο της διαμίνης L-ορνιθίνης ως βασικού παράγοντα στην ενίσχυση των αμυντικών μηχανισμών και της αντοχής των ψυχανθών στη μόλυνση από Sclerotinia sclerotiorum. Υποθέτουμε ότι, εκτός από την ενίσχυση των αμυντικών αποκρίσεων των μολυσμένων φυτών, η L-ορνιθίνη παίζει επίσης βασικό ρόλο στη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης. Προτείνουμε ότι οι πιθανές επιδράσεις της L-ορνιθίνης σχετίζονται με τη ρύθμιση των ενζυματικών και μη ενζυματικών αντιοξειδωτικών αμυντικών μηχανισμών και την παρεμβολή στους παράγοντες παθογένειας/λοιμογονικότητας των μυκήτων και στις σχετικές πρωτεΐνες. Αυτή η διπλή λειτουργικότητα της L-ορνιθίνης την καθιστά έναν πολλά υποσχόμενο υποψήφιο για μια βιώσιμη στρατηγική για τον μετριασμό των επιπτώσεων της λευκής μούχλας και την ενίσχυση της αντοχής των κοινών καλλιεργειών ψυχανθών σε αυτό το ισχυρό μυκητιακό παθογόνο. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης μπορούν να βοηθήσουν στην ανάπτυξη καινοτόμων, φιλικών προς το περιβάλλον μεθόδων για τον έλεγχο της λευκής μούχλας και τον μετριασμό των επιπτώσεών της στην παραγωγή ψυχανθών.
Σε αυτή τη μελέτη, ως πειραματικό υλικό χρησιμοποιήθηκε μια ευαίσθητη εμπορική ποικιλία κοινού φασολιού, η Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Υγιείς σπόροι παρασχέθηκαν ευγενικά από το Τμήμα Έρευνας Ψυχανθών του Ινστιτούτου Έρευνας Καλλιεργειών (FCRI), Κέντρο Γεωργικής Έρευνας (ARC), Αίγυπτος. Πέντε σπόροι σπάρθηκαν σε πλαστικές γλάστρες (εσωτερική διάμετρος 35 cm, βάθος 50 cm) γεμάτες με έδαφος μολυσμένο με S. sclerotiorum σε συνθήκες θερμοκηπίου (25 ± 2 °C, σχετική υγρασία 75 ± 1%, 8 ώρες φωτός/16 ώρες σκότους). 7-10 ημέρες μετά τη σπορά (DPS), τα σπορόφυτα αραιώθηκαν για να μείνουν μόνο δύο σπορόφυτα με ομοιόμορφη ανάπτυξη και τρία πλήρως αναπτυγμένα φύλλα σε κάθε γλάστρα. Όλα τα φυτά σε γλάστρα ποτίζονταν μία φορά κάθε δύο εβδομάδες και λιπάνθηκαν μηνιαίως με τη συνιστώμενη δόση για τη δεδομένη ποικιλία.
Για την παρασκευή συγκέντρωσης 500 mg/L L-ορνιθινδιαμίνης (επίσης γνωστής ως (+)-(S)-2,5-διαμινοπεντανοϊκό οξύ· Sigma-Aldrich, Darmstadt, Γερμανία), 50 mg διαλύθηκαν αρχικά σε 100 mL αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού. Το αρχικό διάλυμα στη συνέχεια αραιώθηκε και χρησιμοποιήθηκε σε επόμενα πειράματα. Εν συντομία, έξι σειρές συγκεντρώσεων L-ορνιθίνης (12,5, 25, 50, 75, 100 και 125 mg/L) δοκιμάστηκαν in vitro. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό ως αρνητικός έλεγχος (Mock) και χρησιμοποιήθηκε εμπορικό μυκητοκτόνο "Rizolex-T" 50% διαβρέξιμη σκόνη (toclofos-methyl 20% + thiram 30%· KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Κυβερνείο Gharbia, Αίγυπτος) ως θετικός έλεγχος. Το εμπορικό μυκητοκτόνο «Rizolex-T» δοκιμάστηκε in vitro σε πέντε συγκεντρώσεις (2, 4, 6, 8 και 10 mg/L).
Δείγματα από κοινά στελέχη και λοβούς κοινών φασολιών που εμφάνιζαν τυπικά συμπτώματα λευκής μούχλας (ποσοστό προσβολής: 10–30%) συλλέχθηκαν από εμπορικές φάρμες. Αν και τα περισσότερα από τα μολυσμένα φυτικά υλικά ταυτοποιήθηκαν ανά είδος/ποικιλία (ευαίσθητη εμπορική ποικιλία Giza 3), άλλα, ειδικά αυτά που ελήφθησαν από τοπικές αγορές, ήταν άγνωστου είδους. Τα συλλεγμένα μολυσμένα υλικά απολυμάνθηκαν πρώτα επιφανειακά με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5% για 3 λεπτά, στη συνέχεια ξεπλύθηκαν αρκετές φορές με αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό και σκουπίστηκαν με αποστειρωμένο διηθητικό χαρτί για την απομάκρυνση της περίσσειας νερού. Τα μολυσμένα όργανα κόπηκαν στη συνέχεια σε μικρά κομμάτια από τον μεσαίο ιστό (μεταξύ υγιών και μολυσμένων ιστών), καλλιεργήθηκαν σε μέσο άγαρ δεξτρόζης πατάτας (PDA) και επωάστηκαν στους 25 ± 2 °C με κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών για 5 ημέρες για την τόνωση του σχηματισμού σκληρωτίων. Η μέθοδος της μυκηλιακής άκρης χρησιμοποιήθηκε επίσης για τον καθαρισμό των απομονωμένων μυκήτων από μικτές ή μολυσμένες καλλιέργειες. Το καθαρισμένο απομονωμένο μύκητα ταυτοποιήθηκε πρώτα με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά της καλλιέργειας και στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε ότι είναι S. sclerotiorum με βάση μικροσκοπικά χαρακτηριστικά. Τέλος, όλα τα καθαρισμένα απομονωμένα στελέχη ελέγχθηκαν για παθογένεια στην ευαίσθητη ποικιλία κοινής φασολιάς Giza 3, ώστε να πληρούν τα αξιώματα του Koch.
Επιπλέον, το πιο επεμβατικό απομονωμένο στέλεχος S. sclerotiorum (απομόνωση #3) επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με βάση την αλληλούχιση εσωτερικού μεταγραφόμενου διαχωριστή (ITS) όπως περιγράφεται από τους White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Εν συντομία, τα απομονωμένα στελέχη καλλιεργήθηκαν σε ζωμό δεξτρόζης πατάτας (PDB) και επωάστηκαν στους 25 ± 2 °C για 5-7 ημέρες. Στη συνέχεια, συλλέχθηκε το μυκητιασικό μυκήλιο, διηθήθηκε μέσω τουλπάνι, πλύθηκε δύο φορές με αποστειρωμένο νερό και ξηράνθηκε με αποστειρωμένο διηθητικό χαρτί. Το γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Η περιοχή rDNA του ITS στη συνέχεια ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το ειδικό ζεύγος εκκινητών ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC· αναμενόμενο μέγεθος: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Τα καθαρισμένα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν για αλληλούχιση (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Οι αλληλουχίες rDNA του ITS αλληλουχήθηκαν αμφίδρομα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αλληλούχισης Sanger. Οι συναρμολογημένες αλληλουχίες ερωτήματος συγκρίθηκαν στη συνέχεια με τα πιο πρόσφατα δεδομένα στην GenBank και στο Εθνικό Κέντρο Βιοτεχνολογικών Πληροφοριών (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) χρησιμοποιώντας το λογισμικό BLASTn. Η ακολουθία αναζήτησης συγκρίθηκε με 20 άλλα στελέχη/απομονώσεις S. sclerotiorum που ανακτήθηκαν από τα πιο πρόσφατα δεδομένα στο NCBI GenBank (Συμπληρωματικός Πίνακας S1) χρησιμοποιώντας το ClustalW στο Πακέτο Ανάλυσης Μοριακής Εξελικτικής Γενετικής (MEGA-11· έκδοση 11) (Kumar et al., 2024). Η εξελικτική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μέγιστης πιθανοφάνειας και το γενικό μοντέλο χρονικά αναστρέψιμης υποκατάστασης νουκλεοτιδίων (Nei and Kumar, 2000). Εμφανίζεται το δέντρο με την υψηλότερη λογαριθμική πιθανοφάνεια. Το αρχικό δέντρο για την ευρετική αναζήτηση επιλέγεται επιλέγοντας το δέντρο με την υψηλότερη λογαριθμική πιθανοφάνεια μεταξύ του δέντρου γειτονικής σύνδεσης (NJ) (Kumar et al., 2024) και του δέντρου μέγιστης φειδώλου (MP). Το δέντρο NJ κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας έναν πίνακα αποστάσεων ανά ζεύγη που υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το γενικό χρονικά αναστρέψιμο μοντέλο (Nei and Kumar, 2000).
