Διαφορετικές θεωρίες άμυνας των φυτών παρέχουν σημαντική θεωρητική καθοδήγηση για την εξήγηση των προτύπων του εξειδικευμένου μεταβολισμού των φυτών, αλλά οι βασικές προβλέψεις τους δεν έχουν ακόμη δοκιμαστεί. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε αμερόληπτη ανάλυση φασματομετρίας μάζας σε σειρά (MS/MS) για να διερευνήσουμε συστηματικά το μεταβολικό σύστημα εξασθενημένων στελεχών καπνού από μεμονωμένα φυτά σε πληθυσμούς και στενά συγγενικά είδη και επεξεργαστήκαμε έναν μεγάλο αριθμό θεωριών χαρακτηριστικών φασματομετρίας μάζας με βάση τα φάσματα ενώσεων στις πληροφορίες. Πλαίσιο για τον έλεγχο των βασικών προβλέψεων των θεωριών βέλτιστης άμυνας (OD) και κινούμενου στόχου (MT). Το πληροφοριακό στοιχείο της μεταβολομικής των φυτών είναι σύμφωνο με τη θεωρία OD, αλλά έρχεται σε αντίθεση με την κύρια πρόβλεψη της θεωρίας MT σχετικά με τη δυναμική της μεταβολομικής που προκαλείται από τα φυτοφάγα. Από τη μικρο έως τη μακρο εξελικτική κλίμακα, το σήμα του ιασμονικού αναγνωρίστηκε ως ο κύριος καθοριστικός παράγοντας της OD, ενώ το σήμα του αιθυλενίου παρείχε λεπτομερή ρύθμιση της απόκρισης ειδικής για τα φυτοφάγα, όπως σχολιάζεται από το μοριακό δίκτυο MS/MS.
Οι ειδικοί μεταβολίτες με ποικίλες δομές είναι οι κύριοι παράγοντες που συμβάλλουν στην προσαρμογή των φυτών στο περιβάλλον, ειδικά στην άμυνα κατά των εχθρών (1). Η εκπληκτική διαφοροποίηση του ειδικού μεταβολισμού που βρίσκεται στα φυτά έχει πυροδοτήσει δεκαετίες εις βάθος έρευνας σχετικά με τις πολλές πτυχές των οικολογικών λειτουργιών του και έχει διαμορφώσει μια μακρά λίστα θεωριών άμυνας των φυτών, οι οποίες αποτελούν την εξελικτική και οικολογική ανάπτυξη των αλληλεπιδράσεων φυτού-εντόμου. Η εμπειρική έρευνα παρέχει σημαντική καθοδήγηση (2). Ωστόσο, αυτές οι θεωρίες άμυνας των φυτών δεν ακολούθησαν την κανονιστική πορεία της υποθετικής επαγωγικής συλλογιστικής, στην οποία οι βασικές προβλέψεις βρίσκονταν στο ίδιο επίπεδο ανάλυσης (3) και δοκιμάστηκαν πειραματικά για να προωθήσουν τον επόμενο κύκλο θεωρητικής ανάπτυξης (4). Οι τεχνικοί περιορισμοί περιορίζουν τη συλλογή δεδομένων σε συγκεκριμένες μεταβολικές κατηγορίες και αποκλείουν την ολοκληρωμένη ανάλυση εξειδικευμένων μεταβολιτών, αποτρέποντας έτσι τις συγκρίσεις μεταξύ κατηγοριών που είναι απαραίτητες για τη θεωρητική ανάπτυξη (5). Η έλλειψη ολοκληρωμένων μεταβολικών δεδομένων και ενός κοινού νομίσματος για τη σύγκριση της ροής εργασίας επεξεργασίας του μεταβολικού χώρου μεταξύ διαφορετικών φυτικών ομάδων εμποδίζει την επιστημονική ωριμότητα του πεδίου.
Οι τελευταίες εξελίξεις στον τομέα της μεταβολομικής της διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (MS/MS) μπορούν να χαρακτηρίσουν συνολικά τις μεταβολικές αλλαγές εντός και μεταξύ των ειδών ενός δεδομένου κλάδου συστημάτων και μπορούν να συνδυαστούν με υπολογιστικές μεθόδους για τον υπολογισμό της δομικής ομοιότητας μεταξύ αυτών των σύνθετων μειγμάτων. Προηγούμενη γνώση της χημείας (5). Ο συνδυασμός προηγμένων τεχνολογιών στην ανάλυση και την πληροφορική παρέχει ένα απαραίτητο πλαίσιο για μακροπρόθεσμες δοκιμές πολλών προβλέψεων που γίνονται από τις οικολογικές και εξελικτικές θεωρίες της μεταβολικής ποικιλομορφίας. Ο Shannon (6) εισήγαγε τη θεωρία πληροφοριών για πρώτη φορά στο πρωτοποριακό του άρθρο το 1948, θέτοντας τα θεμέλια για τη μαθηματική ανάλυση των πληροφοριών, η οποία έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλούς τομείς εκτός από την αρχική της εφαρμογή. Στη γονιδιωματική, η θεωρία πληροφοριών έχει εφαρμοστεί με επιτυχία για την ποσοτικοποίηση των συντηρητικών πληροφοριών αλληλουχίας (7). Στην έρευνα της μεταγραφομικής, η θεωρία πληροφοριών αναλύει τις συνολικές αλλαγές στο μεταγραφόσωμα (8). Σε προηγούμενη έρευνα, εφαρμόσαμε το στατιστικό πλαίσιο της θεωρίας πληροφοριών στη μεταβολομική για να περιγράψουμε την μεταβολική εμπειρογνωμοσύνη του επιπέδου ιστού στα φυτά (9). Εδώ, συνδυάζουμε τη ροή εργασίας που βασίζεται σε MS/MS με το στατιστικό πλαίσιο της θεωρίας πληροφοριών, που χαρακτηρίζεται από την μεταβολική ποικιλομορφία στο κοινό νόμισμα, για να συγκρίνουμε τις βασικές προβλέψεις της θεωρίας φυτικής άμυνας του μεταβολώματος που προκαλείται από τα φυτοφάγα.
Τα θεωρητικά πλαίσια της φυτικής άμυνας είναι συνήθως αμοιβαία περιεκτικά και μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες: αυτά που προσπαθούν να εξηγήσουν την κατανομή των μεταβολιτών που αφορούν συγκεκριμένα φυτά με βάση τις αμυντικές λειτουργίες, όπως η βέλτιστη άμυνα (OD) (10), η θεωρία του κινούμενου στόχου (MT) (11) και η θεωρία της εμφάνισης (12), ενώ άλλα αναζητούν μηχανικές εξηγήσεις για το πώς οι αλλαγές στη διαθεσιμότητα των πόρων επηρεάζουν την ανάπτυξη των φυτών και τη συσσώρευση εξειδικευμένων μεταβολιτών, όπως η υπόθεση του άνθρακα: ισορροπίας θρεπτικών συστατικών (13), η υπόθεση του ρυθμού ανάπτυξης (14) και η υπόθεση της ισορροπίας ανάπτυξης και διαφοροποίησης (15). Τα δύο σύνολα θεωριών βρίσκονται σε διαφορετικά επίπεδα ανάλυσης (4). Ωστόσο, δύο θεωρίες που αφορούν αμυντικές λειτουργίες σε λειτουργικό επίπεδο κυριαρχούν στη συζήτηση σχετικά με τις συστατικές και επαγώγιμες άμυνες των φυτών: η θεωρία OD, η οποία υποθέτει ότι τα φυτά επενδύουν στις ακριβές χημικές άμυνές τους μόνο όταν χρειάζεται, για παράδειγμα, όταν καταπίνονται. Όταν ένα αγρωστώδες ζώο επιτίθεται, επομένως, ανάλογα με την πιθανότητα μελλοντικής επίθεσης, αποδίδεται η ένωση με αμυντική λειτουργία (10). Η υπόθεση MT προτείνει ότι δεν υπάρχει άξονας κατευθυντικής αλλαγής του μεταβολίτη, αλλά ο μεταβολίτης αλλάζει τυχαία, δημιουργώντας έτσι την πιθανότητα να εμποδιστεί ο μεταβολικός «στόχος κίνησης» της επίθεσης σε φυτοφάγα. Με άλλα λόγια, αυτές οι δύο θεωρίες κάνουν αντίθετες προβλέψεις σχετικά με την μεταβολική αναδιαμόρφωση που συμβαίνει μετά την επίθεση των φυτοφάγων: τη σχέση μεταξύ της μονοκατευθυντικής συσσώρευσης μεταβολιτών με αμυντική λειτουργία (OD) και των μη κατευθυνόμενων μεταβολικών αλλαγών (MT) (11).
Οι υποθέσεις OD και MT περιλαμβάνουν όχι μόνο τις επαγόμενες αλλαγές στο μεταβολικό σύστημα, αλλά και τις οικολογικές και εξελικτικές συνέπειες της συσσώρευσης αυτών των μεταβολιτών, όπως το προσαρμοστικό κόστος και τα οφέλη αυτών των μεταβολικών αλλαγών σε ένα συγκεκριμένο οικολογικό περιβάλλον (16). Αν και και οι δύο υποθέσεις αναγνωρίζουν την αμυντική λειτουργία εξειδικευμένων μεταβολιτών, η οποία μπορεί να είναι ή να μην είναι δαπανηρή, η βασική πρόβλεψη που διακρίνει τις υποθέσεις OD και MT έγκειται στην κατευθυντικότητα των επαγόμενων μεταβολικών αλλαγών. Η πρόβλεψη της θεωρίας OD έχει λάβει την μεγαλύτερη πειραματική προσοχή μέχρι στιγμής. Αυτές οι δοκιμές περιλαμβάνουν τη μελέτη των άμεσων ή έμμεσων αμυντικών λειτουργιών διαφορετικών ιστών συγκεκριμένων ενώσεων σε θερμοκήπια και φυσικές συνθήκες, καθώς και αλλαγές στο στάδιο ανάπτυξης των φυτών (17-19). Ωστόσο, μέχρι στιγμής, λόγω της έλλειψης ροής εργασίας και στατιστικού πλαισίου για την παγκόσμια ολοκληρωμένη ανάλυση της μεταβολικής ποικιλομορφίας οποιουδήποτε οργανισμού, η κύρια πρόβλεψη διαφοράς μεταξύ των δύο θεωριών (δηλαδή, η κατεύθυνση των μεταβολικών αλλαγών) παραμένει προς δοκιμή. Εδώ, παρέχουμε μια τέτοια ανάλυση.
Ένα από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά των μεταβολιτών που αφορούν συγκεκριμένα φυτά είναι η ακραία δομική τους ποικιλομορφία σε όλα τα επίπεδα, από μεμονωμένα φυτά, πληθυσμούς έως παρόμοια είδη (20). Πολλές ποσοτικές αλλαγές στους εξειδικευμένους μεταβολίτες μπορούν να παρατηρηθούν σε πληθυσμιακή κλίμακα, ενώ συνήθως διατηρούνται ισχυρές ποιοτικές διαφορές σε επίπεδο είδους (20). Επομένως, η μεταβολική ποικιλομορφία των φυτών είναι η κύρια πτυχή της λειτουργικής ποικιλομορφίας, αντανακλώντας την προσαρμοστικότητα σε διαφορετικές κόγχες, ειδικά σε εκείνες τις κόγχες με διαφορετικές δυνατότητες εισβολής από ειδικά έντομα και κοινά φυτοφάγα (21). Από το πρωτοποριακό άρθρο του Fraenkel (22) σχετικά με τους λόγους ύπαρξης μεταβολιτών που αφορούν συγκεκριμένα φυτά, οι αλληλεπιδράσεις με διάφορα έντομα έχουν θεωρηθεί ως σημαντικές πιέσεις επιλογής και πιστεύεται ότι αυτές οι αλληλεπιδράσεις έχουν διαμορφώσει τα φυτά κατά την εξέλιξη. Μεταβολική οδός (23). Οι διαφορές μεταξύ των ειδών στην ποικιλομορφία των εξειδικευμένων μεταβολιτών μπορεί επίσης να αντανακλούν τη φυσιολογική ισορροπία που σχετίζεται με τη συστατική και επαγώγιμη άμυνα των φυτών έναντι των φυτοφάγων στρατηγικών, καθώς τα δύο είδη συχνά συσχετίζονται αρνητικά μεταξύ τους (24). Παρόλο που μπορεί να είναι ωφέλιμο να διατηρείται μια καλή άμυνα ανά πάσα στιγμή, οι έγκαιρες μεταβολικές αλλαγές που σχετίζονται με την άμυνα παρέχουν σαφή οφέλη, επιτρέποντας στα φυτά να διαθέτουν πολύτιμους πόρους σε άλλες φυσιολογικές επενδύσεις (19, 24) και να αποφεύγουν την ανάγκη για συμβίωση. Παράπλευρες απώλειες (25). Επιπλέον, αυτές οι αναδιοργανώσεις εξειδικευμένων μεταβολιτών που προκαλούνται από έντομα φυτοφάγα μπορεί να οδηγήσουν σε καταστροφική κατανομή στον πληθυσμό (26) και μπορεί να αντανακλούν άμεσες μετρήσεις σημαντικών φυσικών αλλαγών στο σήμα του ιασμονικού οξέος (JA), το οποίο μπορεί να διατηρείται στον πληθυσμό. Τα υψηλά και χαμηλά σήματα JA είναι συμβιβασμοί μεταξύ της άμυνας έναντι των φυτοφάγων και του ανταγωνισμού με συγκεκριμένα είδη (27). Επιπλέον, οι εξειδικευμένες βιοσυνθετικές οδοί μεταβολιτών θα υποστούν ταχεία απώλεια και μετασχηματισμό κατά την εξέλιξη, με αποτέλεσμα την ανομοιογενή μεταβολική κατανομή μεταξύ στενά συγγενικών ειδών (28). Αυτοί οι πολυμορφισμοί μπορούν να δημιουργηθούν γρήγορα ως απόκριση στα μεταβαλλόμενα πρότυπα των φυτοφάγων (29), πράγμα που σημαίνει ότι η διακύμανση των φυτοφάγων κοινοτήτων είναι ένας βασικός παράγοντας που οδηγεί στην μεταβολική ετερογένεια.