Η αντιβακτηριακή δράση της L-ορνιθίνης και του βακτηριοκτόνου «Rizolex-T» προσδιορίστηκε in vitro με τη μέθοδο διάχυσης σε άγαρ. Μέθοδος: Λαμβάνεται η κατάλληλη ποσότητα του αρχικού διαλύματος L-ορνιθίνης (500 mg/L) και αναμειγνύεται καλά με 10 ml του θρεπτικού μέσου PDA για την παρασκευή διαλυμάτων με τελικές συγκεντρώσεις 12,5, 25, 50, 75, 100 και 125 mg/L, αντίστοιχα. Πέντε συγκεντρώσεις του μυκητοκτόνου «Rizolex-T» (2, 4, 6, 8 και 10 mg/L) και αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Μετά τη στερεοποίηση του μέσου, ένα φρεσκοπαρασκευασμένο μυκηλιακό βύσμα καλλιέργειας Sclerotinia sclerotiorum, διαμέτρου 4 mm, μεταφέρθηκε στο κέντρο του τρυβλίου Petri και καλλιεργήθηκε στους 25±2°C μέχρι το μυκήλιο να καλύψει ολόκληρο το τρυβλίο Petri ελέγχου, μετά την οποία καταγράφηκε η μυκητιακή ανάπτυξη. Υπολογίζεται το ποσοστό αναστολής της ακτινικής ανάπτυξης του S. sclerotiorum χρησιμοποιώντας την εξίσωση 1:
Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές, με έξι βιολογικά αντίγραφα για κάθε ομάδα ελέγχου/πειραματισμού και πέντε γλάστρες (δύο φυτά ανά γλάστρα) για κάθε βιολογικό αντίγραφο. Κάθε βιολογικό αντίγραφο αναλύθηκε δύο φορές (δύο τεχνικές επαναλήψεις) για να διασφαλιστεί η ακρίβεια, η αξιοπιστία και η αναπαραγωγιμότητα των πειραματικών αποτελεσμάτων. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε ανάλυση παλινδρόμησης probit για τον υπολογισμό της ημιμέγιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (IC50) και της IC99 (Prentice, 1976).
Για την αξιολόγηση του δυναμικού της L-ορνιθίνης σε συνθήκες θερμοκηπίου, διεξήχθησαν δύο διαδοχικά πειράματα σε γλάστρες. Εν συντομία, οι γλάστρες γεμίστηκαν με αποστειρωμένο αργιλώδες-αμμώδες χώμα (3:1) και εμβολιάστηκαν με μια πρόσφατα παρασκευασμένη καλλιέργεια S. sclerotiorum. Αρχικά, το πιο διεισδυτικό απομονωμένο στέλεχος του S. sclerotiorum (απομόνωση #3) καλλιεργήθηκε κόβοντας ένα σκληρώτιο στη μέση, τοποθετώντας το με την όψη προς τα κάτω σε ένα PDA και επωάζοντάς το στους 25°C σε συνεχές σκοτάδι (24 ώρες) για 4 ημέρες για να διεγείρει την ανάπτυξη μυκηλίου. Στη συνέχεια, ελήφθησαν τέσσερα βύσματα άγαρ διαμέτρου 5 mm από την μπροστινή άκρη και εμβολιάστηκαν με 100 g αποστειρωμένου μείγματος πίτουρου σιταριού και ρυζιού (1:1, v/v) και όλες οι φιάλες επωάστηκαν στους 25 ± 2 °C υπό κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών για 5 ημέρες για να διεγείρουν τον σχηματισμό σκληρωτίων. Το περιεχόμενο όλων των φιαλών αναμίχθηκε καλά για να διασφαλιστεί η ομοιογένεια πριν από την προσθήκη χώματος. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 100 g του μείγματος αποικισμού πίτουρου σε κάθε γλάστρα για να διασφαλιστεί μια σταθερή συγκέντρωση παθογόνων. Οι εμβολιασμένες γλάστρες ποτίστηκαν για να ενεργοποιηθεί η ανάπτυξη μυκήτων και τοποθετήθηκαν σε συνθήκες θερμοκηπίου για 7 ημέρες.
Στη συνέχεια, σε κάθε γλάστρα σπάρθηκαν πέντε σπόροι της ποικιλίας Giza 3. Για τις γλάστρες που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με L-ορνιθίνη και το μυκητοκτόνο Rizolex-T, οι αποστειρωμένοι σπόροι εμποτίστηκαν πρώτα για δύο ώρες σε υδατικό διάλυμα των δύο ενώσεων με τελική συγκέντρωση IC99 περίπου 250 mg/L και 50 mg/L, αντίστοιχα, και στη συνέχεια ξηράνθηκαν στον αέρα για μία ώρα πριν από τη σπορά. Από την άλλη πλευρά, οι σπόροι εμποτίστηκαν σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό ως αρνητικός έλεγχος. Μετά από 10 ημέρες, πριν από το πρώτο πότισμα, τα σπορόφυτα αραιώθηκαν, αφήνοντας μόνο δύο καθαρά σπορόφυτα σε κάθε γλάστρα. Επιπλέον, για να διασφαλιστεί η μόλυνση με S. sclerotiorum, στελέχη φυτών φασολιών στο ίδιο στάδιο ανάπτυξης (10 ημέρες) κόπηκαν σε δύο διαφορετικές θέσεις χρησιμοποιώντας αποστειρωμένο νυστέρι και περίπου 0,5 g του μείγματος αποικισμού πίτουρου τοποθετήθηκαν σε κάθε πληγή, ακολουθούμενη από υψηλή υγρασία για την τόνωση της μόλυνσης και της ανάπτυξης ασθενειών σε όλα τα εμβολιασμένα φυτά. Τα φυτά ελέγχου τραυματίστηκαν με παρόμοιο τρόπο και ίση ποσότητα (0,5 g) αποστειρωμένου, μη αποικισμένου μείγματος πίτουρου τοποθετήθηκε στο τραύμα και διατηρήθηκε υπό υψηλή υγρασία για να προσομοιωθεί το περιβάλλον για την ανάπτυξη της νόσου και να διασφαλιστεί η συνέπεια μεταξύ των ομάδων θεραπείας.
Μέθοδος επεξεργασίας: Τα σπορόφυτα φασολιών ποτίστηκαν με 500 ml υδατικού διαλύματος L-ορνιθίνης (250 mg/l) ή του μυκητοκτόνου Rizolex-T (50 mg/l) με άρδευση του εδάφους και στη συνέχεια η επεξεργασία επαναλήφθηκε τρεις φορές σε διάστημα 10 ημερών. Τα δείγματα ελέγχου που έλαβαν εικονικό φάρμακο ποτίστηκαν με 500 ml αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού. Όλες οι επεξεργασίες πραγματοποιήθηκαν σε συνθήκες θερμοκηπίου (25 ± 2°C, 75 ± 1% σχετική υγρασία και φωτοπερίοδος 8 ωρών φωτός/16 ωρών σκότους). Όλες οι γλάστρες ποτίστηκαν ανά δύο εβδομάδες και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μηνιαίως με ένα ισορροπημένο λίπασμα NPK (20-20-20, με 3,6% θείο και μικροστοιχεία TE· Zain Seeds, Αίγυπτος) σε συγκέντρωση 3-4 g/l με ψεκασμό φυλλώματος σύμφωνα με τις συστάσεις για τη συγκεκριμένη ποικιλία και τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, πλήρως αναπτυγμένα ώριμα φύλλα (2ο και 3ο φύλλο από την κορυφή) συλλέχθηκαν από κάθε βιολογικό αντίγραφο 72 ώρες μετά την επεξεργασία (hpt), ομογενοποιήθηκαν, ομαδοποιήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 °C για περαιτέρω αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων, ενδεικτικά, του ιστοχημικού εντοπισμού in situ δεικτών οξειδωτικού στρες, της υπεροξείδωσης λιπιδίων, των ενζυματικών και μη ενζυματικών αντιοξειδωτικών και της γονιδιακής έκφρασης.
Η ένταση της μόλυνσης από λευκή μούχλα αξιολογήθηκε εβδομαδιαίως 21 ημέρες μετά τον εμβολιασμό (dpi) χρησιμοποιώντας μια κλίμακα 1–9 (Συμπληρωματικός Πίνακας S2) βασισμένη στην κλίμακα Petzoldt και Dickson (1996) που τροποποιήθηκε από τους Teran et al. (2006). Εν συντομία, οι μίσχοι και τα κλαδιά των φυτών φασολιών εξετάστηκαν ξεκινώντας από το σημείο του εμβολιασμού για να παρακολουθηθεί η εξέλιξη των αλλοιώσεων κατά μήκος των μεσογονατίων και των κόμβων. Στη συνέχεια, μετρήθηκε η απόσταση της βλάβης από το σημείο εμβολιασμού έως το πιο απομακρυσμένο σημείο κατά μήκος του στελέχους ή του κλαδιού και δόθηκε μια βαθμολογία 1–9 με βάση τη θέση της βλάβης, όπου (1) δεν υποδείκνυε ορατή μόλυνση κοντά στο σημείο εμβολιασμού και (2–9) υποδείκνυε σταδιακή αύξηση του μεγέθους της βλάβης και εξέλιξη κατά μήκος των κόμβων/μεσογονατίων (Συμπληρωματικός Πίνακας S2). Η ένταση της μόλυνσης από λευκή μούχλα στη συνέχεια μετατράπηκε σε ποσοστό χρησιμοποιώντας τον τύπο 2:
Επιπλέον, η περιοχή κάτω από την καμπύλη εξέλιξης της νόσου (AUDPC) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο (Shaner and Finney, 1977), ο οποίος προσαρμόστηκε πρόσφατα για τη λευκή σήψη του κοινού φασολιού (Chauhan et al., 2020) χρησιμοποιώντας την εξίσωση 3:
Όπου Yi = σοβαρότητα της νόσου τη χρονική στιγμή ti, Yi+1 = σοβαρότητα της νόσου την επόμενη χρονική στιγμή ti+1, ti = χρόνος της πρώτης μέτρησης (σε ημέρες), ti+1 = χρόνος της επόμενης μέτρησης (σε ημέρες), n = συνολικός αριθμός χρονικών σημείων ή σημείων παρατήρησης. Οι παράμετροι ανάπτυξης των φυτών φασολιών, συμπεριλαμβανομένου του ύψους του φυτού (cm), του αριθμού των κλαδιών ανά φυτό και του αριθμού των φύλλων ανά φυτό, καταγράφηκαν εβδομαδιαίως για 21 ημέρες σε όλα τα βιολογικά αντίγραφα.
Σε κάθε βιολογική επανάληψη, δείγματα φύλλων (δεύτερο και τρίτο πλήρως ανεπτυγμένο φύλλο από την κορυφή) συλλέχθηκαν την 45η ημέρα μετά την επεξεργασία (15 ημέρες μετά την τελευταία επεξεργασία). Κάθε βιολογική επανάληψη αποτελούνταν από πέντε γλάστρες (δύο φυτά ανά γλάστρα). Περίπου 500 mg του θρυμματισμένου ιστού χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή φωτοσυνθετικών χρωστικών (χλωροφύλλη α, χλωροφύλλη β και καροτενοειδή) χρησιμοποιώντας 80% ακετόνη στους 4 °C στο σκοτάδι. Μετά από 24 ώρες, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο συλλέχθηκε για τον χρωματομετρικό προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε χλωροφύλλη α, χλωροφύλλη β και καροτενοειδή χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-160A (Shimadzu Corporation, Ιαπωνία) σύμφωνα με τη μέθοδο του (Lichtenthaler, 1987) μετρώντας την απορρόφηση σε τρία διαφορετικά μήκη κύματος (A470, A646 και A663 nm). Τέλος, η περιεκτικότητα σε φωτοσυνθετικές χρωστικές υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους τύπους 4-6 που περιγράφονται από τον Lichtenthaler (1987).
72 ώρες μετά την επεξεργασία (hpt), τα φύλλα (δεύτερο και τρίτο πλήρως ανεπτυγμένο φύλλο από την κορυφή) συλλέχθηκαν από κάθε βιολογικό αντίγραφο για ιστοχημικό εντοπισμό in situ υπεροξειδίου του υδρογόνου (H2O2) και ανιόντος υπεροξειδίου (O2•−). Κάθε βιολογικό αντίγραφο αποτελούνταν από πέντε γλάστρες (δύο φυτά ανά γλάστρα). Κάθε βιολογικό αντίγραφο αναλύθηκε εις διπλούν (δύο τεχνικές επαναλήψεις) για να διασφαλιστεί η ακρίβεια, η αξιοπιστία και η αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου. Τα H2O2 και O2•− προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας 0,1% 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB· Sigma-Aldrich, Darmstadt, Γερμανία) ή νιτρομπλε τετραζόλιο (NBT· Sigma-Aldrich, Darmstadt, Γερμανία), αντίστοιχα, ακολουθώντας τις μεθόδους που περιγράφονται από τους Romero-Puertas et al. (2004) και Adam et al. (1989) με μικρές τροποποιήσεις. Για τον ιστοχημικό εντοπισμό του H2O2 in situ, τα φυλλάδια διηθήθηκαν υπό κενό με 0,1% DAB σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris 10 mM (pH 7,8) και στη συνέχεια επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου στο φως για 60 λεπτά. Τα φυλλάδια λευκάνθηκαν σε διάλυμα TCA 0,15% (v/v) σε αιθανόλη:χλωροφόρμιο 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Κάιρο, Αίγυπτος) και στη συνέχεια εκτέθηκαν στο φως μέχρι να σκουρύνουν. Ομοίως, οι βαλβίδες διηθήθηκαν υπό κενό με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού καλίου 10 mM (pH 7,8) που περιείχε 0,1 w/v % HBT για ιστοχημικό εντοπισμό του O2•− in situ. Τα φυλλάδια επωάστηκαν στο φως σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά, στη συνέχεια λευκάνθηκαν όπως παραπάνω και στη συνέχεια φωτίστηκαν μέχρι να εμφανιστούν σκούρες μπλε/ιώδεις κηλίδες. Η ένταση του προκύπτοντος καφέ (ως δείκτης H2O2) ή μπλε-ιώδους (ως δείκτης O2•−) χρώματος αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την έκδοση Fiji του πακέτου επεξεργασίας εικόνας ImageJ (http://fiji.sc· πρόσβαση στις 7 Μαρτίου 2024).