Εδώ, λύσαμε συγκεκριμένα τα ακόλουθα προβλήματα. (I) Πώς αναδιαμορφώνει το φυτικό μεταβολολόγιο το φυτικό έντομο; (Ii) Ποια είναι τα κύρια πληροφοριακά στοιχεία της μεταβολικής πλαστικότητας που μπορούν να ποσοτικοποιηθούν για να ελεγχθούν οι προβλέψεις της θεωρίας μακροπρόθεσμης άμυνας; (Iii) Εάν πρέπει να επαναπρογραμματιστεί το φυτικό μεταβολολόγιο με τρόπο μοναδικό για τον επιτιθέμενο; Εάν ναι, ποιος είναι ο ρόλος της φυτικής ορμόνης στην προσαρμογή μιας συγκεκριμένης μεταβολικής απόκρισης και ποιοι μεταβολίτες συμβάλλουν στην εξειδίκευση της άμυνας ανά είδος; (Iv) Δεδομένου ότι οι προβλέψεις που γίνονται από πολλές θεωρίες άμυνας μπορούν να επεκταθούν σε όλα τα επίπεδα βιολογικών ιστών, ρωτήσαμε πόσο συνεπής είναι η μεταβολική απόκριση που προκαλείται από την εσωτερική σύγκριση έως τη σύγκριση μεταξύ ειδών; Για τον σκοπό αυτό, μελετήσαμε συστηματικά το μεταβολικό σύστημα των φύλλων της νικοτίνης του καπνού, το οποίο αποτελεί ένα οικολογικό μοντέλο φυτού με πλούσιο εξειδικευμένο μεταβολισμό και είναι αποτελεσματικό έναντι των προνυμφών δύο ιθαγενών φυτοφάγων, των Lepidoptera Datura (Ms) (Πολύ επιθετικό, κυρίως τρώγεται). Στα Solanaceae και Spodoptera littoralis (Sl), τα σκουλήκια βαμβακιού αποτελούν ένα είδος «γένους», με τα φυτά ξενιστές των Solanaceae και άλλους ξενιστές άλλων γενών και οικογενειών να αποτελούν φυτική τροφή. Αναλύσαμε το φάσμα μεταβολισμού MS/MS και εξαγάγαμε στατιστικούς περιγραφείς θεωρίας πληροφοριών για να συγκρίνουμε τις θεωρίες OD και MT. Δημιουργήσαμε χάρτες εξειδίκευσης για να αποκαλύψουμε την ταυτότητα των βασικών μεταβολιτών. Η ανάλυση επεκτάθηκε στον ιθαγενή πληθυσμό του N. nasi και στενά συγγενικών ειδών καπνού για να αναλύσουμε περαιτέρω τη συνδιακύμανση μεταξύ της σηματοδότησης των φυτικών ορμονών και της επαγωγής OD.
Προκειμένου να καταγράψουμε έναν συνολικό χάρτη σχετικά με την πλαστικότητα και τη δομή του μεταβολισμού των φύλλων του φυτοφάγου καπνού, χρησιμοποιήσαμε μια προηγουμένως αναπτυγμένη ροή εργασίας ανάλυσης και υπολογισμού για να συλλέξουμε και να αποσυνθέσουμε ολοκληρωμένα φάσματα MS/MS ανεξάρτητα από δεδομένα υψηλής ανάλυσης από φυτικά εκχυλίσματα (9). Αυτή η μη διαφοροποιημένη μέθοδος (που ονομάζεται MS/MS) μπορεί να κατασκευάσει μη πλεονάζοντα φάσματα ενώσεων, τα οποία μπορούν στη συνέχεια να χρησιμοποιηθούν για όλες τις αναλύσεις σε επίπεδο ένωσης που περιγράφονται εδώ. Αυτοί οι αποσυντεθειμένοι φυτικοί μεταβολίτες είναι διαφόρων τύπων, αποτελούμενοι από εκατοντάδες έως χιλιάδες μεταβολίτες (περίπου 500-1000-s/MS/MS εδώ). Εδώ, εξετάζουμε τη μεταβολική πλαστικότητα στο πλαίσιο της θεωρίας πληροφοριών και ποσοτικοποιούμε την ποικιλομορφία και τον επαγγελματισμό του μεταβολισμού με βάση την εντροπία Shannon της κατανομής μεταβολικής συχνότητας. Χρησιμοποιώντας τον προηγουμένως εφαρμοσμένο τύπο (8), υπολογίσαμε ένα σύνολο δεικτών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ποσοτικοποίηση της ποικιλομορφίας του μεταβολισμού (δείκτης Hj), της εξειδίκευσης του μεταβολικού προφίλ (δείκτης δj) και της μεταβολικής εξειδίκευσης ενός μεμονωμένου μεταβολίτη (δείκτης Si). Επιπλέον, εφαρμόσαμε τον Δείκτη Σχετικής Πλαστικότητας Απόστασης (RDPI) για να ποσοτικοποιήσουμε την επαγωγιμότητα μεταβολιτών των φυτοφάγων (Σχήμα 1Α) (30). Μέσα σε αυτό το στατιστικό πλαίσιο, αντιμετωπίζουμε το φάσμα MS/MS ως τη βασική μονάδα πληροφοριών και επεξεργαζόμαστε τη σχετική αφθονία των MS/MS σε έναν χάρτη κατανομής συχνότητας και στη συνέχεια χρησιμοποιούμε την εντροπία Shannon για να εκτιμήσουμε την ποικιλομορφία των μεταβολιτών από αυτόν. Η εξειδίκευση των μεταβολιτών μετριέται από τη μέση εξειδίκευση ενός μόνο φάσματος MS/MS. Επομένως, η αύξηση στην αφθονία ορισμένων κατηγοριών MS/MS μετά την επαγωγή των φυτοφάγων μετασχηματίζεται σε φασματική επαγωγιμότητα, RDPI και εξειδίκευση, δηλαδή στην αύξηση του δείκτη δj, επειδή παράγονται πιο εξειδικευμένοι μεταβολίτες και παράγεται υψηλός δείκτης Si. Η μείωση του δείκτη ποικιλομορφίας Hj αντανακλά είτε ότι ο αριθμός των παραγόμενων MS/MS μειώνεται είτε η κατανομή συχνότητας προφίλ αλλάζει σε λιγότερο ομοιόμορφη κατεύθυνση, μειώνοντας παράλληλα τη συνολική αβεβαιότητά της. Μέσω του υπολογισμού του δείκτη Si, είναι δυνατό να επισημανθεί ποια MS/MS επάγονται από ορισμένα φυτοφάγα ζώα, και αντίθετα, ποια MS/MS δεν ανταποκρίνονται στην επαγωγή, γεγονός που αποτελεί βασικό δείκτη για τη διάκριση της πρόβλεψης MT και της OD.
(Α) Στατιστικές περιγραφές που χρησιμοποιούνται για την επαγωγιμότητα δεδομένων MS/MS (RDPI) των φυτοφάγων (H1 έως Hx), την ποικιλομορφία (δείκτης Hj), την εξειδίκευση (δείκτης δj) και την εξειδίκευση των μεταβολιτών (δείκτης Si). Η αύξηση του βαθμού εξειδίκευσης (δj) υποδεικνύει ότι, κατά μέσο όρο, θα παράγονται περισσότεροι φυτοφάγοι ειδικοί μεταβολίτες, ενώ η μείωση της ποικιλομορφίας (Hj) υποδεικνύει μείωση στην παραγωγή μεταβολιτών ή ανομοιόμορφη κατανομή των μεταβολιτών στον χάρτη κατανομής. Η τιμή Si αξιολογεί εάν ο μεταβολίτης είναι ειδικός για μια δεδομένη κατάσταση (εδώ, φυτοφάγος) ή αντίστροφα διατηρείται στο ίδιο επίπεδο. (Β) Εννοιολογικό διάγραμμα πρόβλεψης της θεωρίας άμυνας χρησιμοποιώντας τον άξονα της θεωρίας πληροφοριών. Η θεωρία OD προβλέπει ότι η επίθεση των φυτοφάγων θα αυξήσει τους μεταβολίτες άμυνας, αυξάνοντας έτσι το δj. Ταυτόχρονα, το Hj μειώνεται επειδή το προφίλ αναδιοργανώνεται προς τη μειωμένη αβεβαιότητα των μεταβολικών πληροφοριών. Η θεωρία MT προβλέπει ότι η επίθεση των φυτοφάγων θα προκαλέσει μη κατευθυντικές αλλαγές στο μεταβολόμετρο, αυξάνοντας έτσι το Hj ως δείκτη αυξημένης αβεβαιότητας μεταβολικών πληροφοριών και προκαλώντας τυχαία κατανομή του Si. Προτείναμε επίσης ένα μικτό μοντέλο, το καλύτερο MT, στο οποίο ορισμένοι μεταβολίτες με υψηλότερες αμυντικές τιμές θα είναι ιδιαίτερα αυξημένοι (υψηλή τιμή Si), ενώ άλλοι θα εμφανίζουν τυχαίες αποκρίσεις (χαμηλότερη τιμή Si).
Χρησιμοποιώντας περιγραφείς της θεωρίας πληροφοριών, ερμηνεύουμε τη θεωρία OD για να προβλέψουμε ότι οι αλλαγές ειδικών μεταβολιτών που προκαλούνται από φυτοφάγα σε μια μη επαγόμενη συστατική κατάσταση θα οδηγήσουν σε (i) αύξηση της μεταβολικής εξειδίκευσης (δείκτης Si) οδηγώντας σε μεταβιονομική εξειδίκευση (δείκτης δj). Την αύξηση ορισμένων ειδικών ομάδων μεταβολιτών με υψηλότερη αμυντική τιμή και (ii) τη μείωση της ποικιλομορφίας μεταβολιτών (δείκτης Hj) λόγω της αλλαγής στην κατανομή της μεταβολικής συχνότητας σε μεγαλύτερη κατανομή σωμάτων λεπτίνης. Στο επίπεδο ενός μεμονωμένου μεταβολίτη, αναμένεται μια διατεταγμένη κατανομή Si, όπου ο μεταβολίτης θα αυξήσει την τιμή Si σύμφωνα με την αμυντική του τιμή (Σχήμα 1Β). Σε αυτή τη γραμμή, εξηγούμε τη θεωρία MT για να προβλέψουμε ότι η διέγερση θα οδηγήσει σε (i) μη κατευθυντικές αλλαγές στους μεταβολίτες με αποτέλεσμα τη μείωση του δείκτη δj και (ii) αύξηση του δείκτη Hj λόγω της αύξησης της μεταβολικής αβεβαιότητας. Ή τυχαιότητα, η οποία μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με την εντροπία Shannon με τη μορφή γενικευμένης ποικιλομορφίας. Όσον αφορά τη μεταβολική σύνθεση, η θεωρία MT θα προβλέψει την τυχαία κατανομή του Si. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ορισμένοι μεταβολίτες βρίσκονται υπό συγκεκριμένες συνθήκες και υπό συγκεκριμένες συνθήκες, ενώ άλλες συνθήκες δεν βρίσκονται υπό συγκεκριμένες συνθήκες, και η αμυντική τους αξία εξαρτάται από το περιβάλλον, προτείναμε επίσης ένα μικτό αμυντικό μοντέλο, στο οποίο τα δj και Hj κατανέμονται σε δύο κατά μήκος του Si. Αυξάνοντας προς όλες τις κατευθύνσεις, μόνο ορισμένες ομάδες μεταβολιτών, οι οποίες έχουν υψηλότερες αμυντικές τιμές, θα αυξήσουν ιδιαίτερα το Si, ενώ άλλες θα έχουν τυχαία κατανομή (Σχήμα 1Β).
Προκειμένου να ελεγχθεί η επαναπροσδιορισμένη πρόβλεψη της θεωρίας άμυνας στον άξονα του περιγραφέα της θεωρίας πληροφοριών, δημιουργήσαμε προνύμφες φυτοφάγων εμπειρογνωμόνων (Ms) ή γενικών (Sl) στα φύλλα του Nepenthes pallens (Σχήμα 2Α). Χρησιμοποιώντας ανάλυση MS/MS, ανακτήσαμε 599 μη πλεονάζοντα φάσματα MS/MS (αρχείο δεδομένων S1) από εκχυλίσματα μεθανόλης ιστού φύλλων που συλλέχθηκαν μετά τη σίτιση της κάμπιας. Η χρήση δεικτών RDPI, Hj και δj για την οπτικοποίηση της αναδιαμόρφωσης του περιεχομένου πληροφοριών στα αρχεία διαμόρφωσης MS/MS αποκαλύπτει ενδιαφέροντα μοτίβα (Σχήμα 2Β). Η συνολική τάση είναι ότι, όπως περιγράφεται από τον περιγραφέα πληροφοριών, καθώς οι κάμπιες συνεχίζουν να τρώνε φύλλα, ο βαθμός όλης της μεταβολικής αναδιοργάνωσης αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου: 72 ώρες μετά το φαγητό του φυτοφάγου, ο RDPI αυξάνεται σημαντικά. Σε σύγκριση με τον άθικτο έλεγχο, ο Hj μειώθηκε σημαντικά, γεγονός που οφειλόταν στον αυξημένο βαθμό εξειδίκευσης του μεταβολικού προφίλ, ο οποίος ποσοτικοποιήθηκε με τον δείκτη δj. Αυτή η φαινομενική τάση είναι σύμφωνη με τις προβλέψεις της θεωρίας OD, αλλά είναι ασυμβίβαστη με τις κύριες προβλέψεις της θεωρίας MT, η οποία πιστεύει ότι οι τυχαίες (μη κατευθυντικές) αλλαγές στα επίπεδα των μεταβολιτών χρησιμοποιούνται ως αμυντικό καμουφλάζ (Σχήμα 1Β). Αν και η περιεκτικότητα σε παράγοντες που προκαλούν στοματική έκκριση (OS) και η συμπεριφορά σίτισης αυτών των δύο φυτοφάγων είναι διαφορετικές, η άμεση σίτισή τους είχε ως αποτέλεσμα παρόμοιες αλλαγές στις κατευθύνσεις των Hj και δj κατά τη διάρκεια των 24ωρων και 72ωρων περιόδων συγκομιδής. Η μόνη διαφορά παρατηρήθηκε στις 72 ώρες RDPI. Σε σύγκριση με αυτήν που προκλήθηκε από τη σίτιση με Ms, ο συνολικός μεταβολισμός που προκλήθηκε από τη σίτιση με Sl ήταν υψηλότερος.
(Α) Πειραματικός σχεδιασμός: τα φυτοφάγα ζώα κοινού χοίρου (S1) ή εμπειρογνώμονα (Ms) τρέφονται με αφαλατωμένα φύλλα φυτών pitcher, ενώ για την προσομοιωμένη φυτοφάγα τροφή, το OS του Ms (W + OSMs) χρησιμοποιείται για τον χειρισμό της διάτρησης τυποποιημένων θέσεων φύλλων. S1 (W + OSSl) προνύμφες ή νερό (W + W). Ο έλεγχος (C) είναι ένα άθικτο φύλλο. (Β) Ο δείκτης επαγωγιμότητας (RDPI σε σύγκριση με το διάγραμμα ελέγχου), η ποικιλομορφία (δείκτης Hj) και η εξειδίκευση (δείκτης δj) υπολογίστηκαν για τον ειδικό χάρτη μεταβολιτών (599 MS/MS· αρχείο δεδομένων S1). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ της άμεσης διατροφής φυτοφάγων και της ομάδας ελέγχου (Student's t-test με ζευγαρωμένο t-test, *P<0,05 και ***P<0,001). ns, δεν είναι σημαντικό. (Γ) Δείκτης χρονικής ανάλυσης του κύριου (μπλε πλαίσιο, αμινοξύ, οργανικό οξύ και ζάχαρη· αρχείο δεδομένων S2) και του ειδικού φάσματος μεταβολιτών (κόκκινο πλαίσιο 443 MS/MS· αρχείο δεδομένων S1) μετά από προσομοιωμένη επεξεργασία φυτοφάγων. Η χρωματική ζώνη αναφέρεται στο διάστημα εμπιστοσύνης 95%. Ο αστερίσκος υποδεικνύει τη σημαντική διαφορά μεταξύ της επεξεργασίας και του ελέγχου [τετραγωνική ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από την πραγματικά σημαντική διαφορά Tukey (HSD) για πολλαπλές συγκρίσεις post hoc, *P<0,05, **P<0,01 και *** P <0,001]. (Δ) Εξειδίκευση διαγραμμάτων διασποράς και προφίλ ειδικών μεταβολιτών (επαναλαμβανόμενα δείγματα με διαφορετικές επεξεργασίες).
Για να διερευνήσουμε εάν η αναδιαμόρφωση που προκαλείται από φυτοφάγα ζώα σε επίπεδο μεταβολιτών αντικατοπτρίζεται στις αλλαγές στο επίπεδο των μεμονωμένων μεταβολιτών, εστιάσαμε αρχικά στους μεταβολίτες που είχαν μελετηθεί προηγουμένως στα φύλλα του Nepenthes pallens με αποδεδειγμένη αντοχή στα φυτοφάγα. Τα φαινολικά αμίδια είναι συζεύγματα υδροξυκινναμαμιδίου-πολυαμίνης που συσσωρεύονται κατά τη διάρκεια της φυτοφάγας διαδικασίας των εντόμων και είναι γνωστό ότι μειώνουν την απόδοση των εντόμων (32). Αναζητήσαμε τους προδρόμους των αντίστοιχων MS/MS και απεικονίσαμε τις αθροιστικές κινητικές τους καμπύλες (Σχήμα S1). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα παράγωγα φαινόλης που δεν εμπλέκονται άμεσα στην άμυνα έναντι των φυτοφάγων, όπως το χλωρογενικό οξύ (CGA) και η ρουτίνη, υπορυθμίζονται μετά τη φυτοφάγα. Αντίθετα, τα φυτοφάγα ζώα μπορούν να κάνουν τα φαινολαμίδια εξαιρετικά ισχυρά. Η συνεχής τροφοδοσία των δύο φυτοφάγων ζώων είχε ως αποτέλεσμα σχεδόν το ίδιο φάσμα διέγερσης των φαινολαμιδίων, και αυτό το μοτίβο ήταν ιδιαίτερα εμφανές για την de novo σύνθεση φαινολαμιδίων. Το ίδιο φαινόμενο θα παρατηρηθεί κατά την εξερεύνηση της οδού των 17-υδροξυγερανυλεννεανιοδιολικών διτερπενικών γλυκοζιτών (17-HGL-DTGs), η οποία παράγει μεγάλο αριθμό ακυκλικών διτερπενίων με αποτελεσματικές αντιφυτοφάγες λειτουργίες (33), εκ των οποίων η Ms Feeding με Sl πυροδότησε ένα παρόμοιο προφίλ έκφρασης (Σχήμα S1)).
Το πιθανό μειονέκτημα των πειραμάτων άμεσης σίτισης φυτοφάγων είναι η διαφορά στον ρυθμό κατανάλωσης φύλλων και στον χρόνο σίτισης των φυτοφάγων, γεγονός που καθιστά δύσκολη την εξάλειψη των ειδικών για τα φυτοφάγα επιδράσεων που προκαλούνται από τραύματα και φυτοφάγα. Προκειμένου να επιλυθεί καλύτερα η εξειδίκευση του είδους φυτοφάγων στην επαγόμενη μεταβολική απόκριση των φύλλων, προσομοιώσαμε τη σίτιση των προνυμφών Ms και Sl εφαρμόζοντας αμέσως το φρεσκοσυλλεγμένο OS (OSM και OSS1) στην τυπική παρακέντηση W σταθερών θέσεων φύλλων. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται επεξεργασία W + OS και τυποποιεί την επαγωγή χρονίζοντας με ακρίβεια την έναρξη της απόκρισης που προκαλείται από το φυτοφάγο χωρίς να προκαλεί συγχυτικές επιδράσεις διαφορών στον ρυθμό ή την ποσότητα απώλειας ιστού (Σχήμα 2Α) (34). Χρησιμοποιώντας την ανάλυση MS/MS και τον αγωγό υπολογισμού, ανακτήσαμε 443 φάσματα MS/MS (αρχείο δεδομένων S1), τα οποία επικαλύπτονταν με τα φάσματα που είχαν προηγουμένως συναρμολογηθεί από πειράματα άμεσης σίτισης. Η ανάλυση της θεωρίας πληροφοριών αυτού του συνόλου δεδομένων MS/MS έδειξε ότι ο επαναπρογραμματισμός των μεταβολωμάτων που είναι εξειδικευμένα στα φύλλα με προσομοίωση φυτοφάγων έδειξε επαγωγές ειδικές για το OS (Σχήμα 2C). Συγκεκριμένα, σε σύγκριση με τη θεραπεία με OSS1, η OSM προκάλεσε ενίσχυση της εξειδίκευσης του μεταβολώματος στις 4 ώρες. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε σύγκριση με το σύνολο πειραματικών δεδομένων άμεσης σίτισης φυτοφάγων, η μεταβολική κινητική απεικονίστηκε σε δισδιάστατο χώρο χρησιμοποιώντας Hj και δj ως συντεταγμένες και η κατευθυντικότητα της εξειδίκευσης του μεταβολώματος σε απόκριση στην προσομοιωμένη θεραπεία φυτοφάγων με την πάροδο του χρόνου αυξήθηκε σταθερά (Σχήμα 2D). Ταυτόχρονα, ποσοτικοποιήσαμε την περιεκτικότητα σε αμινοξέα, οργανικά οξέα και σάκχαρα (αρχείο δεδομένων S2) για να διερευνήσουμε εάν αυτή η στοχευμένη αύξηση στην εξειδίκευση του μεταβολώματος οφείλεται στην αναδιάταξη του κεντρικού μεταβολισμού του άνθρακα σε απόκριση σε προσομοιωμένα φυτοφάγα (Σχήμα S2). Για να εξηγήσουμε καλύτερα αυτό το μοτίβο, παρακολουθήσαμε περαιτέρω την κινητική μεταβολικής συσσώρευσης των προηγουμένως συζητημένων οδών φαινολαμίδης και 17-HGL-DTG. Η ειδική για το OS επαγωγή των φυτοφάγων μετασχηματίζεται σε ένα διαφορικό μοτίβο αναδιάταξης εντός του μεταβολισμού της φαινολαμίδης (Σχήμα S3). Τα φαινολικά αμίδια που περιέχουν κουμαρίνη και καφεοϋλικές ομάδες επάγονται κατά προτίμηση από το OSS1, ενώ τα OSM πυροδοτούν μια ειδική επαγωγή συζυγών φερουλυλίου. Για την οδό 17-HGL-DTG, ανιχνεύθηκε διαφορική επαγωγή OS με προϊόντα κατάντη μαλονυλίωσης και διμαλονυλίωσης (Σχήμα S3).
Στη συνέχεια, μελετήσαμε την πλαστικότητα του μεταγραφώματος που προκαλείται από το OS χρησιμοποιώντας το σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών χρονικής πορείας, το οποίο προσομοιώνει τη χρήση OSM για την επεξεργασία των φύλλων των φύλλων του φυτού ροζέτας σε φυτοφάγα. Η κινητική δειγματοληψίας ουσιαστικά επικαλύπτεται με την κινητική που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη μεταβολισμού (35). Σε σύγκριση με την αναδιαμόρφωση του μεταβολώματος στην οποία η μεταβολική πλαστικότητα αυξάνεται ιδιαίτερα με την πάροδο του χρόνου, παρατηρούμε παροδικές εκρήξεις μεταγραφής σε φύλλα που προκαλούνται από Ms, όπου η επαγωγιμότητα του μεταγραφώματος (RDPI) και η εξειδίκευση (δj) βρίσκονται στο 1. Υπήρξε σημαντική αύξηση στις ώρες και η ποικιλομορφία (Hj) σε αυτό το χρονικό σημείο, η έκφραση της BMP1 μειώθηκε σημαντικά, ακολουθούμενη από χαλάρωση της εξειδίκευσης του μεταγραφώματος (Σχήμα S4). Οι οικογένειες μεταβολικών γονιδίων (όπως η P450, η γλυκοζυλοτρανσφεράση και η ακυλοτρανσφεράση BAHD) συμμετέχουν στη διαδικασία συναρμολόγησης ειδικών μεταβολιτών από δομικές μονάδες που προέρχονται από πρωτογενή μεταβολισμό, ακολουθώντας το προαναφερθέν πρώιμο μοντέλο υψηλής εξειδίκευσης. Ως μελέτη περίπτωσης, αναλύθηκε η οδός φαινυλαλανίνης. Η ανάλυση επιβεβαίωσε ότι τα βασικά γονίδια στον μεταβολισμό της φαινολαμίδης επάγονται σε μεγάλο βαθμό από το OS στα φυτοφάγα σε σύγκριση με τα φυτά που δεν προσελκύονται και είναι στενά ευθυγραμμισμένα στα πρότυπα έκφρασής τους. Ο μεταγραφικός παράγοντας MYB8 και τα δομικά γονίδια PAL1, PAL2, C4H και 4CL στην ανοδική ροή αυτής της οδού έδειξαν πρώιμη έναρξη της μεταγραφής. Οι ακυλτρανσφεράσες που παίζουν ρόλο στην τελική συναρμολόγηση της φαινολαμίδης, όπως οι AT1, DH29 και CV86, εμφανίζουν ένα παρατεταμένο πρότυπο ανοδικής ρύθμισης (Σχήμα S4). Οι παραπάνω παρατηρήσεις δείχνουν ότι η πρώιμη έναρξη της εξειδίκευσης του μεταγραφώματος και η μεταγενέστερη ενίσχυση της εξειδίκευσης της μεταβολομικής είναι ένας συζευγμένος τρόπος, ο οποίος μπορεί να οφείλεται στο σύγχρονο ρυθμιστικό σύστημα που ξεκινά μια ισχυρή αμυντική απόκριση.
Η αναδιαμόρφωση της σηματοδότησης των φυτικών ορμονών λειτουργεί ως ρυθμιστικό στρώμα που ενσωματώνει πληροφορίες φυτοφάγων για τον επαναπρογραμματισμό της φυσιολογίας των φυτών. Μετά την προσομοίωση των φυτοφάγων, μετρήσαμε τη σωρευτική δυναμική βασικών κατηγοριών φυτικών ορμονών και απεικονίσαμε τη χρονική συνέκφραση μεταξύ τους [συντελεστής συσχέτισης Pearson (PCC)> 0,4] (Σχήμα 3Α). Όπως αναμενόταν, οι φυτικές ορμόνες που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση συνδέονται εντός του δικτύου συνέκφρασης φυτικών ορμονών. Επιπλέον, η μεταβολική εξειδίκευση (δείκτης Si) αντιστοιχίζεται σε αυτό το δίκτυο για να επισημανθούν οι φυτικές ορμόνες που προκαλούνται από διαφορετικές θεραπείες. Σχεδιάζονται δύο κύριες περιοχές ειδικής απόκρισης των φυτοφάγων: η μία βρίσκεται στο σύμπλεγμα JA, όπου η JA (η βιολογικά ενεργή μορφή της JA-Ile) και άλλα παράγωγα JA παρουσιάζουν την υψηλότερη βαθμολογία Si. η άλλη είναι το αιθυλένιο (ET). Η γιβερελίνη έδειξε μόνο μέτρια αύξηση στην εξειδίκευση των φυτοφάγων, ενώ άλλες φυτικές ορμόνες, όπως η κυτοκινίνη, η αυξίνη και το αμπσισικό οξύ, είχαν χαμηλή εξειδίκευση επαγωγής για τα φυτοφάγα. Σε σύγκριση με τη χρήση μόνο του W + W, η ενίσχυση της μέγιστης τιμής των παραγώγων JA μέσω της εφαρμογής OS (W + OS) μπορεί ουσιαστικά να μετατραπεί σε έναν ισχυρό ειδικό δείκτη των JAs. Απροσδόκητα, τα OSM και OSS1 με διαφορετικό περιεχόμενο διεγέρτη είναι γνωστό ότι προκαλούν παρόμοια συσσώρευση JA και JA-Ile. Σε αντίθεση με το OSS1, το OSM προκαλείται ειδικά και έντονα από τα OSMs, ενώ το OSS1 δεν ενισχύει την απόκριση των βασικών τραυμάτων (Σχήμα 3Β).
(Α) Ανάλυση δικτύου συν-έκφρασης βασισμένη στον υπολογισμό PCC της προσομοίωσης κινητικής συσσώρευσης φυτικών ορμονών που προκαλείται από φυτοφάγα. Ο κόμβος αντιπροσωπεύει μία μόνο φυτική ορμόνη και το μέγεθος του κόμβου αντιπροσωπεύει τον δείκτη Si που είναι ειδικός για την φυτική ορμόνη μεταξύ των θεραπειών. (Β) Συσσώρευση JA, JA-Ile και ET σε φύλλα που προκαλείται από διαφορετικές θεραπεύσεις που υποδεικνύονται από διαφορετικά χρώματα: βερίκοκο, W + OSM· μπλε, W + OSSl· μαύρο, W + W· γκρι, C (μάρτυρας). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ θεραπείας και μάρτυρα (αμφίδρομη ANOVA ακολουθούμενη από πολλαπλή σύγκριση Tukey HSD post hoc, *** P <0,001). Ανάλυση θεωρίας πληροφοριών του (C)697 MS/MS (αρχείο δεδομένων S1) στη βιοσύνθεση JA και στο φάσμα μειωμένης αντίληψης (irAOC και irCOI1) και (D)585 MS/MS (αρχείο δεδομένων S1) στο ETR1 με μειωμένο σήμα ET. Δύο προσομοιωμένες θεραπεύσεις φυτοφάγων πυροδότησαν φυτικές γραμμές και φυτά ελέγχου με κενό όχημα (EV). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ της θεραπείας με W+OS και του μη κατεστραμμένου μάρτυρα (αμφίδρομη ANOVA ακολουθούμενη από πολλαπλή σύγκριση Tukey HSD post hoc, *P<0,05, **P<0,01 και ***P<0,001). (E) Διάσπαρτα γραφήματα διάσπαρτης αντίθεσης στην εξειδίκευση. Τα χρώματα αντιπροσωπεύουν διαφορετικά γενετικά τροποποιημένα στελέχη. τα σύμβολα αντιπροσωπεύουν διαφορετικές μεθόδους θεραπείας: τρίγωνο, W + OSS1· ορθογώνιο, W + OSM· κύκλος C
Στη συνέχεια, χρησιμοποιούμε ένα γενετικά τροποποιημένο στέλεχος εξασθενημένων Νηπενθών (irCOI1 και sETR1) στα βασικά στάδια της βιοσύνθεσης JA και ET (irAOC και irACO) και της αντίληψης (irCOI1 και sETR1) για να αναλύσουμε τον μεταβολισμό αυτών των δύο φυτικών ορμονών στα φυτοφάγα. Η σχετική συμβολή του επαναπρογραμματισμού. Σε συμφωνία με προηγούμενα πειράματα, επιβεβαιώσαμε την επαγωγή φυτοφάγων-OS σε φυτά κενού φορέα (EV) (Σχήμα 3, C έως D) και τη συνολική μείωση του δείκτη Hj που προκαλείται από το OSM, ενώ ο δείκτης δj αυξήθηκε. Η απόκριση είναι πιο έντονη από την απόκριση που πυροδοτείται από το OSS1. Ένα γράφημα δύο γραμμών που χρησιμοποιεί Hj και δj ως συντεταγμένες δείχνει την ειδική απορρύθμιση (Σχήμα 3Ε). Η πιο προφανής τάση είναι ότι σε στελέχη που δεν διαθέτουν σήμα JA, οι αλλαγές στην ποικιλομορφία και την εξειδίκευση του μεταβολισμού που προκαλούνται από τα φυτοφάγα εξαλείφονται σχεδόν πλήρως (Σχήμα 3C). Αντίθετα, η σιωπηλή αντίληψη ET σε φυτά sETR1, αν και η συνολική επίδραση στις αλλαγές στον μεταβολισμό των φυτοφάγων είναι πολύ χαμηλότερη από αυτή της σηματοδότησης JA, εξασθενεί τη διαφορά στους δείκτες Hj και δj μεταξύ των διεγέρσεων OSM και OSS1 (Σχήμα 3D και Σχήμα S5). . Αυτό δείχνει ότι εκτός από την βασική λειτουργία της μεταγωγής σήματος JA, η μεταγωγή σήματος ET χρησιμεύει επίσης ως μια λεπτομερής ρύθμιση της μεταβολικής απόκρισης των φυτοφάγων που είναι ειδική για κάθε είδος. Σύμφωνα με αυτή τη λειτουργία λεπτομερούς ρύθμισης, δεν υπήρξε καμία αλλαγή στη συνολική επαγωγιμότητα του μεταβολώματος στα φυτά sETR1. Από την άλλη πλευρά, σε σύγκριση με τα φυτά sETR1, τα φυτά irACO προκάλεσαν παρόμοια συνολικά πλάτη μεταβολικών αλλαγών που προκαλούνται από φυτοφάγα, αλλά έδειξαν σημαντικά διαφορετικές βαθμολογίες Hj και δj μεταξύ των προκλήσεων OSM και OSS1 (Σχήμα S5).