Η μαλονδιαλδεΰδη (MDA· ως δείκτης υπεροξείδωσης λιπιδίων) προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Du και Bramlage (1992) με μικρές τροποποιήσεις. Φύλλα από κάθε βιολογικό αντίγραφο (δεύτερο και τρίτο πλήρως ανεπτυγμένο φύλλο από την κορυφή) συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επεξεργασία (hpt). Κάθε βιολογικό αντίγραφο περιελάμβανε πέντε γλάστρες (δύο φυτά ανά γλάστρα). Κάθε βιολογικό αντίγραφο αναλύθηκε εις διπλούν (δύο τεχνικές επαναλήψεις) για να διασφαλιστεί η ακρίβεια, η αξιοπιστία και η αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου. Εν συντομία, 0,5 g αλεσμένου ιστού φύλλων χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση MDA με 20% τριχλωροοξικό οξύ (TCA· MilliporeSigma, Burlington, MA, ΗΠΑ) που περιείχε 0,01% βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (BHT· Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ). Η περιεκτικότητα σε MDA στο υπερκείμενο υγρό προσδιορίστηκε στη συνέχεια χρωματομετρικά μετρώντας την απορρόφηση στα 532 και 600 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-160A (Shimadzu Corporation, Ιαπωνία) και στη συνέχεια εκφράστηκε ως nmol g−1 FW.
Για την αξιολόγηση των μη ενζυματικών και ενζυματικών αντιοξειδωτικών, συλλέχθηκαν φύλλα (δεύτερο και τρίτο πλήρως ανεπτυγμένο φύλλο από την κορυφή) από κάθε βιολογικό αντίγραφο 72 ώρες μετά την επεξεργασία (hpt). Κάθε βιολογικό αντίγραφο αποτελούνταν από πέντε γλάστρες (δύο φυτά ανά γλάστρα). Κάθε βιολογικό δείγμα αναλύθηκε εις διπλούν (δύο τεχνικά δείγματα). Δύο φύλλα αλέστηκαν με υγρό άζωτο και χρησιμοποιήθηκαν απευθείας για τον προσδιορισμό των ενζυματικών και μη ενζυματικών αντιοξειδωτικών, των συνολικών αμινοξέων, της περιεκτικότητας σε προλίνη, της γονιδιακής έκφρασης και της ποσοτικοποίησης οξαλικών.
Οι συνολικές διαλυτές φαινολικές ενώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) με μικρές τροποποιήσεις της μεθόδου που περιγράφεται από τους Kahkonen et al. (1999). Εν συντομία, περίπου 0,1 g ομογενοποιημένου ιστού φύλλων εκχυλίστηκε με 20 ml μεθανόλης 80% στο σκοτάδι για 24 ώρες και το υπερκείμενο συλλέχθηκε μετά από φυγοκέντρηση. 0,1 ml του εκχυλίσματος δείγματος αναμίχθηκε με 0,5 ml αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu (10%), ανακινήθηκε για 30 δευτερόλεπτα και αφέθηκε στο σκοτάδι για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, σε κάθε σωλήνα προστέθηκαν 0,5 ml διαλύματος ανθρακικού νατρίου 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Κάιρο, Αίγυπτος), αναμίχθηκαν καλά και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 1 ώρα. Μετά την επώαση, η απορρόφηση του μείγματος αντίδρασης μετρήθηκε στα 765 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-160A (Shimadzu Corporation, Ιαπωνία). Η συγκέντρωση των συνολικών διαλυτών φαινολών στα εκχυλίσματα δειγμάτων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια καμπύλη βαθμονόμησης γαλλικού οξέος (Fisher Scientific, Hampton, NH, ΗΠΑ) και εκφράστηκε σε χιλιοστόγραμμα ισοδύναμου γαλλικού οξέος ανά γραμμάριο νωπού βάρους (mg GAE g-1 νωπού βάρους).
Η συνολική περιεκτικότητα σε διαλυτά φλαβονοειδή προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Djeridane et al. (2006) με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, 0,3 ml του παραπάνω εκχυλίσματος μεθανόλης αναμίχθηκαν με 0,3 ml διαλύματος χλωριούχου αργιλίου 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, ΗΠΑ), αναδεύτηκαν έντονα και στη συνέχεια επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από την προσθήκη 0,3 ml διαλύματος οξικού καλίου 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Κάιρο, Αίγυπτος), αναμίχθηκαν καλά και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Μετά την επώαση, η απορρόφηση του μείγματος αντίδρασης μετρήθηκε στα 430 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-160A (Shimadzu Corporation, Ιαπωνία). Η συγκέντρωση των συνολικών διαλυτών φλαβονοειδών στα εκχυλίσματα δειγμάτων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια καμπύλη βαθμονόμησης ρουτίνης (TCI America, Portland, OR, ΗΠΑ) και στη συνέχεια εκφράστηκε σε χιλιοστόγραμμα ισοδύναμου ρουτίνης ανά γραμμάριο νωπού βάρους (mg RE g-1 νωπού βάρους).
Η συνολική περιεκτικότητα σε ελεύθερα αμινοξέα των φύλλων φασολιών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο αντιδραστήριο νινυδρίνης (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ΗΠΑ) με βάση τη μέθοδο που προτάθηκε από τους Yokoyama και Hiramatsu (2003) και τροποποιήθηκε από τους Sun et al. (2006). Εν συντομία, 0,1 g αλεσμένου ιστού εκχυλίστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα pH 5,4 και 200 ​​μL του υπερκείμενου υγρού αντέδρασαν με 200 μL νινυδρίνης (2%) και 200 ​​μL πυριδίνης (10%· Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, ΗΠΑ), επωάστηκαν σε βραστό υδατόλουτρο για 30 λεπτά, στη συνέχεια ψύχθηκαν και μετρήθηκαν στα 580 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-160A (Shimadzu Corporation, Ιαπωνία). Από την άλλη πλευρά, η προλίνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bates (Bates et al., 1973). Η προλίνη εκχυλίστηκε με 3% σουλφοσαλικυλικό οξύ (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ΗΠΑ) και μετά από φυγοκέντρηση, 0,5 ml του υπερκείμενου αναμίχθηκαν με 1 ml παγόμορφου οξικού οξέος (Fisher Scientific, Hampton, NH, ΗΠΑ) και αντιδραστήριο νινυδρίνης, επωάστηκαν στους 90°C για 45 λεπτά, ψύχθηκαν και μετρήθηκαν στα 520 nm χρησιμοποιώντας το ίδιο φασματοφωτόμετρο όπως παραπάνω. Τα συνολικά ελεύθερα αμινοξέα και η προλίνη στα εκχυλίσματα φύλλων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας καμπύλες βαθμονόμησης γλυκίνης και προλίνης (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ΗΠΑ), αντίστοιχα, και εκφράστηκαν ως mg/g φρέσκου βάρους.