Προκειμένου να εντοπίσουμε εξειδικευμένους μεταβολίτες που έχουν σημαντική συμβολή στην ειδική για κάθε είδος απόκριση των φυτοφάγων και να βελτιώσουμε την παραγωγή τους μέσω σημάτων ET, χρησιμοποιήσαμε την προηγουμένως αναπτυγμένη δομική μέθοδο MS/MS. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στη μέθοδο διπλής ομαδοποίησης για να επαναπροσδιορίσει την μεταβολική οικογένεια από θραύσματα MS/MS [κανονικοποιημένο γινόμενο κουκκίδων (NDP)] και βαθμολογία ομοιότητας με βάση την ουδέτερη απώλεια (NL). Το σύνολο δεδομένων MS/MS που κατασκευάστηκε μέσω της ανάλυσης των διαγονιδιακών γραμμών ET παρήγαγε 585 MS/MS (αρχείο δεδομένων S1), τα οποία επιλύθηκαν ομαδοποιώντας τα σε επτά κύριες ενότητες MS/MS (M) (Σχήμα 4Α). Ορισμένες από αυτές τις ενότητες είναι πυκνά συσκευασμένες με προηγουμένως χαρακτηρισμένους ειδικούς μεταβολίτες: για παράδειγμα, οι M1, M2, M3, M4 και M7 είναι πλούσιες σε διάφορα παράγωγα φαινόλης (M1), φλαβονοειδή γλυκοσίδια (M2), ακυλοσακχαρίδια (M3 και M4) και 17-HGL-DTG (M7). Επιπλέον, υπολογίζονται οι μεταβολικές ειδικές πληροφορίες (δείκτης Si) ενός μεμονωμένου μεταβολίτη σε κάθε ενότητα και η κατανομή Si του μπορεί να φανεί διαισθητικά. Εν ολίγοις, τα φάσματα MS/MS που παρουσιάζουν υψηλή φυτοφαγική και γονοτυπική εξειδίκευση χαρακτηρίζονται από υψηλές τιμές Si και τα στατιστικά στοιχεία κύρτωσης υποδεικνύουν την κατανομή της γούνας στη δεξιά ουρά. Μία τέτοια κατανομή άπαχου κολλοειδούς ανιχνεύθηκε στο M1, στο οποίο το φαινολοαμίδιο έδειξε το υψηλότερο κλάσμα Si (Σχήμα 4Β). Το προαναφερθέν φυτοφάγο επαγώγιμο 17-HGL-DTG στο M7 έδειξε μέτρια βαθμολογία Si, υποδεικνύοντας μέτριο βαθμό διαφορικής ρύθμισης μεταξύ των δύο τύπων OS. Αντίθετα, οι περισσότεροι συστατικά παραγόμενοι εξειδικευμένοι μεταβολίτες, όπως η ρουτίνη, το CGA και τα ακυλο σάκχαρα, είναι από τις χαμηλότερες βαθμολογίες Si. Προκειμένου να διερευνηθεί καλύτερα η δομική πολυπλοκότητα και η κατανομή Si μεταξύ ειδικών μεταβολιτών, κατασκευάστηκε ένα μοριακό δίκτυο για κάθε ενότητα (Σχήμα 4Β). Μια σημαντική πρόβλεψη της θεωρίας OD (που συνοψίζεται στο Σχήμα 1Β) είναι ότι η αναδιοργάνωση ειδικών μεταβολιτών μετά την φυτοφάγα θα πρέπει να οδηγήσει σε μονόδρομες αλλαγές στους μεταβολίτες με υψηλή αμυντική αξία, ειδικά αυξάνοντας την εξειδίκευσή τους (σε αντίθεση με την τυχαία κατανομή) (Mode) Αμυντικός μεταβολίτης που προβλέπεται από τη θεωρία MT. Τα περισσότερα από τα παράγωγα φαινόλης που συσσωρεύονται στο M1 σχετίζονται λειτουργικά με τη μείωση της απόδοσης των εντόμων (32). Κατά τη σύγκριση των τιμών Si στους μεταβολίτες M1 μεταξύ των επαγόμενων φύλλων και των συστατικών φύλλων των φυτών ελέγχου EV στις 24 ώρες, παρατηρήσαμε ότι η μεταβολική εξειδίκευση πολλών μεταβολιτών μετά από φυτοφάγα έντομα έχει μια σημαντική αυξητική τάση (Σχήμα 4C). Η ειδική αύξηση στην τιμή Si ανιχνεύθηκε μόνο στις αμυντικές φαινολαμίδες, αλλά δεν ανιχνεύθηκε αύξηση στην τιμή Si σε άλλες φαινόλες και άγνωστους μεταβολίτες που συνυπάρχουν σε αυτήν την ενότητα. Πρόκειται για ένα εξειδικευμένο μοντέλο, το οποίο σχετίζεται με τη θεωρία OD. Οι κύριες προβλέψεις των μεταβολικών αλλαγών που προκαλούνται από τα φυτοφάγα είναι συνεπείς. Προκειμένου να ελεγχθεί εάν αυτή η ιδιαιτερότητα του φάσματος φαινολαμιδίου προκλήθηκε από την ειδική για το OS ET, απεικονίσαμε τον δείκτη μεταβολίτη Si και προκαλέσαμε μια διαφορική τιμή έκφρασης μεταξύ OSM και OSS1 στους γονότυπους EV και sETR1 (Σχήμα 4D). Στο sETR1, η διαφορά μεταξύ OSM και OSS1 που προκλήθηκε από το φαιναμίδιο μειώθηκε σημαντικά. Η μέθοδος διπλής ομαδοποίησης εφαρμόστηκε επίσης σε δεδομένα MS/MS που συλλέχθηκαν σε στελέχη με ανεπαρκή JA για να συναχθούν οι κύριες ενότητες MS/MS που σχετίζονται με την εξειδίκευση του μεταβολισμού που ρυθμίζεται από JA (Σχήμα S6).
(Α) Τα αποτελέσματα ομαδοποίησης 585 MS/MS με βάση το κοινό θραύσμα (ομοιότητα NDP) και την κοινή ουδέτερη απώλεια (ομοιότητα NL) έχουν ως αποτέλεσμα η ενότητα (M) να είναι συμβατή με την γνωστή οικογένεια ενώσεων ή με άγνωστη ή κακώς μεταβολιζόμενη σύνθεση μεταβολιτών. Δίπλα σε κάθε ενότητα, εμφανίζεται η ειδική κατανομή (Si) του μεταβολίτη (MS/MS). (Β) Μοριακό δίκτυο αρθρωτών: Οι κόμβοι αντιπροσωπεύουν MS/MS και ακμές, βαθμολογίες MS/MS NDP (κόκκινο) και NL (μπλε) (αποκοπή, > 0,6). Ο βαθμολογημένος δείκτης εξειδίκευσης μεταβολίτη (Si) χρωματισμένος με βάση την ενότητα (αριστερά) και χαρτογραφημένος στο μοριακό δίκτυο (δεξιά). (Γ) Ενότητα M1 του φυτού EV σε συστατική (έλεγχος) και επαγόμενη κατάσταση (προσομοιωμένο φυτοφάγο) στις 24 ώρες: διάγραμμα μοριακού δικτύου (η τιμή Si είναι το μέγεθος του κόμβου, η αμυντική φαινολαμίδη επισημαίνεται με μπλε χρώμα). (Δ) Το διάγραμμα μοριακού δικτύου M1 της φασματικής γραμμής sETR1 με μειωμένη αντίληψη EV και ET: η φαινολική ένωση που αντιπροσωπεύεται από τον πράσινο κυκλικό κόμβο και η σημαντική διαφορά (τιμή P) μεταξύ των θεραπειών W + OSM και W + OSS1 ως μέγεθος κόμβου. CP, Ν-καφεοϋλ-τυροσίνη· CS, Ν-καφεοϋλ-σπερμιδίνη· FP, εστέρας Ν-φερουλικού οξέος-ουρικό οξύ· FS, Ν-φερουλυλ-σπερμιδίνη· CoP, Ν', Ν “-κουμαρολυλο-τυροσίνη· DCS, Ν', Ν”-δικαφεοϋλ-σπερμιδίνη· CFS, Ν', Ν”-καφεοϋλ, φερουλοϋλ-σπερμιδίνη· Lycium barbarum σε wolfberry Son· Nick. Ο-AS, Ο-ακυλ σάκχαρο.
Επεκτείναμε περαιτέρω την ανάλυση από έναν μόνο εξασθενημένο γονότυπο Nepenthes σε φυσικούς πληθυσμούς, όπου έχουν περιγραφεί προηγουμένως σε φυσικούς πληθυσμούς ισχυρές ενδοειδικές αλλαγές στα επίπεδα φυτοφάγων JA και στα επίπεδα συγκεκριμένων μεταβολιτών (26). Χρησιμοποιήστε αυτό το σύνολο δεδομένων για να καλύψετε 43 γενετικά πλάσματα. Αυτά τα γενετικά πλάσματα αποτελούνται από 123 είδη φυτών από το N. pallens. Αυτά τα φυτά ελήφθησαν από σπόρους που συλλέχθηκαν σε διαφορετικά αυτοφυή ενδιαιτήματα στη Γιούτα, τη Νεβάδα, την Αριζόνα και την Καλιφόρνια (Σχήμα S7), υπολογίσαμε την ποικιλομορφία μεταβολισμού (εδώ ονομάζεται επίπεδο πληθυσμού) (β ποικιλομορφία) και την εξειδίκευση που προκαλείται από την OSM. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, παρατηρήσαμε ένα ευρύ φάσμα μεταβολικών αλλαγών κατά μήκος των αξόνων Hj και δj, υποδεικνύοντας ότι τα γενετικά πλάσματα έχουν σημαντικές διαφορές στην πλαστικότητα των μεταβολικών τους αποκρίσεων στα φυτοφάγα (Σχήμα S7). Αυτή η οργάνωση θυμίζει προηγούμενες παρατηρήσεις σχετικά με το δυναμικό εύρος των αλλαγών των JAs που προκαλούνται από τα φυτοφάγα και έχει διατηρήσει μια πολύ υψηλή τιμή σε έναν μόνο πληθυσμό (26, 36). Χρησιμοποιώντας τα JA και JA-Ile για να ελέγξουμε τη συνολική συσχέτιση επιπέδου μεταξύ Hj και δj, διαπιστώσαμε ότι υπάρχει μια σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ του JA και του δείκτη ποικιλομορφίας και εξειδίκευσης του μεταβολώματος β (Σχήμα S7). Αυτό υποδηλώνει ότι η ετερογένεια που προκαλείται από φυτοφάγα στην επαγωγή JAs που ανιχνεύεται σε επίπεδο πληθυσμού μπορεί να οφείλεται σε βασικούς μεταβολικούς πολυμορφισμούς που προκαλούνται από την επιλογή από φυτοφάγα έντομα.
Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι τύποι καπνού διαφέρουν σημαντικά ως προς τον τύπο και τη σχετική εξάρτηση από τις επαγόμενες και συστατικές μεταβολικές άμυνες. Πιστεύεται ότι αυτές οι αλλαγές στη μεταγωγή σήματος κατά των φυτοφάγων και στις αμυντικές ικανότητες ρυθμίζονται από την πίεση του πληθυσμού των εντόμων, τον κύκλο ζωής των φυτών και το κόστος παραγωγής άμυνας στην περιοχή όπου αναπτύσσεται ένα δεδομένο είδος. Μελετήσαμε τη συνέπεια της αναδιαμόρφωσης του μεταβολισμού των φύλλων που προκαλείται από τα φυτοφάγα έξι ειδών Nicotiana που προέρχονται από τη Βόρεια και τη Νότια Αμερική. Αυτά τα είδη είναι στενά συνδεδεμένα με τα Nepenthes της Βόρειας Αμερικής, δηλαδή τα Nicoli Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, γραμμικός καπνός, καπνός (Nicotiana spegazzinii) και καπνός σε φύλλα καπνού (Nicotiana obtusifolia) (Σχήμα 5Α) (37). Έξι από αυτά τα είδη, συμπεριλαμβανομένου του καλά χαρακτηρισμένου είδους N. please, είναι ετήσια φυτά της ομάδας petunia, και τα obtusifolia N. είναι πολυετή φυτά της αδελφής ομάδας Trigonophyllae (38). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε επαγωγή W + W, W + OSM και W + OSS1 σε αυτά τα επτά είδη για να μελετηθεί η μεταβολική αναδιάταξη της σίτισης των εντόμων σε επίπεδο είδους.