Για τον προσδιορισμό της ενζυματικής δράσης των αντιοξειδωτικών ενζύμων, περίπου 500 mg ομογενοποιημένου ιστού εκχυλίστηκαν με 3 ml ρυθμιστικού διαλύματος Tris 50 mM (pH 7,8) που περιείχε 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) και 7,5% πολυβινυλοπυρρολιδόνη (PVP· Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ), φυγοκεντρήθηκαν στις 10.000 × g για 20 λεπτά υπό ψύξη (4 °C) και συλλέχθηκε το υπερκείμενο υγρό (ακατέργαστο εκχύλισμα ενζύμου) (El-Nagar et al., 2023· Osman et al., 2023). Η καταλάση (CAT) αντέδρασε στη συνέχεια με 2 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού νατρίου 0,1 M (pH 6,5· Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) και 100 μl διαλύματος H2O2 269 mM για να προσδιοριστεί η ενζυμική της δράση σύμφωνα με τη μέθοδο του Aebi (1984) με μικρές τροποποιήσεις (El-Nagar et al., 2023· Osman et al., 2023). Η ενζυμική δράση της εξαρτώμενης από γουαϊακόλη υπεροξειδάσης (POX) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των Harrach et al. (2009). (2008) με μικρές τροποποιήσεις (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) και η ενζυμική δραστικότητα της πολυφαινολοξειδάσης (PPO) προσδιορίστηκε μετά από αντίδραση με 2,2 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού νατρίου 100 mM (pH 6,0), 100 μl γουαϊακόλης (TCI chemicals, Portland, OR, ΗΠΑ) και 100 μl H2O2 12 mM. Η μέθοδος τροποποιήθηκε ελαφρώς από (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Η δοκιμασία πραγματοποιήθηκε μετά από αντίδραση με 3 ml διαλύματος κατεχόλης (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ΗΠΑ) (0,01 M) πρόσφατα παρασκευασμένου σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,1 M (pH 6,0). Η δραστικότητα CAT μετρήθηκε παρακολουθώντας την αποσύνθεση του H2O2 στα 240 nm (A240), η δραστικότητα POX μετρήθηκε παρακολουθώντας την αύξηση της απορρόφησης στα 436 nm (A436) και η δραστικότητα PPO μετρήθηκε καταγράφοντας τις διακυμάνσεις της απορρόφησης στα 495 nm (A495) κάθε 30 δευτερόλεπτα για 3 λεπτά χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-160A (Shimadzu, Ιαπωνία).
Η RT-PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των επιπέδων μεταγραφής τριών γονιδίων που σχετίζονται με αντιοξειδωτικά, συμπεριλαμβανομένης της υπεροξεισωματικής καταλάσης (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), της υπεροξειδικής δισμουτάσης (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) και της γλουταθειονικής αναγωγάσης (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), σε φύλλα φασολιών (το δεύτερο και το τρίτο πλήρως ανεπτυγμένο φύλλο από την κορυφή) 72 ώρες μετά την τελευταία επεξεργασία. Εν συντομία, το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το TOP script™ cDNA Synthesis Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες εκκινητών των παραπάνω τριών γονιδίων παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Η PvActin-3 (αριθμός πρόσβασης GenBank: XM_068616709.1) χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο housekeeping και η σχετική γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCT (Livak και Schmittgen, 2001). Η σταθερότητα της ακτίνης υπό βιοτικό στρες (ασύμβατη αλληλεπίδραση μεταξύ κοινών ψυχανθών και του μύκητα Colletotrichum lindemuthianum) και αβιοτικό στρες (ξηρασία, αλατότητα, χαμηλή θερμοκρασία) αποδείχθηκε (Borges et al., 2012).
Αρχικά πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση in silico σε ολόκληρο το γονιδίωμα των πρωτεϊνών οξαλοοξικής ακετυλοϋδρολάσης (OAH) στο S. sclerotiorum χρησιμοποιώντας το εργαλείο πρωτεΐνης-πρωτεΐνης BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Εν συντομία, χρησιμοποιήσαμε OAH από Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; ταξίδιο: 1191702; αριθμός πρόσβασης GenBank XP_040799428.1; 342 αμινοξέα) και Penicillium lagena (PlOAH; ταξίδιο: 94218; αριθμός πρόσβασης GenBank XP_056833920.1; 316 αμινοξέα) ως αλληλουχίες ερωτήματος για να χαρτογραφήσουμε την ομόλογη πρωτεΐνη στο S. sclerotiorum (ταξίδιο: 5180). Η δοκιμή BLASTp πραγματοποιήθηκε με βάση τα πιο πρόσφατα διαθέσιμα δεδομένα γονιδιώματος του S. sclerotiorum στην GenBank στον ιστότοπο του Εθνικού Κέντρου Βιοτεχνολογικών Πληροφοριών (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Επιπλέον, το προβλεπόμενο γονίδιο OAH από το S. sclerotiorum (SsOAH) και η εξελικτική ανάλυση και το φυλογενετικό δέντρο του AfOAH από το A. fijiensis CBS 313.89 και του PlOAH από το P. lagena συνήχθησαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μέγιστης πιθανοφάνειας στο MEGA11 (Tamura et al., 2021) και το μοντέλο που βασίζεται σε πίνακα JTT (Jones et al., 1992). Το φυλογενετικό δέντρο συνδυάστηκε με την ανάλυση πολλαπλής ευθυγράμμισης των πρωτεϊνικών αλληλουχιών όλων των προβλεπόμενων γονιδίων OAH (SsOAH) από το S. sclerotiorum και την αλληλουχία ερωτήματος χρησιμοποιώντας το Εργαλείο Ευθυγράμμισης Βασισμένο σε Περιορισμούς (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos και Agarwala, 2007). Επιπλέον, οι καλύτερα ταιριαστές αλληλουχίες αμινοξέων του SsOAH από το S. sclerotiorum ευθυγραμμίστηκαν με τις αλληλουχίες ερωτήματος (AfOAH και PlOAH) (Larkin et al., 2007) χρησιμοποιώντας το ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), και οι διατηρημένες περιοχές στην ευθυγράμμιση απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο ESPript (έκδοση 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Επιπλέον, οι προβλεπόμενες λειτουργικές αντιπροσωπευτικές περιοχές και οι διατηρημένες θέσεις του SsOAH του S. sclerotiorum ταξινομήθηκαν διαδραστικά σε διαφορετικές οικογένειες χρησιμοποιώντας το εργαλείο InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Τέλος, πραγματοποιήθηκε τρισδιάστατη (3D) μοντελοποίηση δομής του προβλεπόμενου SsOAH του S. sclerotiorum χρησιμοποιώντας τη Μηχανή Αναγνώρισης Ομολογίας/Αναλογίας Πρωτεϊνών (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) και επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας τον διακομιστή SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Οι προβλεπόμενες τρισδιάστατες δομές (μορφή PDB) απεικονίστηκαν διαδραστικά χρησιμοποιώντας το πακέτο UCSF-Chimera (έκδοση 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Χρησιμοποιήθηκε ποσοτική PCR φθορισμού πραγματικού χρόνου για τον προσδιορισμό του μεταγραφικού επιπέδου της οξαλοοξικής ακετυλοϋδρολάσης (SsOAH· αριθμός πρόσβασης GenBank: XM_001590428.1) στα μυκήλια του Sclerotinia sclerotiorum. Εν συντομία, το S. sclerotiorum εμβολιάστηκε σε φιάλη που περιείχε PDB και τοποθετήθηκε σε αναδευόμενο επωαστήρα (μοντέλο: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ΗΠΑ) στους 25 ± 2 °C για 24 ώρες στις 150 rpm και σε συνεχές σκοτάδι (24 ώρες) για την τόνωση της μυκηλιακής ανάπτυξης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με L-ορνιθίνη και το μυκητοκτόνο Rizolex-T σε τελικές συγκεντρώσεις IC50 (περίπου 40 και 3,2 mg/L, αντίστοιχα) και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες υπό τις ίδιες συνθήκες. Μετά την επώαση, οι καλλιέργειες φυγοκεντρήθηκαν στις 2500 rpm για 5 λεπτά και το υπερκείμενο (μυκητιασικό μυκήλιο) συλλέχθηκε για ανάλυση γονιδιακής έκφρασης. Ομοίως, μυκητιακό μυκήλιο συλλέχθηκε στις 0, 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες μετά τη μόλυνση από μολυσμένα φυτά που είχαν σχηματίσει λευκή μούχλα και βαμβακερό μυκήλιο στην επιφάνεια των μολυσμένων ιστών. Το RNA εκχυλίστηκε από το μυκητιακό μυκήλιο και στη συνέχεια συντέθηκε cDNA όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι αλληλουχίες εκκινητών για το SsOAH παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Η SsActin (αριθμός πρόσβασης GenBank: XM_001589919.1) χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο housekeeping και η σχετική γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001).
Το οξαλικό οξύ προσδιορίστηκε σε ζωμό δεξτρόζης πατάτας (PDB) και σε δείγματα φυτών που περιείχαν το μυκητιακό παθογόνο Sclerotinia sclerotiorum σύμφωνα με τη μέθοδο των Xu και Zhang (2000) με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, τα απομονωμένα στελέχη S. sclerotiorum εμβολιάστηκαν σε φιάλες που περιείχαν PDB και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε αναδευόμενο επωαστήρα (μοντέλο I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ΗΠΑ) στις 150 rpm στους 25 ± 2 °C για 3-5 ημέρες σε συνεχές σκοτάδι (24 ώρες) για να διεγείρουν την ανάπτυξη του μυκηλίου. Μετά την επώαση, η μυκητιακή καλλιέργεια διηθήθηκε πρώτα μέσω διηθητικού χαρτιού Whatman #1 και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 2500 rpm για 5 λεπτά για την απομάκρυνση του υπολειμματικού μυκηλίου. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους 4°C για περαιτέρω ποσοτικό προσδιορισμό του οξαλικού. Για την παρασκευή δειγμάτων φυτών, περίπου 0,1 g θραυσμάτων φυτικού ιστού εκχυλίστηκαν τρεις φορές με απεσταγμένο νερό (2 ml κάθε φορά). Τα δείγματα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις 2500 στροφές/λεπτό για 5 λεπτά, το υπερκείμενο διηθήθηκε ξηρά μέσω διηθητικού χαρτιού Whatman Νο. 1 και συλλέχθηκε για περαιτέρω ανάλυση.
Για την ποσοτική ανάλυση του οξαλικού οξέος, το μείγμα αντίδρασης παρασκευάστηκε σε γυάλινο πωματισμένο σωλήνα με την ακόλουθη σειρά: 0,2 ml δείγματος (ή διήθημα καλλιέργειας PDB ή πρότυπο διάλυμα οξαλικού οξέος), 0,11 ml μπλε βρωμοφαινόλης (BPB, 1 mM· Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, ΗΠΑ), 0,198 ml θειικού οξέος 1 M (H2SO4· Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Κάιρο, Αίγυπτος) και 0,176 ml διχρωμικού καλίου 100 mM (K2Cr2O7· TCI chemicals, Portland, OR, ΗΠΑ) και στη συνέχεια το διάλυμα αραιώθηκε στα 4,8 ml με απεσταγμένο νερό, αναμίχθηκε έντονα και τοποθετήθηκε αμέσως σε υδατόλουτρο 60 °C. Μετά από 10 λεπτά, η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη 0,5 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (NaOH· 0,75 M). Η απορρόφηση (A600) του μείγματος αντίδρασης μετρήθηκε στα 600 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-160 (Shimadzu Corporation, Ιαπωνία). Το PDB και το απεσταγμένο νερό χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι για την ποσοτικοποίηση των διηθημάτων καλλιέργειας και των δειγμάτων φυτών, αντίστοιχα. Οι συγκεντρώσεις οξαλικού οξέος στα διηθήματα καλλιέργειας, εκφρασμένες ως μικρογραμμάρια οξαλικού οξέος ανά χιλιοστόλιτρο μέσου PDB (μg.mL−1), και στα εκχυλίσματα φύλλων, εκφρασμένες ως μικρογραμμάρια οξαλικού οξέος ανά γραμμάριο νωπού βάρους (μg.g−1 FW), προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια καμπύλη βαθμονόμησης οξαλικού οξέος (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, ΗΠΑ).
Καθ' όλη τη διάρκεια της μελέτης, όλα τα πειράματα σχεδιάστηκαν με πλήρως τυχαιοποιημένο σχεδιασμό (CRD) με έξι βιολογικά αντίγραφα ανά θεραπεία και πέντε γλάστρες ανά βιολογικό αντίγραφο (δύο φυτά ανά γλάστρα), εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά. Τα βιολογικά αντίγραφα αναλύθηκαν εις διπλούν (δύο τεχνικά αντίγραφα). Τα τεχνικά αντίγραφα χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της αναπαραγωγιμότητας του ίδιου πειράματος, αλλά δεν χρησιμοποιήθηκαν στη στατιστική ανάλυση για την αποφυγή ψευδών αντιγράφων. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από δοκιμή Tukey-Kramer ειλικρινά σημαντικής διαφοράς (HSD) (p ≤ 0,05). Για πειράματα in vitro, οι τιμές IC50 και IC99 υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το μοντέλο probit και υπολογίστηκαν διαστήματα εμπιστοσύνης 95%.
Συνολικά τέσσερα απομονωμένα στελέχη συλλέχθηκαν από διαφορετικά χωράφια σόγιας στο Κυβερνείο Ελ Γκαμπίγια της Αιγύπτου. Σε μέσο PDA, όλα τα απομονωμένα στελέχη παρήγαγαν κρεμώδες λευκό μυκήλιο που γρήγορα έγινε λευκό σαν βαμβάκι (Σχήμα 1Α) και στη συνέχεια μπεζ ή καφέ στο στάδιο του σκληρωτίου. Τα σκληρώτια είναι συνήθως πυκνά, μαύρα, σφαιρικά ή ακανόνιστου σχήματος, μήκους 5,2 έως 7,7 mm και διαμέτρου 3,4 έως 5,3 mm (Σχήμα 1Β). Αν και τέσσερα απομονωμένα στελέχη ανέπτυξαν ένα οριακό μοτίβο σκληρωτίων στην άκρη του μέσου καλλιέργειας μετά από 10-12 ημέρες επώασης στους 25 ± 2 °C (Σχήμα 1Α), ο αριθμός των σκληρωτίων ανά πλάκα ήταν σημαντικά διαφορετικός μεταξύ τους (P < 0,001), με το απομονωμένο στέλεχος 3 να έχει τον μεγαλύτερο αριθμό σκληρωτίων (32,33 ± 1,53 σκληρώτια ανά πλάκα· Σχήμα 1C). Ομοίως, το απομονωμένο στέλεχος #3 παρήγαγε περισσότερο οξαλικό οξύ στο PDB από άλλα απομονωμένα στελέχη (3,33 ± 0,49 μg.mL−1· Σχήμα 1D). Το απομονωμένο στέλεχος #3 έδειξε τυπικά μορφολογικά και μικροσκοπικά χαρακτηριστικά του φυτοπαθογόνου μύκητα Sclerotinia sclerotiorum. Για παράδειγμα, στο PDA, οι αποικίες του απομονωμένου στέλεχος #3 αναπτύχθηκαν γρήγορα, ήταν κρεμώδες λευκές (Σχήμα 1Α), αντίστροφα μπεζ ή ανοιχτό σομόν κίτρινο-καφέ και χρειάστηκαν 6-7 ημέρες στους 25 ± 2°C για να καλύψουν πλήρως την επιφάνεια μιας πλάκας διαμέτρου 9 cm. Με βάση τα παραπάνω μορφολογικά και μικροσκοπικά χαρακτηριστικά, το απομονωμένο στέλεχος #3 ταυτοποιήθηκε ως Sclerotinia sclerotiorum.