(Α) Ένα φυλογενετικό δέντρο bootstrap βασισμένο στη μέγιστη πιθανοφάνεια [για σύνθεση πυρηνικής γλουταμίνης (38)] και τη γεωγραφική κατανομή επτά στενά συγγενικών ειδών Nicotiana (διαφορετικά χρώματα) (37). (Β) Ένα διάγραμμα διασποράς εξειδικευμένης ποικιλομορφίας για τα μεταβολικά προφίλ επτά ειδών Nicotiana (939 MS/MS· αρχείο δεδομένων S1). Σε επίπεδο είδους, η ποικιλομορφία μεταβολιτών συσχετίζεται αρνητικά με τον βαθμό εξειδίκευσης. Η ανάλυση της συσχέτισης σε επίπεδο είδους μεταξύ της μεταβολικής ποικιλομορφίας και της εξειδίκευσης και της συσσώρευσης JA φαίνεται στο Σχήμα 2. S9. Χρώμα, διαφορετικοί τύποι· τρίγωνο, W + OSS1· ορθογώνιο, W + OSM· (Γ) Η δυναμική JA και JA-Ile της Nicotiana κατατάσσεται σύμφωνα με το πλάτος διέγερσης OS (αμφίδρομη ANOVA και Tukey HSD μετά από πολλαπλή σύγκριση, * P <0,05, ** P <0,01 και * ** Για σύγκριση των W + OS και W + W, P <0,001). Πλαίσιο-διάγραμμα (D) ποικιλομορφίας και (E) εξειδίκευσης κάθε είδους μετά την προσομοίωση φυτοφάγων και μεθυλο-JA (MeJA). Ο αστερίσκος υποδεικνύει τη σημαντική διαφορά μεταξύ W + OS και W + W ή λανολίνης συν W (Lan + W) ή Lan συν MeJA (Lan + MeJa) και ελέγχου Lan (αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης, ακολουθούμενη από πολλαπλή σύγκριση Tukey's HSD post hoc, *P<0,05, **P<0,01 και ***P<0,001).
Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο διπλής συστάδας, εντοπίσαμε 9 ενότητες από 939 MS/MS (αρχείο δεδομένων S1). Η σύνθεση των MS/MS που αναδιαμορφώθηκαν με διαφορετικές επεξεργασίες ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των διαφορετικών ενοτήτων μεταξύ των ειδών (Σχήμα S8). Η οπτικοποίηση των Hj (που αναφέρεται εδώ ως γ-ποικιλότητα σε επίπεδο είδους) και δj αποκαλύπτει ότι διαφορετικά είδη συσσωματώνονται σε πολύ διαφορετικές ομάδες στον μεταβολικό χώρο, όπου η διαίρεση σε επίπεδο είδους είναι συνήθως πιο εμφανής από τη διέγερση. Με εξαίρεση τα N. linear και N. obliquus, εμφανίζουν ένα ευρύ δυναμικό εύρος επαγωγικών επιδράσεων (Σχήμα 5Β). Αντίθετα, είδη όπως τα N. purpurea και N. obtusifolia έχουν λιγότερο εμφανή μεταβολική απόκριση στη θεραπεία, αλλά το μεταβολόγραμμα είναι πιο ποικιλόμορφο. Η κατανομή της επαγόμενης μεταβολικής απόκρισης ανά είδος είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ εξειδίκευσης και γάμμα ποικιλομορφίας (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Οι αλλαγές στα επίπεδα των JAs που προκαλούνται από την OS συσχετίζονται θετικά με την εξειδίκευση του μεταβολώματος και αρνητικά με την μεταβολική γάμμα ποικιλομορφία που επιδεικνύει κάθε είδος (Σχήμα 5Β και Σχήμα S9). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα είδη που αναφέρονται καθομιλούμενα ως είδη «απόκρισης σήματος» στο Σχήμα 5C, όπως τα Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute και Nepenthes attenuated, προκάλεσαν σημαντικά σημάδια στα 30 λεπτά. Οι πρόσφατες εξάρσεις JA και JA-Ile που είναι ειδικές για την OS, ενώ άλλα βακτήρια που ονομάζονται «μη ανταποκρινόμενα στο σήμα», όπως τα Nepenthes mills, Nepenthes powdery και N. obtusifolia, εμφανίζουν μόνο επαγωγή JA-Ile Edge χωρίς καμία ειδικότητα για την OS (Σχήμα 5C). Σε μεταβολικό επίπεδο, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, για τα εξασθενημένα Nepenthes, οι ουσίες που ανταποκρίνονται στο σήμα έδειξαν ειδικότητα για την OS και αύξησαν σημαντικά το δj, μειώνοντας παράλληλα την Hj. Αυτό το ειδικό για το OS φαινόμενο εκκίνησης δεν ανιχνεύθηκε σε είδη που ταξινομούνται ως είδη που δεν αντιδρούν στο σήμα (Σχήμα 5, D και E). Οι ειδικοί για το OS μεταβολίτες μοιράζονται συχνότερα μεταξύ ειδών που ανταποκρίνονται στο σήμα και αυτές οι συστάδες σήματος συσσωρεύονται με είδη με ασθενέστερες αποκρίσεις σήματος, ενώ είδη με ασθενέστερες αποκρίσεις σήματος εμφανίζουν λιγότερη αλληλεξάρτηση (Σχήμα S8). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η ειδική για το OS επαγωγή των JAs και η ειδική για το OS αναδιαμόρφωση του κατάντη μεταβολικού συλλόγου συνδέονται σε επίπεδο είδους.
Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε μια πάστα λανολίνης που περιείχε μεθυλο-JA (MeJA) για την επεξεργασία φυτών, ώστε να διερευνήσουμε εάν αυτοί οι τρόποι σύζευξης περιορίζονται από τη διαθεσιμότητα του JA που εφαρμόζεται από εξωγενή JA, η οποία θα βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των φυτών. Η ταχεία αποεστεροποίηση είναι η JA. Διαπιστώσαμε την ίδια τάση σταδιακής αλλαγής από είδη που ανταποκρίνονται στο σήμα σε είδη που δεν ανταποκρίνονται στο σήμα, η οποία προκαλείται από τη συνεχή παροχή JA (Σχήμα 5, D και E). Εν ολίγοις, η επεξεργασία με MeJA επαναπρογραμμάτισε έντονα τα μεταβολώματα των γραμμικών νηματωδών, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens και N. mikimotoi, με αποτέλεσμα σημαντική αύξηση του δj και μείωση του Hj. Το N. purpurea έδειξε μόνο αύξηση του δj, αλλά όχι του Hj. Το N. obtusifolia, το οποίο έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι συσσωρεύει εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα JA, ανταποκρίνεται επίσης ανεπαρκώς στην επεξεργασία με MeJA όσον αφορά την αναδιαμόρφωση του μεταβολώματος. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η παραγωγή JA ή η μεταγωγή σήματος περιορίζεται φυσιολογικά σε είδη που δεν ανταποκρίνονται στο σήμα. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, μελετήσαμε τα τέσσερα είδη (N. pallens, N. mills, N. pink και N. microphylla) που επάγονται από W + W, W + OSMs και W + OSS1 Transcriptome (39). Σύμφωνα με το πρότυπο αναδιαμόρφωσης του μεταβολώματος, τα είδη είναι καλά διαχωρισμένα στον χώρο του μεταγραφώματος, μεταξύ των οποίων το N. attenuated έδειξε τον υψηλότερο RDPI που προκαλείται από το OS, ενώ το N. gracilis είχε τον χαμηλότερο (Σχήμα 6Α). Ωστόσο, διαπιστώθηκε ότι η ποικιλομορφία του μεταγραφώματος που προκαλείται από το N. oblonga ήταν η χαμηλότερη μεταξύ των τεσσάρων ειδών, σε αντίθεση με την υψηλότερη μεταβιονομική ποικιλομορφία του N. oblonga που είχε προηγουμένως δειχθεί σε επτά είδη. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ένα σύνολο γονιδίων που σχετίζονται με πρώιμα αμυντικά σήματα, συμπεριλαμβανομένων των σημάτων JA, εξηγεί την εξειδίκευση των πρώιμων αμυντικών αποκρίσεων που προκαλούνται από διεγέρτες που σχετίζονται με φυτοφάγα ζώα στα είδη Nicotiana (39). Η σύγκριση των σηματοδοτικών οδών JA μεταξύ αυτών των τεσσάρων ειδών αποκάλυψε ένα ενδιαφέρον πρότυπο (Σχήμα 6Β). Τα περισσότερα γονίδια σε αυτήν την οδό, όπως τα AOC, OPR3, ACX και COI1, έδειξαν σχετικά υψηλά επίπεδα επαγωγής σε αυτά τα τέσσερα είδη. Ωστόσο, ένα βασικό γονίδιο, το JAR4, μετατρέπει το JA στη βιολογικά ενεργή μορφή των συσσωρευμένων μεταγραφών JA-Ile, και το επίπεδο μεταγραφής του είναι πολύ χαμηλό, ειδικά στα N. mills, Nepenthes pieris και N. microphylla. Επιπλέον, μόνο το μεταγράφημα ενός άλλου γονιδίου, του AOS, δεν ανιχνεύθηκε στο N. bifidum. Αυτές οι αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση μπορεί να ευθύνονται για τους ακραίους φαινοτύπους που προκαλούνται από τη χαμηλή παραγωγή JA σε είδη που δεν παράγουν σήματα και την επαγωγή του N. gracilis.
(Α) Ανάλυση θεωρίας πληροφοριών για τον επαναπρογραμματισμό των πρώιμων μεταγραφικών αποκρίσεων τεσσάρων στενά συγγενικών ειδών καπνού που ελήφθησαν 30 λεπτά μετά την επαγωγή φυτοφάγων. Ο RDPI υπολογίζεται συγκρίνοντας τα φύλλα που προκλήθηκαν από το φυτοφάγο OS με το μάρτυρα τραύματος. Τα χρώματα υποδεικνύουν διαφορετικά είδη και τα σύμβολα υποδεικνύουν διαφορετικές μεθόδους θεραπείας. (Β) Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε σηματοδοτικές οδούς JA μεταξύ τεσσάρων ειδών. Η απλοποιημένη διαδρομή JA εμφανίζεται δίπλα στο διάγραμμα πλαισίου. Διαφορετικά χρώματα υποδεικνύουν διαφορετικές μεθόδους επεξεργασίας. Ο αστερίσκος υποδεικνύει ότι υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ της θεραπείας με W + OS και του μάρτυρα W + W (για το t-test του Student για ζευγαρωτές διαφορές, *P<0,05, **P<0,01 και ***P<0,001). OPDA, 12-οξοφυτοδιενοϊκό οξύ; OPC-8: 0,3-οξο-2(2′(Z)-πεντενυλ)-κυκλοπενταν-1-οκτανοϊκό οξύ.
Στο τελευταίο μέρος, μελετήσαμε πώς η αναδιαμόρφωση του μεταβολισμού διαφορετικών φυτικών ειδών ανά είδος εντόμου μπορεί να είναι ανθεκτική στα φυτοφάγα. Προηγούμενη έρευνα έδωσε έμφαση στο γένος Nicotiana. Η αντοχή τους στο Ms και στις προνύμφες διαφέρει σημαντικά (40). Εδώ, μελετήσαμε τη σύνδεση μεταξύ αυτού του μοντέλου και της μεταβολικής τους πλαστικότητας. Χρησιμοποιώντας τα παραπάνω τέσσερα είδη καπνού και ελέγχοντας τη συσχέτιση μεταξύ της ποικιλομορφίας και της εξειδίκευσης του μεταβολισμού που προκαλείται από τα φυτοφάγα και της αντοχής των φυτών στο Ms και το Sl, διαπιστώσαμε ότι η αντοχή, η ποικιλομορφία και η εξειδίκευση στο γενικευμένο SlAll συσχετίζονται θετικά, ενώ η συσχέτιση μεταξύ της αντοχής στις έμπειρες γυναίκες και της εξειδίκευσης είναι ασθενής και η συσχέτιση με την ποικιλομορφία δεν είναι σημαντική (Σχήμα S10). Όσον αφορά την αντοχή στο S1, τόσο το εξασθενημένο N. chinensis όσο και το N. gracilis, τα οποία προηγουμένως είχαν δείξει ότι εμφάνιζαν τόσο επίπεδα μεταγωγής σήματος JA όσο και πλαστικότητα του μεταβολισμού, είχαν πολύ διαφορετικές αντιδράσεις στην επαγωγή από φυτοφάγα και έδειξαν επίσης παρόμοια υψηλή αντοχή. Φύλο.
Τα τελευταία εξήντα χρόνια, η θεωρία άμυνας των φυτών έχει παράσχει ένα θεωρητικό πλαίσιο, βάσει του οποίου οι ερευνητές έχουν προβλέψει έναν σημαντικό αριθμό εξέλιξης και λειτουργιών εξειδικευμένων μεταβολιτών των φυτών. Οι περισσότερες από αυτές τις θεωρίες δεν ακολουθούν τη συνήθη διαδικασία ισχυρών συμπερασμάτων (41). Προτείνουν βασικές προβλέψεις (3) στο ίδιο επίπεδο ανάλυσης. Όταν ο έλεγχος βασικών προβλέψεων επιτρέπει την ανάλυση συγκεκριμένων θεωριών, αυτό θα κάνει το πεδίο να προχωρά. Υποστηρίζεται, αλλά να απορρίπτει άλλες (42). Αντ' αυτού, η νέα θεωρία κάνει προβλέψεις σε διαφορετικά επίπεδα ανάλυσης και προσθέτει ένα νέο επίπεδο περιγραφικών σκέψεων (42). Ωστόσο, οι δύο θεωρίες που προτείνονται σε λειτουργικό επίπεδο, η ΜΤ και η Οϋ, μπορούν εύκολα να εξηγηθούν ως σημαντικές προβλέψεις εξειδικευμένων μεταβολικών αλλαγών που προκαλούνται από φυτοφάγα ζώα: Η θεωρία Οϋ πιστεύει ότι οι αλλαγές στον εξειδικευμένο μεταβολικό «χώρο» είναι εξαιρετικά κατευθυντικές. Η θεωρία ΜΤ πιστεύει ότι αυτές οι αλλαγές θα είναι μη κατευθυντικές και θα βρίσκονται τυχαία στον μεταβολικό χώρο και τείνουν να έχουν μεταβολίτες υψηλής αμυντικής αξίας. Προηγούμενες εξετάσεις των προβλέψεων Οϋ και ΜΤ έχουν ελεγχθεί χρησιμοποιώντας ένα στενό σύνολο a priori «αμυντικών» ενώσεων. Αυτές οι δοκιμές που επικεντρώνονται στους μεταβολίτες αποκλείουν την ικανότητα ανάλυσης της έκτασης και της τροχιάς της αναδιαμόρφωσης του μεταβολισμού κατά τη διάρκεια της φυτοφάγας ζωής και δεν επιτρέπουν στις δοκιμές εντός ενός συνεπούς στατιστικού πλαισίου να απαιτούν βασικές προβλέψεις που μπορούν να θεωρηθούν ως σύνολο. Ποσοτικοποιήστε τις αλλαγές στο μεταβολισμό των φυτών. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε την καινοτόμο τεχνολογία στη μεταβολομική με βάση την υπολογιστική MS και πραγματοποιήσαμε ανάλυση MS αποσυνέλιξης στο γενικό νόμισμα των περιγραφέων της θεωρίας πληροφοριών για να ελέγξουμε τη διάκριση μεταξύ των δύο που προτείνονται σε παγκόσμιο επίπεδο μεταβολομικής. Η βασική πρόβλεψη αυτής της θεωρίας. Η θεωρία πληροφοριών έχει εφαρμοστεί σε πολλούς τομείς, ειδικά στο πλαίσιο της έρευνας για τη βιοποικιλότητα και τη ροή θρεπτικών συστατικών (43). Ωστόσο, από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη εφαρμογή που χρησιμοποιείται για την περιγραφή του μεταβολικού χώρου πληροφοριών των φυτών και την επίλυση οικολογικών προβλημάτων που σχετίζονται με προσωρινές μεταβολικές αλλαγές σε απόκριση σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα. Συγκεκριμένα, η ικανότητα αυτής της μεθόδου έγκειται στην ικανότητά της να συγκρίνει μοτίβα εντός και μεταξύ φυτικών ειδών για να εξετάσει πώς τα φυτοφάγα έχουν εξελιχθεί από διαφορετικά είδη σε μακροεξελικτικά μοτίβα μεταξύ ειδών σε διαφορετικά επίπεδα εξέλιξης. Μεταβολισμός.
Η ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) μετατρέπει ένα σύνολο δεδομένων πολλαπλών μεταβλητών σε έναν χώρο μείωσης διαστάσεων, έτσι ώστε να μπορεί να εξηγηθεί η κύρια τάση των δεδομένων, επομένως χρησιμοποιείται συνήθως ως διερευνητική τεχνική για την ανάλυση του συνόλου δεδομένων, όπως το μεταβολολόγιο αποσυνέλιξης. Ωστόσο, η μείωση διαστάσεων θα χάσει μέρος του περιεχομένου πληροφοριών στο σύνολο δεδομένων και η PCA δεν μπορεί να παρέχει ποσοτικές πληροφορίες σχετικά με χαρακτηριστικά που είναι ιδιαίτερα σχετικά με την οικολογική θεωρία, όπως: πώς τα φυτοφάγα αναδιαμορφώνουν την ποικιλομορφία σε εξειδικευμένους τομείς (για παράδειγμα, πλούτος, κατανομή) και αφθονία) μεταβολίτες; Ποιοι μεταβολίτες είναι προγνωστικοί παράγοντες της επαγόμενης κατάστασης ενός δεδομένου φυτοφάγου; Από την άποψη της εξειδίκευσης, της ποικιλομορφίας και της επαγωγιμότητας, το περιεχόμενο πληροφοριών του προφίλ μεταβολίτη ειδικού για τα φύλλα αποσυντίθεται και διαπιστώνεται ότι η κατανάλωση φυτοφάγων μπορεί να ενεργοποιήσει συγκεκριμένο μεταβολισμό. Απροσδόκητα, παρατηρήσαμε ότι, όπως περιγράφεται στους δείκτες θεωρίας πληροφοριών που εφαρμόστηκαν, η προκύπτουσα μεταβολική κατάσταση έχει μεγάλη επικάλυψη μετά τις επιθέσεις των δύο φυτοφάγων (του γενικού Sl που τρέφεται τη νύχτα) και της εμπειρογνώμονα Solanaceae κας. Αν και η συμπεριφορά και η συγκέντρωσή τους στη διατροφή είναι σημαντικά διαφορετικές. Εκκινητής συζεύγματος λιπαρού οξέος-αμινοξέος (FAC) στο OS (31). Χρησιμοποιώντας το φυτοφάγο OS για τη θεραπεία τυποποιημένων τραυμάτων διάτρησης, η προσομοιωμένη θεραπεία φυτοφάγων έδειξε επίσης μια παρόμοια τάση. Αυτή η τυποποιημένη διαδικασία για την προσομοίωση της απόκρισης των φυτών στις επιθέσεις φυτοφάγων εξαλείφει τους συγχυτικούς παράγοντες που προκαλούνται από αλλαγές στη διατροφική συμπεριφορά των φυτοφάγων, οι οποίες οδηγούν σε ποικίλους βαθμούς βλάβης σε διαφορετικούς χρόνους (34). Το FAC, το οποίο είναι γνωστό ότι είναι η κύρια αιτία του OSM, μειώνει τις αποκρίσεις JAS και άλλων φυτικών ορμονών στο OSS1, ενώ το OSS1 μειώνει εκατοντάδες φορές (31). Ωστόσο, το OSS1 προκάλεσε παρόμοια επίπεδα συσσώρευσης JA σε σύγκριση με το OSM. Έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι η απόκριση JA σε εξασθενημένα Nepenthes είναι πολύ ευαίσθητη στο OSM, όπου το FAC μπορεί να διατηρήσει τη δραστηριότητά του ακόμη και αν αραιωθεί 1:1000 με νερό (44). Επομένως, σε σύγκριση με το OSM, αν και το FAC στο OSS1 είναι πολύ χαμηλό, αρκεί για να προκαλέσει επαρκή έξαρση JA. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεΐνες που μοιάζουν με πορίνη (45) και οι ολιγοσακχαρίτες (46) μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοριακές ενδείξεις για την ενεργοποίηση αμυντικών αποκρίσεων των φυτών στο OSS1. Ωστόσο, δεν είναι ακόμη σαφές εάν αυτοί οι διεγέρτες στο OSS1 είναι υπεύθυνοι για τη συσσώρευση JA που παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη.
Παρόλο που υπάρχουν λίγες μελέτες που περιγράφουν τα διαφορικά μεταβολικά αποτυπώματα που προκαλούνται από την εφαρμογή διαφορετικών φυτοφάγων ή εξωγενούς JA ή SA (σαλικυλικό οξύ) (47), κανείς δεν έχει διαταράξει την ειδική για το είδος φυτοφάγου διαταραχή στο δίκτυο των φυτών και τις επιπτώσεις της στις συγκεκριμένες προσωπικές πληροφορίες. Η συνολική επίδραση του μεταβολισμού μελετάται συστηματικά. Αυτή η ανάλυση επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι η εσωτερική σύνδεση του ορμονικού δικτύου με άλλες φυτικές ορμόνες εκτός από τις JA διαμορφώνει την εξειδίκευση της μεταβολικής αναδιοργάνωσης που προκαλείται από τα φυτοφάγα. Συγκεκριμένα, εντοπίσαμε ότι η ET που προκαλείται από την OSM ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή που προκαλείται από την OSS1. Αυτός ο τρόπος λειτουργίας είναι συνεπής με μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε FAC στην OSM, η οποία είναι απαραίτητη και επαρκής συνθήκη για την ενεργοποίηση μιας έκρηξης ET (48). Στο πλαίσιο της αλληλεπίδρασης μεταξύ φυτών και φυτοφάγων, η σηματοδοτική λειτουργία της ET στη δυναμική των μεταβολιτών που είναι ειδικές για τα φυτά εξακολουθεί να είναι σποραδική και στοχεύει μόνο σε μία μόνο ομάδα ενώσεων. Επιπλέον, οι περισσότερες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει εξωγενή εφαρμογή ET ή των προδρόμων του ή διαφόρων αναστολέων για να μελετήσουν τη ρύθμιση του ET, μεταξύ των οποίων αυτές οι εξωγενείς χημικές εφαρμογές θα προκαλέσουν πολλές μη ειδικές παρενέργειες. Από όσο γνωρίζουμε, αυτή η μελέτη αντιπροσωπεύει την πρώτη συστηματική εξέταση μεγάλης κλίμακας του ρόλου του ET στη χρήση του ET για την παραγωγή και την αντίληψη διαταραγμένων διαγονιδιακών φυτών για τον συντονισμό της δυναμικής του μεταβολισμού των φυτών. Η επαγωγή του ET ειδικά για τα φυτοφάγα μπορεί τελικά να τροποποιήσει την απόκριση του μεταβολισμού. Η πιο σημαντική είναι η διαγονιδιακή χειραγώγηση των γονιδίων βιοσύνθεσης ET (ACO) και αντίληψης (ETR1) που αποκάλυψε την ειδική για τα φυτοφάγα de novo συσσώρευση φαινολαμιδίων. Έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι το ET μπορεί να ρυθμίσει με ακρίβεια τη συσσώρευση νικοτίνης που προκαλείται από JA ρυθμίζοντας την πουτρεσκίνη Ν-μεθυλοτρανσφεράση (49). Ωστόσο, από μηχανικής άποψης, δεν είναι σαφές πώς το ET ρυθμίζει με ακρίβεια την επαγωγή του φαιναμιδίου. Εκτός από τη λειτουργία μεταγωγής σήματος της ET, η μεταβολική ροή μπορεί επίσης να μετατοπιστεί στην S-αδενοσυλο-1-μεθειονίνη για να ρυθμιστεί η επένδυση σε πολυαμινοφαινολαμίδια. Η S-αδενοσυλο-1-μεθειονίνη είναι η ET και κοινό ενδιάμεσο της βιοσυνθετικής οδού πολυαμίνης. Ο μηχανισμός με τον οποίο το σήμα ET ρυθμίζει το επίπεδο της φαινολαμίδης χρειάζεται περαιτέρω μελέτη.
Για μεγάλο χρονικό διάστημα, λόγω του μεγάλου αριθμού ειδικών μεταβολιτών άγνωστης δομής, η έντονη προσοχή σε συγκεκριμένες μεταβολικές κατηγορίες δεν ήταν σε θέση να αξιολογήσει αυστηρά τις χρονικές αλλαγές της μεταβολικής ποικιλομορφίας μετά από βιολογικές αλληλεπιδράσεις. Προς το παρόν, με βάση την ανάλυση της θεωρίας πληροφοριών, το κύριο αποτέλεσμα της απόκτησης φάσματος MS/MS με βάση αμερόληπτους μεταβολίτες είναι ότι τα φυτοφάγα που τρώνε ή προσομοιώνουν φυτοφάγα συνεχίζουν να μειώνουν τη συνολική μεταβολική ποικιλομορφία του μεταβολώματος των φύλλων, ενώ αυξάνουν τον βαθμό εξειδίκευσής του. Αυτή η προσωρινή αύξηση της εξειδίκευσης του μεταβολώματος που προκαλείται από τα φυτοφάγα σχετίζεται με μια συνεργιστική αύξηση της εξειδίκευσης του μεταγραφώματος. Το χαρακτηριστικό που συμβάλλει περισσότερο σε αυτή τη μεγαλύτερη εξειδίκευση του μεταβολώματος (που έχει υψηλότερη τιμή Si) είναι ο ειδικός μεταβολίτης με την προηγουμένως χαρακτηρισμένη φυτοφάγο λειτουργία. Αυτό το μοντέλο είναι συνεπές με την πρόβλεψη της θεωρίας OD, αλλά η πρόβλεψη της MT που σχετίζεται με την τυχαιότητα του επαναπρογραμματισμού του μεταβολώματος δεν είναι συνεπής. Ωστόσο, αυτά τα δεδομένα είναι επίσης συνεπή με την πρόβλεψη του μικτού μοντέλου (καλύτερη MT· Σχήμα 1Β), επειδή άλλοι μη χαρακτηρισμένοι μεταβολίτες με άγνωστες αμυντικές λειτουργίες ενδέχεται να ακολουθούν μια τυχαία κατανομή Si.
Ένα αξιοσημείωτο μοτίβο που καταγράφεται περαιτέρω από αυτή την έρευνα είναι ότι από το επίπεδο μικρο-εξέλιξης (πληθυσμός ενός φυτού και καπνού) έως μια μεγαλύτερη εξελικτική κλίμακα (στενά συγγενικά είδη καπνού), διαφορετικά επίπεδα εξελικτικής οργάνωσης βρίσκονται στην «καλύτερη άμυνα». Υπάρχουν σημαντικές διαφορές στις ικανότητες των φυτοφάγων. Οι Moore et al. (20) και Kessler και Kalske (1) πρότειναν ανεξάρτητα να μετατρέψουν τα τρία λειτουργικά επίπεδα βιοποικιλότητας που αρχικά διέκρινε ο Whittaker (50) στις συστατικές και επαγόμενες χρονικές αλλαγές της χημικής ποικιλομορφίας. Αυτοί οι συγγραφείς δεν συνόψισαν ούτε τις διαδικασίες για τη συλλογή δεδομένων μεταβολισμού μεγάλης κλίμακας ούτε περιγράφουν πώς να υπολογιστεί η μεταβολική ποικιλομορφία από αυτά τα δεδομένα. Σε αυτή τη μελέτη, μικρές προσαρμογές στη λειτουργική ταξινόμηση του Whittaker θα λάβουν υπόψη την α-μεταβολική ποικιλομορφία ως την ποικιλομορφία των φασμάτων MS/MS σε ένα δεδομένο φυτό και την β-μεταβολική ποικιλομορφία ως τον βασικό ενδοειδικό μεταβολισμό μιας ομάδας πληθυσμών. Ο χώρος και η γ-μεταβολική ποικιλομορφία θα αποτελέσουν επέκταση της ανάλυσης παρόμοιων ειδών.
Το σήμα JA είναι απαραίτητο για ένα ευρύ φάσμα μεταβολικών αποκρίσεων των φυτοφάγων. Ωστόσο, υπάρχει έλλειψη αυστηρών ποσοτικών δοκιμών σχετικά με τη συμβολή της ενδοειδικής ρύθμισης της βιοσύνθεσης JA στην ποικιλομορφία του μεταβολισμού, και το κατά πόσον το σήμα JA αποτελεί γενική θέση για μεταβολική διαφοροποίηση που προκαλείται από στρες σε υψηλότερη μακροεξελικτική κλίμακα παραμένει ασαφές. Παρατηρήσαμε ότι η φυτοφάγος φύση του φυτοφάγου Nepenthes προκαλεί εξειδίκευση του μεταβολισμού και η διακύμανση της εξειδίκευσης του μεταβολισμού εντός του πληθυσμού των ειδών Nicotiana και μεταξύ στενά συγγενικών ειδών Nicotiana συσχετίζεται συστηματικά θετικά με τη σηματοδότηση JA. Επιπλέον, όταν το σήμα JA είναι μειωμένο, η μεταβολική εξειδίκευση που προκαλείται από ένα φυτοφάγο με έναν μόνο γονότυπο θα ακυρωθεί (Σχήμα 3, C και E). Δεδομένου ότι οι μεταβολικές αλλαγές στο φάσμα των φυσικώς εξασθενημένων πληθυσμών Nepenthes είναι ως επί το πλείστον ποσοτικές, οι αλλαγές στην μεταβολική β ποικιλομορφία και εξειδίκευση σε αυτήν την ανάλυση μπορεί να οφείλονται σε μεγάλο βαθμό στην ισχυρή διέγερση κατηγοριών ενώσεων πλούσιων σε μεταβολίτες. Αυτές οι κατηγορίες ενώσεων κυριαρχούν σε ένα μέρος του προφίλ του μεταβολισμού και οδηγούν σε θετική συσχέτιση με τα σήματα JA.