Σχήμα 1. Χαρακτηριστικά και παθογένεια των απομονωμένων στελεχών S. sclerotiorum από κοινές καλλιέργειες ψυχανθών. (Α) Μυκηλιακή ανάπτυξη τεσσάρων απομονωμένων στελεχών S. sclerotiorum σε μέσο PDA, (Β) σκληρώτια τεσσάρων απομονωμένων στελεχών S. sclerotiorum, (Γ) αριθμός σκληρωτίων (ανά πλάκα), (Δ) έκκριση οξαλικού οξέος σε μέσο PDB (μg.mL−1) και (Ε) σοβαρότητα της νόσου (%) τεσσάρων απομονωμένων στελεχών S. sclerotiorum σε ευαίσθητη εμπορική ποικιλία ψυχανθών Giza 3 υπό συνθήκες θερμοκηπίου. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση (SD) πέντε βιολογικών επαναλήψεων (n = 5). Τα διαφορετικά γράμματα υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των θεραπειών (p < 0,05). (F–H) Τυπικά συμπτώματα λευκής μούχλας εμφανίστηκαν σε υπέργειους μίσχους και βλαστούς, αντίστοιχα, 10 ημέρες μετά τον εμβολιασμό με το απομονωμένο στέλεχος #3 (dpi). (I) Η εξελικτική ανάλυση της περιοχής εσωτερικού μεταγραφόμενου διαχωριστή (ITS) του απομονωμένου στελέχους S. sclerotiorum #3 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μέγιστης πιθανοφάνειας και συγκρίθηκε με 20 απομονωμένα στελέχη/στελέχη αναφοράς που ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων του Εθνικού Κέντρου Βιοτεχνολογικών Πληροφοριών (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Οι αριθμοί πάνω από τις γραμμές ομαδοποίησης υποδεικνύουν την κάλυψη της περιοχής (%), και οι αριθμοί κάτω από τις γραμμές ομαδοποίησης υποδεικνύουν το μήκος του κλάδου.
Επιπλέον, για την επιβεβαίωση της παθογένειας, τέσσερα απομονωμένα στελέχη S. sclerotiorum χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό της ευαίσθητης εμπορικής ποικιλίας φασολιών Giza 3 υπό συνθήκες θερμοκηπίου, κάτι που συμφωνεί με τα αξιώματα του Koch (Εικ. 1Ε). Παρόλο που όλα τα απομονωμένα στελέχη μυκήτων που ελήφθησαν ήταν παθογόνα και μπορούσαν να μολύνουν το πράσινο φασόλι (cv. Giza 3), προκαλώντας τυπικά συμπτώματα λευκής μούχλας σε όλα τα υπέργεια μέρη (Εικ. 1F), ειδικά στους μίσχους (Εικ. 1G) και τους λοβούς (Εικ. 1H) 10 ημέρες μετά τον εμβολιασμό (dpi), το απομονωμένο στέλεχος 3 ήταν το πιο επιθετικό απομονωμένο στέλεχος σε δύο ανεξάρτητα πειράματα. Το απομονωμένο στέλεχος 3 είχε την υψηλότερη σοβαρότητα της νόσου (%) στα φυτά φασολιών (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 και 76,7 ± 3,1 στις 7, 14 και 21 ημέρες μετά τη μόλυνση, αντίστοιχα· Σχήμα 1F).
Η ταυτοποίηση του πιο επεμβατικού απομονωμένου στελέχους S. sclerotiorum #3 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με βάση την αλληλούχιση εσωτερικού μεταγραφόμενου διαχωριστή (ITS) (Εικ. 1I). Η φυλογενετική ανάλυση μεταξύ του απομονωμένου στελέχους #3 και 20 απομονωμένων στελεχών/στελεχών αναφοράς έδειξε υψηλή ομοιότητα (>99%) μεταξύ τους. Αξίζει να σημειωθεί ότι το απομονωμένο στελέχος S. sclerotiorum #3 (533 bp) έχει υψηλή ομοιότητα με το αμερικανικό απομονωμένο στελέχος S. sclerotiorum LPM36 που απομονώθηκε από σπόρους ξηρού μπιζελιού (αριθμός πρόσβασης GenBank MK896659.1; 540 bp) και το κινεζικό απομονωμένο στελέχος S. sclerotiorum YKY211 (αριθμός πρόσβασης GenBank OR206374.1; 548 bp), το οποίο προκαλεί σήψη στελέχους από βιολετί (Matthiola incana), τα οποία ομαδοποιούνται ξεχωριστά στην κορυφή του δενδρογράμματος (Εικ. 1I). Η νέα αλληλουχία έχει κατατεθεί στη βάση δεδομένων του NCBI και ονομάστηκε «Sclerotinia sclerotiorum – απομονωμένο στέλεχος YN-25» (αριθμός πρόσβασης GenBank PV202792). Μπορεί να φανεί ότι το απομονωμένο στέλεχος 3 είναι το πιο επεμβατικό απομονωμένο στέλεχος. Συνεπώς, αυτό το απομονωμένο στέλεχος επιλέχθηκε για μελέτη σε όλα τα επόμενα πειράματα.
Η αντιβακτηριακή δράση της διαμίνης L-ορνιθίνης (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Γερμανία) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (12,5, 25, 50, 75, 100 και 125 mg/L) έναντι του απομονωμένου στελέχους 3 του S. sclerotiorum διερευνήθηκε in vitro. Αξίζει να σημειωθεί ότι η L-ορνιθίνη άσκησε αντιβακτηριακή δράση και σταδιακά ανέστειλε την ακτινική ανάπτυξη των υφών του S. sclerotiorum με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Α, Β). Στην υψηλότερη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (125 mg/L), η L-ορνιθίνη επέδειξε τον υψηλότερο ρυθμό αναστολής της μυκηλιακής ανάπτυξης (99,62 ± 0,27%· Σχήμα 2Β), ο οποίος ήταν ισοδύναμος με το εμπορικό μυκητοκτόνο Rizolex-T (ρυθμός αναστολής 99,45 ± 0,39%· Σχήμα 2C) στην υψηλότερη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (10 mg/L), υποδεικνύοντας παρόμοια αποτελεσματικότητα.
Σχήμα 2. Αντιβακτηριακή δράση in vitro της L-ορνιθίνης έναντι του Sclerotinia sclerotiorum. (A) Σύγκριση της αντιβακτηριακής δράσης διαφορετικών συγκεντρώσεων L-ορνιθίνης έναντι του S. sclerotiorum με το εμπορικό μυκητοκτόνο Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Ποσοστό αναστολής (%) της μυκηλιακής ανάπτυξης του S. sclerotiorum μετά από θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις L-ορνιθίνης (12,5, 25, 50, 75, 100 και 125 mg/L) ή Rizolex-T (2, 4, 6, 8 και 10 mg/L), αντίστοιχα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD πέντε βιολογικών επαναλήψεων (n = 5). Τα διαφορετικά γράμματα υποδηλώνουν στατιστικές διαφορές μεταξύ των θεραπειών (p < 0,05). (D, E) Ανάλυση παλινδρόμησης μοντέλου Probit της L-ορνιθίνης και του εμπορικού μυκητοκτόνου Rizolex-T, αντίστοιχα. Η γραμμή παλινδρόμησης του μοντέλου probit εμφανίζεται ως συνεχής μπλε γραμμή και το διάστημα εμπιστοσύνης (95%) εμφανίζεται ως διακεκομμένη κόκκινη γραμμή.
Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ανάλυση παλινδρόμησης probit και τα αντίστοιχα γραφήματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 και στα Σχήματα 2D,E. Εν συντομία, η αποδεκτή τιμή κλίσης (y = 2,92x − 4,67) και τα σχετικά σημαντικά στατιστικά στοιχεία (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 και p < 0,0001· Σχήμα 2D) της L-ορνιθίνης έδειξαν ενισχυμένη αντιμυκητιασική δράση έναντι του S. sclerotiorum σε σύγκριση με το εμπορικό μυκητοκτόνο Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 και p < 0,0001) (Πίνακας 1).
Πίνακας 1. Τιμές της μισής μέγιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (IC50) και της IC99 (mg/l) της L-ορνιθίνης και του εμπορικού μυκητοκτόνου «Rizolex-T» κατά του S. sclerotiorum.
Συνολικά, η L-ορνιθίνη (250 mg/L) μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη και τη σοβαρότητα της λευκής μούχλας σε επεξεργασμένα κοινά φυτά φασολιών σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα μολυσμένα με S. sclerotiorum φυτά (μάρτυρας· Σχήμα 3Α). Εν συντομία, αν και η σοβαρότητα της νόσου των μη επεξεργασμένων μολυσμένων φυτών ελέγχου αυξήθηκε σταδιακά (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 και 92,33 ± 3,06%), η L-ορνιθίνη μείωσε σημαντικά τη σοβαρότητα της νόσου (%) καθ' όλη τη διάρκεια του πειράματος (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 και 26,36 ± 3,07) στις 7, 14 και 21 ημέρες μετά την επεξεργασία (dpt), αντίστοιχα (Σχήμα 3Α). Ομοίως, όταν φυτά φασολιών που είχαν μολυνθεί από S. sclerotiorum υποβλήθηκαν σε αγωγή με 250 mg/L L-ορνιθίνης, η περιοχή κάτω από την καμπύλη εξέλιξης της νόσου (AUDPC) μειώθηκε από 1274,33 ± 33,13 στον μη επεξεργασμένο μάρτυρα σε 281,03 ± 7,95, η οποία ήταν ελαφρώς χαμηλότερη από εκείνη του θετικού μάρτυρα 50 mg/L Rizolex-T μυκητοκτόνου (183,61 ± 7,71· Σχήμα 3Β). Η ίδια τάση παρατηρήθηκε και στο δεύτερο πείραμα.
Σχήμα 3. Επίδραση της εξωγενούς εφαρμογής L-ορνιθίνης στην ανάπτυξη λευκής σήψης στα φασόλια που προκαλείται από Sclerotinia sclerotiorum σε συνθήκες θερμοκηπίου. (Α) Καμπύλη εξέλιξης της νόσου της λευκής μούχλας στα φασόλια μετά από θεραπεία με 250 mg/L L-ορνιθίνη. (Β) Εμβαδόν κάτω από την καμπύλη εξέλιξης της νόσου (AUDPC) της λευκής μούχλας στα φασόλια μετά από θεραπεία με L-ορνιθίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± SD πέντε βιολογικών επαναλήψεων (n = 5). Διαφορετικά γράμματα υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των θεραπειών (p < 0,05).
Η εξωγενής εφαρμογή 250 mg/L L-ορνιθίνης αύξησε σταδιακά το ύψος του φυτού (Εικ. 4Α), τον αριθμό των κλαδιών ανά φυτό (Εικ. 4Β) και τον αριθμό των φύλλων ανά φυτό (Εικ. 4C) μετά από 42 ημέρες. Ενώ το εμπορικό μυκητοκτόνο Rizolex-T (50 mg/L) είχε τη μεγαλύτερη επίδραση σε όλες τις θρεπτικές παραμέτρους που μελετήθηκαν, η εξωγενής εφαρμογή 250 mg/L L-ορνιθίνης είχε τη δεύτερη μεγαλύτερη επίδραση σε σύγκριση με τους μη επεξεργασμένους μάρτυρες (Εικ. 4Α-C). Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία με L-ορνιθίνη δεν είχε σημαντική επίδραση στην περιεκτικότητα των φωτοσυνθετικών χρωστικών χλωροφύλλης a (Εικ. 4D) και χλωροφύλλης b (Εικ. 4Ε), αλλά αύξησε ελαφρώς τη συνολική περιεκτικότητα σε καροτενοειδή (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα (0,44 ± 0,02 mg/g fr wt) και τον θετικό μάρτυρα (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt· Εικ. 4F). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η L-ορνιθίνη δεν είναι φυτοτοξική για τα επεξεργασμένα όσπρια και μπορεί ακόμη και να διεγείρει την ανάπτυξή τους.
Σχήμα 4. Επίδραση της εξωγενούς εφαρμογής L-ορνιθίνης στα χαρακτηριστικά ανάπτυξης και τις φωτοσυνθετικές χρωστικές ουσίες φύλλων φασολιών που έχουν μολυνθεί με Sclerotinia sclerotiorum υπό συνθήκες θερμοκηπίου. (A) Ύψος φυτού (cm), (B) Αριθμός κλαδιών ανά φυτό, (C) Αριθμός φύλλων ανά φυτό, (D) Περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη a (mg g-1 fr wt), (E) Περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη b (mg g-1 fr wt), (F) Συνολική περιεκτικότητα σε καροτενοειδή (mg g-1 fr wt). Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) πέντε βιολογικών επαναλήψεων (n = 5). Τα διαφορετικά γράμματα υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των θεραπειών (p < 0,05).
Ο in situ ιστοχημικός εντοπισμός δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS, εκφρασμένο ως υπεροξείδιο του υδρογόνου [H2O2]) και ελεύθερων ριζών (εκφραζόμενων ως ανιόντα υπεροξειδίου [O2•−]) αποκάλυψε ότι η εξωγενής εφαρμογή L-ορνιθίνης (250 mg/L) μείωσε σημαντικά τη συσσώρευση H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW, Σχήμα 5Α) και O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW, Σχήμα 5Β) σε σύγκριση με τη συσσώρευση τόσο των μη επεξεργασμένων μολυσμένων φυτών (173,31 ± 12,06 και 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, αντίστοιχα) όσο και των φυτών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 50 mg/L του εμπορικού μυκητοκτόνου Rizolex-T (170,12 ± 9,50 και 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, αντίστοιχα) στις 72 ώρες. Υψηλά επίπεδα H2O2 και O2•− συσσωρεύτηκαν υπό την επίδραση hpt (Εικ. 5Α, Β). Ομοίως, η δοκιμασία μαλονδιαλδεΰδης (MDA) με βάση το TCA έδειξε ότι τα φυτά φασολιών που είχαν μολυνθεί με S. sclerotiorum συσσώρευσαν υψηλότερα επίπεδα MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) στα φύλλα τους (Εικ. 5C). Ωστόσο, η εξωγενής εφαρμογή L-ορνιθίνης μείωσε σημαντικά την υπεροξείδωση των λιπιδίων, όπως αποδεικνύεται από τη μείωση της περιεκτικότητας σε MDA στα φυτά που υποβλήθηκαν σε αγωγή (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Σχήμα 5. Επίδραση της εξωγενούς εφαρμογής L-ορνιθίνης σε κύριους δείκτες οξειδωτικού στρες και μη ενζυματικών αντιοξειδωτικών αμυντικών μηχανισμών σε φύλλα φασολιών μολυσμένα με S. sclerotiorum 72 ώρες μετά τη μόλυνση υπό συνθήκες θερμοκηπίου. (A) Υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2; nmol g−1 FW) στα 72 hpt, (B) ανιόν υπεροξειδίου (O2•−; nmol g−1 FW) στα 72 hpt, (C) μαλονδιαλδεΰδη (MDA; nmol g−1 FW) στα 72 hpt, (D) συνολικές διαλυτές φαινόλες (mg GAE g−1 FW) στα 72 hpt, (E) συνολικά διαλυτά φλαβονοειδή (mg RE g−1 FW) στα 72 hpt, (F) συνολικά ελεύθερα αμινοξέα (mg g−1 FW) στα 72 hpt, και (G) περιεκτικότητα σε προλίνη (mg g−1 FW) στα 72 hpt. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση) 5 βιολογικών επαναλήψεων (n = 5). Τα διαφορετικά γράμματα υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των θεραπειών (p < 0,05).