Επειδή οι βιοχημικοί μηχανισμοί των ειδών καπνού που σχετίζονται στενά με αυτό είναι πολύ διαφορετικοί, οι μεταβολίτες προσδιορίζονται συγκεκριμένα στην ποιοτική πτυχή, επομένως είναι πιο αναλυτική. Η επεξεργασία του καταγεγραμμένου μεταβολικού προφίλ από τη θεωρία πληροφοριών αποκαλύπτει ότι η επαγωγή των φυτοφάγων επιδεινώνει την ανταλλαγή μεταξύ της μεταβολικής γάμμα ποικιλομορφίας και της εξειδίκευσης. Το σήμα JA παίζει κεντρικό ρόλο σε αυτήν την ανταλλαγή. Η αύξηση στην εξειδίκευση του μεταβολώματος είναι συνεπής με την κύρια πρόβλεψη OD και συσχετίζεται θετικά με το σήμα JA, ενώ το σήμα JA συσχετίζεται αρνητικά με την μεταβολική γάμμα ποικιλομορφία. Αυτά τα μοντέλα δείχνουν ότι η ικανότητα OD των φυτών καθορίζεται κυρίως από την πλαστικότητα του JA, είτε σε μικροεξελικτική κλίμακα είτε σε μεγαλύτερη εξελικτική κλίμακα. Πειράματα εφαρμογής εξωγενούς JA που παρακάμπτουν τα ελαττώματα βιοσύνθεσης JA αποκαλύπτουν περαιτέρω ότι τα στενά συγγενικά είδη καπνού μπορούν να διακριθούν σε είδη που ανταποκρίνονται στο σήμα και σε είδη που δεν ανταποκρίνονται στο σήμα, όπως ακριβώς και ο τρόπος JA και η πλαστικότητα του μεταβολώματος που προκαλούνται από τα φυτοφάγα. Τα είδη που δεν ανταποκρίνονται στο σήμα δεν μπορούν να ανταποκριθούν λόγω της αδυναμίας τους να παράγουν ενδογενή JA και επομένως υπόκεινται σε φυσιολογικούς περιορισμούς. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε μεταλλάξεις σε ορισμένα βασικά γονίδια στην οδό σηματοδότησης JA (AOS και JAR4 στο N. crescens). Αυτό το αποτέλεσμα υπογραμμίζει ότι αυτά τα μακροεξελικτικά πρότυπα μεταξύ των ειδών μπορεί να οφείλονται κυρίως σε αλλαγές στην εσωτερική ορμονική αντίληψη και ανταπόκριση.
Εκτός από την αλληλεπίδραση μεταξύ φυτών και φυτοφάγων, η εξερεύνηση της μεταβολικής ποικιλομορφίας σχετίζεται με όλες τις σημαντικές θεωρητικές εξελίξεις στην έρευνα της βιολογικής προσαρμογής στο περιβάλλον και της εξέλιξης σύνθετων φαινοτυπικών χαρακτηριστικών. Με την αύξηση της ποσότητας δεδομένων που αποκτώνται από τα σύγχρονα όργανα MS, ο έλεγχος υποθέσεων σχετικά με τη μεταβολική ποικιλομορφία μπορεί πλέον να υπερβεί τις διαφορές μεταξύ ατομικών/κατηγοριών μεταβολιτών και να πραγματοποιήσει συνολική ανάλυση για να αποκαλύψει απροσδόκητα πρότυπα. Στη διαδικασία της ανάλυσης μεγάλης κλίμακας, μια σημαντική μεταφορά είναι η ιδέα της σύλληψης ουσιαστικών χαρτών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εξερεύνηση δεδομένων. Επομένως, ένα σημαντικό αποτέλεσμα του τρέχοντος συνδυασμού αμερόληπτης μεταβολομικής MS/MS και θεωρίας πληροφοριών είναι ότι παρέχει μια απλή μετρική που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την κατασκευή χαρτών για την περιήγηση στη μεταβολική ποικιλομορφία σε διαφορετικές ταξινομικές κλίμακες. Είναι η βασική απαίτηση αυτής της μεθόδου. Η μελέτη της μικρο/μακροεξέλιξης και της οικολογίας της κοινότητας.
Σε μακρο-εξελικτικό επίπεδο, ο πυρήνας της θεωρίας της συν-εξέλιξης φυτών-εντόμων των Ehrlich και Raven (51) είναι η πρόβλεψη ότι η διακύμανση της μεταβολικής ποικιλομορφίας μεταξύ των ειδών είναι η αιτία της διαφοροποίησης των φυτικών γενεαλογικών γραμμών. Ωστόσο, στα πενήντα χρόνια από τη δημοσίευση αυτού του πρωτοποριακού έργου, αυτή η υπόθεση έχει σπάνια δοκιμαστεί (52). Αυτό οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στα φυλογενετικά χαρακτηριστικά συγκρίσιμων μεταβολικών χαρακτηριστικών σε φυτικές γενεαλογικές γραμμές μεγάλων αποστάσεων. Η σπανιότητα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αγκύρωση μεθόδων ανάλυσης στόχων. Η τρέχουσα ροή εργασίας MS/MS που επεξεργάζεται η θεωρία πληροφοριών ποσοτικοποιεί τη δομική ομοιότητα MS/MS άγνωστων μεταβολιτών (χωρίς προηγούμενη επιλογή μεταβολίτη) και μετατρέπει αυτά τα MS/MS σε ένα σύνολο MS/MS, έτσι στον επαγγελματικό μεταβολισμό αυτά τα μακρο-εξελικτικά μοντέλα συγκρίνονται σε κλίμακα ταξινόμησης. Απλοί στατιστικοί δείκτες. Η διαδικασία είναι παρόμοια με τη φυλογενετική ανάλυση, η οποία μπορεί να χρησιμοποιήσει την ευθυγράμμιση αλληλουχίας για να ποσοτικοποιήσει τον ρυθμό διαφοροποίησης ή την εξέλιξη του χαρακτήρα χωρίς προηγούμενη πρόβλεψη.
Σε βιοχημικό επίπεδο, η υπόθεση διαλογής των Firn και Jones (53) δείχνει ότι η μεταβολική ποικιλομορφία διατηρείται σε διαφορετικά επίπεδα για να παρέχει πρώτες ύλες για την άσκηση των βιολογικών δραστηριοτήτων προηγουμένως άσχετων ή υποκατεστημένων μεταβολιτών. Οι μέθοδοι της θεωρίας πληροφοριών παρέχουν ένα πλαίσιο στο οποίο αυτές οι εξελικτικές μεταβάσεις που αφορούν συγκεκριμένους μεταβολίτες και συμβαίνουν κατά την εξειδίκευση των μεταβολιτών μπορούν να ποσοτικοποιηθούν ως μέρος της προτεινόμενης εξελικτικής διαδικασίας διαλογής: βιολογικά ενεργή προσαρμογή από χαμηλή εξειδίκευση σε υψηλή εξειδίκευση. Ανασταλμένοι μεταβολίτες ενός δεδομένου περιβάλλοντος.
Συνολικά, στις πρώτες ημέρες της μοριακής βιολογίας, αναπτύχθηκαν σημαντικές θεωρίες για την άμυνα των φυτών και οι μέθοδοι που βασίζονται σε παραγωγικές υποθέσεις θεωρούνται ευρέως ως το μόνο μέσο επιστημονικής προόδου. Αυτό οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στους τεχνικούς περιορισμούς της μέτρησης ολόκληρου του μεταβολισμού. Αν και οι μέθοδοι που βασίζονται σε υποθέσεις είναι ιδιαίτερα χρήσιμες στην επιλογή άλλων αιτιωδών μηχανισμών, η ικανότητά τους να προωθήσουν την κατανόησή μας για τα βιοχημικά δίκτυα είναι πιο περιορισμένη από τις υπολογιστικές μεθόδους που είναι διαθέσιμες σήμερα στη σύγχρονη επιστήμη έντασης δεδομένων. Επομένως, οι θεωρίες που δεν μπορούν να προβλεφθούν υπερβαίνουν κατά πολύ το πεδίο εφαρμογής των διαθέσιμων δεδομένων, επομένως ο υποθετικός τύπος/κύκλος δοκιμών προόδου στον ερευνητικό τομέα δεν μπορεί να καταργηθεί (4). Προβλέπουμε ότι η υπολογιστική ροή εργασίας της μεταβολομικής που εισάγεται εδώ μπορεί να αναζωπυρώσει το ενδιαφέρον για τα πρόσφατα (πώς) και τελικά (γιατί) ζητήματα της μεταβολικής ποικιλομορφίας και να συμβάλει σε μια νέα εποχή θεωρητικά καθοδηγούμενης επιστήμης δεδομένων. Η εποχή επανεξέτασε τις σημαντικές θεωρίες που ενέπνευσαν τις προηγούμενες γενιές.
Η άμεση σίτιση των φυτοφάγων πραγματοποιείται με την εκτροφή μιας δεύτερης προνύμφης σταδίου ή προνύμφης Sl σε ένα μόνο φύλλο ανοιχτόχρωμου φυτού pitcher ενός μόνο φυτού που ανθίζει τριανταφυλλιά, με 10 αντίγραφα φυτών ανά φυτό. Οι προνύμφες των εντόμων σφιγκτήρες και ο υπόλοιπος ιστός των φύλλων συλλέχθηκε 24 και 72 ώρες μετά τη μόλυνση και καταψύχθηκε ταχέως, και οι μεταβολίτες εκχυλίστηκαν.
Προσομοιώστε την φυτοφάγα θεραπεία με έναν εξαιρετικά συγχρονισμένο τρόπο. Η μέθοδος είναι η χρήση τροχών με μοτίβο υφάσματος για να τρυπήσετε τρεις σειρές αγκάθια σε κάθε πλευρά της κεντρικής πλευράς των τριών πλήρως αναπτυγμένων φύλλων του φυτού κατά το στάδιο ανάπτυξης της γιρλάντας υφάσματος και αμέσως εφαρμόστε αραιωμένο Ms 1:5. Ή χρησιμοποιήστε γάντια για να εισάγετε το S1 OS στην πληγή τρυπήματος. Συλλέξτε και επεξεργαστείτε ένα φύλλο όπως περιγράφεται παραπάνω. Χρησιμοποιήστε την προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο για την εξαγωγή πρωτογενών μεταβολιτών και φυτικών ορμονών (54).
Για εξωγενείς εφαρμογές JA, τα τρία φύλλα μίσχου καθενός από τα έξι φυτά τριανταφυλλιάς κάθε είδους υποβάλλονται σε επεξεργασία με 20 μl πάστας λανολίνης που περιέχει 150 μg MeJA (Lan + MeJA) και 20 μl λανολίνης συν επεξεργασία τραύματος (Lan + W) ή χρησιμοποιούνται 20 μl καθαρής λανολίνης ως έλεγχος. Τα φύλλα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επεξεργασία, καταψύχθηκαν ακαριαία σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80°C μέχρι τη χρήση.
Στην ερευνητική μας ομάδα έχουν εντοπιστεί τέσσερις διαγονιδιακές σειρές JA και ET, συγκεκριμένα οι irAOC (36), irCOI1 (55), irACO και sETR1 (48). Η irAOC έδειξε έντονη μείωση στα επίπεδα JA και JA-Ile, ενώ η irCOI1 δεν ήταν ευαίσθητη στις JA. Σε σύγκριση με τις EV, η συσσώρευση JA-Ile αυξήθηκε. Ομοίως, η irACO θα μειώσει την παραγωγή ET, και σε σύγκριση με την EV, η sETR1, η οποία δεν είναι ευαίσθητη στην ET, θα αυξήσει την παραγωγή ET.
Για την εκτέλεση μη επεμβατικής μέτρησης της ET χρησιμοποιείται φωτοακουστικός φασματόμετρο λέιζερ (αισθητήρας ET πραγματικού χρόνου Sensor Sense ETD-300). Αμέσως μετά την επεξεργασία, τα μισά φύλλα κόπηκαν και μεταφέρθηκαν σε σφραγισμένο γυάλινο φιαλίδιο των 4 ml και ο υπερκείμενος χώρος αφέθηκε να συσσωρευτεί εντός 5 ωρών. Κατά τη διάρκεια της μέτρησης, κάθε φιαλίδιο ξεπλύθηκε με ρεύμα 2 λίτρων/ώρα καθαρού αέρα για 8 λεπτά, ο οποίος είχε προηγουμένως διέλθει από καταλύτη που παρέχεται από την Sensor Sense για την απομάκρυνση του CO2 και του νερού.
Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών δημοσιεύθηκαν αρχικά στο (35) και αποθηκεύτηκαν στην Πλήρη Βάση Δεδομένων Έκφρασης Γονιδίων του Εθνικού Κέντρου Βιοτεχνολογικών Πληροφοριών (NCBI) (αριθμός πρόσβασης GSE30287). Τα δεδομένα που αντιστοιχούν στα φύλλα που προκλήθηκαν από την επεξεργασία με W + OSMs και στον μη κατεστραμμένο έλεγχο εξήχθησαν για αυτήν τη μελέτη. Η ακατέργαστη ένταση είναι log2. Πριν από τη στατιστική ανάλυση, η γραμμή βάσης μετατράπηκε και ομαλοποιήθηκε στο 75ο εκατοστημόριο χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού R.
Τα αρχικά δεδομένα αλληλούχισης RNA (RNA-seq) του είδους Nicotiana ανακτήθηκαν από τα Αρχεία Σύντομης Ανάγνωσης (SRA) του NCBI, ο αριθμός έργου είναι PRJNA301787, ο οποίος αναφέρθηκε από τους Zhou et al. (39) και προχωρούν όπως περιγράφεται στο (56). Τα ακατέργαστα δεδομένα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από τα W + W, W + OSM και W + OSS1 που αντιστοιχούν στα είδη Nicotiana επιλέχθηκαν για ανάλυση σε αυτήν τη μελέτη και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ακόλουθο τρόπο: Πρώτον, οι ακατέργαστες μετρήσεις RNA-seq μετατράπηκαν σε μορφή FASTQ. Το HISAT2 μετατρέπει το FASTQ σε SAM και το SAMtools μετατρέπει τα αρχεία SAM σε ταξινομημένα αρχεία BAM. Το StringTie χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της γονιδιακής έκφρασης και η μέθοδος έκφρασής του είναι ότι υπάρχουν θραύσματα ανά χίλιες βάσεις θραυσμάτων ανά εκατομμύριο αλληλουχημένα θραύσματα μεταγραφής.
Η χρωματογραφική στήλη Acclaim (150 mm x 2,1 mm· μέγεθος σωματιδίων 2,2 μm) που χρησιμοποιήθηκε στην ανάλυση και η προστατευτική στήλη 4 mm x 4 mm αποτελούνται από το ίδιο υλικό. Η ακόλουθη δυαδική βαθμίδωση χρησιμοποιείται στο σύστημα Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC): 0 έως 0,5 λεπτά, ισοκρατική 90% A [απιονισμένο νερό, 0,1% (v/v) ακετονιτρίλιο και 0,05% μυρμηκικό οξύ], 10% B (ακετονιτρίλιο και 0,05% μυρμηκικό οξύ)· 0,5 έως 23,5 λεπτά, η βαθμιδωτή φάση είναι 10% A και 90% B, αντίστοιχα· 23,5 έως 25 λεπτά, ισοκρατική 10% A και 90% B. Ο ρυθμός ροής είναι 400μl/min. Για όλες τις αναλύσεις MS, εγχύστε το έκλουσμα της στήλης σε έναν τετραπολικό αναλυτή χρόνου πτήσης (qTOF) εξοπλισμένο με πηγή ηλεκτροψεκασμού που λειτουργεί σε λειτουργία θετικού ιονισμού (τριχοειδής τάση, 4500 V· τριχοειδής έξοδος 130 V· θερμοκρασία ξήρανσης 200°C· ροή αέρα ξήρανσης 10 λίτρα/λεπτό).
Εκτελέστε ανάλυση θραυσμάτων MS / MS (εφεξής αναφερόμενη ως MS / MS) που είναι άσχετη ή δυσδιάκριτη από τα δεδομένα για να λάβετε δομικές πληροφορίες σχετικά με το συνολικό ανιχνεύσιμο μεταβολικό προφίλ. Η έννοια της αδιάκριτης μεθόδου MS/MS βασίζεται στο γεγονός ότι το τετράπολο έχει ένα πολύ μεγάλο παράθυρο απομόνωσης μάζας [επομένως, θεωρήστε όλα τα σήματα λόγου μάζας προς φορτίο (m/z) ως θραύσματα]. Για αυτόν τον λόγο, επειδή το όργανο Impact II δεν μπόρεσε να δημιουργήσει κλίση CE, πραγματοποιήθηκαν αρκετές ανεξάρτητες αναλύσεις χρησιμοποιώντας αυξημένες τιμές ενέργειας σύγκρουσης διάσπασης (CE) που προκαλείται από σύγκρουση. Εν ολίγοις, αναλύστε πρώτα το δείγμα με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού UHPLC/qTOF-MS χρησιμοποιώντας λειτουργία φασματομετρίας μίας μάζας (συνθήκες χαμηλού κατακερματισμού που δημιουργούνται από κατακερματισμό εντός της πηγής), σαρώνοντας από m/z 50 έως 1500 σε συχνότητα επανάληψης 5 Hz. Χρησιμοποιήστε άζωτο ως αέριο σύγκρουσης για ανάλυση MS/MS και εκτελέστε ανεξάρτητες μετρήσεις στις ακόλουθες τέσσερις διαφορετικές τάσεις διάσπασης που προκαλείται από σύγκρουση: 20, 30, 40 και 50 eV. Καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας μέτρησης, το τετράπολο έχει το μεγαλύτερο παράθυρο απομόνωσης μάζας, από m/z 50 έως 1500. Όταν το πείραμα m/z του μπροστινού σώματος και πλάτους απομόνωσης οριστεί σε 200, το εύρος μάζας ενεργοποιείται αυτόματα από το λογισμικό λειτουργίας του οργάνου και 0 Da. Σαρώστε για θραύσματα μάζας όπως στη λειτουργία μίας μάζας. Χρησιμοποιήστε μυρμηκικό νάτριο (50 ml ισοπροπανόλη, 200 μl μυρμηκικό οξύ και 1 ml υδατικό διάλυμα NaOH 1M) για τη βαθμονόμηση μάζας. Χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο βαθμονόμησης υψηλής ακρίβειας του Bruker, το αρχείο δεδομένων βαθμονομείται μετά την εκτέλεση του μέσου φάσματος σε μια δεδομένη χρονική περίοδο. Χρησιμοποιήστε τη λειτουργία εξαγωγής του λογισμικού Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Βρέμη, Γερμανία) για να μετατρέψετε τα αρχεία ακατέργαστων δεδομένων σε μορφή NetCDF. Το σύνολο δεδομένων MS/MS έχει αποθηκευτεί στην ανοιχτή βάση δεδομένων μεταβολομικής MetaboLights (www.ebi.ac.uk) με τον αριθμό πρόσβασης. MTBLS1471.
Η συναρμολόγηση MS/MS μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω ανάλυσης συσχέτισης μεταξύ σημάτων ποιότητας MS1 και MS/MS για χαμηλή και υψηλή ενέργεια σύγκρουσης και νέους εφαρμοσμένους κανόνες. Το σενάριο R χρησιμοποιείται για την πραγματοποίηση της ανάλυσης συσχέτισης της κατανομής του προδρόμου στο προϊόν και το σενάριο C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) χρησιμοποιείται για την εφαρμογή των κανόνων.
Προκειμένου να μειωθούν τα ψευδώς θετικά σφάλματα που προκαλούνται από τον θόρυβο υποβάθρου και την ψευδή συσχέτιση που προκαλείται από την ανίχνευση ορισμένων χαρακτηριστικών m/z σε λίγα μόνο δείγματα, χρησιμοποιούμε τη συνάρτηση "filled peak" του πακέτου R. Το XCMS (για διόρθωση θορύβου υποβάθρου) θα πρέπει να χρησιμοποιείται για να αντικαταστήσει την ένταση "NA" (μη ανιχνεύσιμη κορυφή). Όταν χρησιμοποιείται η συνάρτηση fill peak, εξακολουθούν να υπάρχουν πολλές τιμές έντασης "0" στο σύνολο δεδομένων που θα επηρεάσουν τον υπολογισμό της συσχέτισης. Στη συνέχεια, συγκρίνουμε τα αποτελέσματα επεξεργασίας δεδομένων που λαμβάνονται όταν χρησιμοποιείται η συνάρτηση filled peak και όταν δεν χρησιμοποιείται η συνάρτηση filled peak και υπολογίζουμε την τιμή θορύβου υποβάθρου με βάση τη μέση διορθωμένη εκτιμώμενη τιμή και στη συνέχεια αντικαθιστούμε αυτές τις τιμές έντασης 0 με την υπολογισμένη τιμή υποβάθρου. Επίσης, λάβαμε υπόψη μόνο χαρακτηριστικά των οποίων η ένταση υπερέβαινε τρεις φορές την τιμή υποβάθρου και τα θεωρήσαμε ως "αληθινές κορυφές". Για τους υπολογισμούς PCC, λαμβάνονται υπόψη μόνο τα σήματα m/z του προδρόμου δείγματος (MS1) και των συνόλων δεδομένων θραυσμάτων με τουλάχιστον οκτώ αληθείς κορυφές.
Εάν η ένταση του χαρακτηριστικού ποιότητας προδρόμου σε ολόκληρο το δείγμα συσχετίζεται σημαντικά με τη μειωμένη ένταση του ίδιου χαρακτηριστικού ποιότητας που υπόκειται σε χαμηλή ή υψηλή ενέργεια σύγκρουσης και το χαρακτηριστικό δεν επισημαίνεται ως κορυφή ισοτόπου από την CAMERA, μπορεί να οριστεί περαιτέρω. Στη συνέχεια, υπολογίζοντας όλα τα πιθανά ζεύγη προδρόμου-προϊόντος εντός 3 δευτερολέπτων (το εκτιμώμενο χρονικό παράθυρο κατακράτησης για τη διατήρηση της κορυφής), εκτελείται η ανάλυση συσχέτισης. Μόνο όταν η τιμή m/z είναι χαμηλότερη από την τιμή του προδρόμου και ο κατακερματισμός MS/MS εμφανίζεται στην ίδια θέση δείγματος στο σύνολο δεδομένων με τον πρόδρομο από τον οποίο προέρχεται, θεωρείται θραύσμα.
Με βάση αυτούς τους δύο απλούς κανόνες, εξαιρούμε τα καθορισμένα θραύσματα με τιμές m/z μεγαλύτερες από το m/z του ταυτοποιημένου προδρόμου και με βάση τη θέση του δείγματος όπου εμφανίζεται ο πρόδρομος και το καθορισμένο θραύσμα. Είναι επίσης δυνατό να επιλέξουμε τα χαρακτηριστικά ποιότητας που δημιουργούνται από πολλά θραύσματα εντός της πηγής που δημιουργούνται σε λειτουργία MS1 ως υποψήφιοι πρόδρομοι, δημιουργώντας έτσι πλεονάζουσες ενώσεις MS/MS. Προκειμένου να μειωθεί αυτός ο πλεονασμός δεδομένων, εάν η ομοιότητα NDP των φασμάτων υπερβαίνει το 0,6 και ανήκουν στο χρωματογράφημα "pcgroup" που σχολιάζεται από το CAMERA, θα τα συγχωνεύσουμε. Τέλος, συγχωνεύουμε και τα τέσσερα αποτελέσματα CE που σχετίζονται με τον πρόδρομο και τα θραύσματα στο τελικό αποσυνδεδεμένο σύνθετο φάσμα επιλέγοντας την κορυφή υψηλότερης έντασης μεταξύ όλων των υποψήφιων κορυφών με την ίδια τιμή m/z σε διαφορετικές ενέργειες σύγκρουσης. Τα επόμενα βήματα επεξεργασίας βασίζονται στην έννοια του σύνθετου φάσματος και λαμβάνουν υπόψη τις διαφορετικές συνθήκες CE που απαιτούνται για τη μεγιστοποίηση της πιθανότητας κατακερματισμού, επειδή ορισμένα θραύσματα μπορούν να ανιχνευθούν μόνο υπό μια συγκεκριμένη ενέργεια σύγκρουσης.
Ο RDPI (30) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της επαγωγιμότητας του μεταβολικού προφίλ. Η ποικιλομορφία του μεταβολικού φάσματος (δείκτης Hj) προκύπτει από την αφθονία των προδρόμων MS/MS χρησιμοποιώντας την εντροπία Shannon της κατανομής συχνότητας MS/MS χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση που περιγράφεται από τους Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) όπου το Pij αντιστοιχεί στη σχετική συχνότητα του i-οστού MS/MS στο j-οστό δείγμα (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Η μεταβολική εξειδίκευση (δείκτης Si) ορίζεται ως η ταυτότητα έκφρασης ενός δεδομένου MS/MS σε σχέση με τη συχνότητα μεταξύ των δειγμάτων που εξετάζονται. Η εξειδίκευση MS/MS υπολογίζεται ως Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Χρησιμοποιήστε τον ακόλουθο τύπο για να μετρήσετε τον δείκτη δj που είναι ειδικός για το μεταβολίωμα κάθε δείγματος j και τον μέσο όρο της εξειδίκευσης MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Τα φάσματα MS/MS ευθυγραμμίζονται σε ζεύγη και η ομοιότητα υπολογίζεται με βάση τις δύο βαθμολογίες. Αρχικά, χρησιμοποιώντας την τυπική NDP (γνωστή και ως μέθοδος συσχέτισης συνημίτονου), χρησιμοποιήστε την ακόλουθη εξίσωση για να βαθμολογήσετε την ομοιότητα τμήματος μεταξύ των φασμάτων NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 όπου S1 και S2 Αντίστοιχα, για το φάσμα 1 και το φάσμα 2, καθώς και για τα WS1, i και WS2, το i αντιπροσωπεύει το βάρος με βάση την ένταση της κορυφής, ώστε η διαφορά της i-οστής κοινής κορυφής μεταξύ των δύο φασμάτων να είναι μικρότερη από 0,01 Da. Το βάρος υπολογίζεται ως εξής: W = [ένταση κορυφής] m [ποιότητα] n, m = 0,5, n = 2, όπως προτείνεται από την MassBank.
Υλοποιήθηκε μια δεύτερη μέθοδος βαθμολόγησης, η οποία περιελάμβανε την ανάλυση του κοινού NL μεταξύ MS/MS. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε τις 52 λίστες NL που συναντώνται συχνά κατά τη διαδικασία κατακερματισμού MS σε συνδυασμό, και την πιο συγκεκριμένη NL (αρχείο δεδομένων S1) που έχει προηγουμένως σχολιαστεί για το φάσμα MS/MS των δευτερογενών μεταβολιτών του εξασθενημένου είδους Nepenthes (9, 26). Δημιουργήστε ένα δυαδικό διάνυσμα 1 και 0 για κάθε MS/MS, που αντιστοιχεί στο τρέχον και το ανύπαρκτο κάποιου NL αντίστοιχα. Με βάση την ομοιότητα της Ευκλείδειας απόστασης, η βαθμολογία ομοιότητας NL υπολογίζεται για κάθε ζεύγος δυαδικών διανυσμάτων NL.
Για να εκτελέσουμε διπλή ομαδοποίηση, χρησιμοποιήσαμε το πακέτο R DiffCoEx, το οποίο βασίζεται σε μια επέκταση της Ανάλυσης Συν-έκφρασης Βαρύτητας Γονιδίων (WGCNA). Χρησιμοποιώντας τους πίνακες βαθμολόγησης NDP και NL των φασμάτων MS/MS, χρησιμοποιήσαμε το DiffCoEx για να υπολογίσουμε τον συγκριτικό πίνακα συσχέτισης. Η δυαδική ομαδοποίηση εκτελείται ορίζοντας την παράμετρο "cutreeDynamic" σε method = "hybrid", cutHeight = 0,9999, deepSplit = T και minClusterSize = 10. Ο πηγαίος κώδικας R του DiffCoEx λήφθηκε από το πρόσθετο αρχείο 1 από τους Tesson et al. (57). Το απαιτούμενο πακέτο λογισμικού R WGCNA μπορεί να βρεθεί στη διεύθυνση https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Για να πραγματοποιήσουμε ανάλυση μοριακού δικτύου MS/MS, υπολογίσαμε τη ζευγαρωμένη φασματική συνδεσιμότητα με βάση τους τύπους ομοιότητας NDP και NL και χρησιμοποιήσαμε το λογισμικό Cytoscape για να απεικονίσουμε την τοπολογία του δικτύου χρησιμοποιώντας οργανική διάταξη στην εφαρμογή επέκτασης αλγορίθμου διάταξης CyFilescape yFiles.
Χρησιμοποιήστε την έκδοση R 3.0.1 για να εκτελέσετε στατιστική ανάλυση στα δεδομένα. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από το post-hoc τεστ Tukey's honestly significant difference (HSD). Προκειμένου να αναλυθεί η διαφορά μεταξύ της φυτοφάγου θεραπείας και του ελέγχου, η αμφίπλευρη κατανομή των δύο ομάδων δειγμάτων με την ίδια διακύμανση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το t-test του Student.
Για συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο, ανατρέξτε στη διεύθυνση http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης που διανέμεται σύμφωνα με τους όρους της Άδειας Creative Commons Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση, η οποία επιτρέπει τη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​εφόσον η τελική χρήση δεν αποσκοπεί σε εμπορικό κέρδος και η προϋπόθεση είναι ότι το πρωτότυπο έργο είναι σωστό. Αναφορά.
Σημείωση: Σας ζητάμε μόνο να δώσετε τη διεύθυνση email σας, ώστε το άτομο που προτείνετε στη σελίδα να γνωρίζει ότι θέλετε να δει το email και ότι δεν είναι ανεπιθύμητο. Δεν θα καταγράψουμε καμία διεύθυνση email.
Αυτή η ερώτηση χρησιμοποιείται για να ελεγχθεί εάν είστε επισκέπτης και να αποτραπεί η αυτόματη υποβολή ανεπιθύμητων μηνυμάτων.
Η θεωρία της πληροφορίας παρέχει ένα καθολικό νόμισμα για τη σύγκριση ειδικών μεταβολωμάτων και την πρόβλεψη θεωριών άμυνας δοκιμών.
Η θεωρία της πληροφορίας παρέχει ένα καθολικό νόμισμα για τη σύγκριση ειδικών μεταβολωμάτων και την πρόβλεψη θεωριών άμυνας δοκιμών.
©2021 American Association for the Advancement of Science. διατηρούνται όλα τα δικαιώματα. Η AAAS είναι συνεργάτης των HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef και COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.