Προηγουμένως έχουμε αναφέρει ότι τα επίπεδα ορού του μεταβολίτη τρυπτοφάνης που προέρχεται από το έντερο, ινδολο-3-προπιονικού οξέος (IPA), είναι χαμηλότερα σε ασθενείς με ηπατική ίνωση. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το μεταγραφόμωμα και το μεθυλόμωμα του DNA σε παχύσαρκα ήπατα σε σχέση με τα επίπεδα IPA στον ορό, καθώς και τον ρόλο του IPA στην πρόκληση φαινοτυπικής απενεργοποίησης των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων (HSCs) in vitro.
Η μελέτη περιελάμβανε 116 παχύσαρκους ασθενείς χωρίς σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔΤ2) (ηλικία 46,8 ± 9,3 έτη· ΔΜΣ: 42,7 ± 5,0 kg/m²) που υποβλήθηκαν σε βαριατρική χειρουργική επέμβαση στο Κέντρο Βαριατρικής Χειρουργικής Kuopio (KOBS). Τα επίπεδα IPA στην κυκλοφορία μετρήθηκαν με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (LC-MS), η ανάλυση ηπατικού μεταγραφώματος πραγματοποιήθηκε με αλληλούχιση ολικού RNA και η ανάλυση μεθυλίωσης DNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Ανθρώπινα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα (LX-2) χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα in vitro.
Τα επίπεδα IPA στον ορό συσχετίστηκαν με την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε αποπτωτικές, μιτοφαγικές και μακροβιοτικές οδούς στο ήπαρ. Το γονίδιο AKT σερίνης/θρεονίνης κινάσης 1 (AKT1) ήταν το πιο άφθονο και κυρίαρχο αλληλεπιδρών γονίδιο στα προφίλ ηπατικής μεταγραφής και μεθυλίωσης DNA. Η θεραπεία με IPA προκάλεσε απόπτωση, μειωμένη μιτοχονδριακή αναπνοή και αλλοίωσε τη μορφολογία των κυττάρων και τη μιτοχονδριακή δυναμική τροποποιώντας την έκφραση γονιδίων που είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν την ίνωση, την απόπτωση και την επιβίωση των κυττάρων LX-2.
Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η IPA έχει πιθανές θεραπευτικές επιδράσεις και μπορεί να προκαλέσει απόπτωση και να μετατοπίσει τον φαινότυπο των HSC προς μια ανενεργή κατάσταση, διευρύνοντας έτσι την πιθανότητα αναστολής της ίνωσης του ήπατος παρεμβαίνοντας στην ενεργοποίηση των HSC και στον μιτοχονδριακό μεταβολισμό.
Η συχνότητα εμφάνισης της παχυσαρκίας και του μεταβολικού συνδρόμου έχει συσχετιστεί με αυξανόμενη συχνότητα εμφάνισης μεταβολικά σχετιζόμενης λιπώδους νόσου του ήπατος (MASLD). Η νόσος επηρεάζει το 25% έως 30% του γενικού πληθυσμού [1]. Η κύρια συνέπεια της αιτιολογίας της MASLD είναι η ίνωση του ήπατος, μια δυναμική διαδικασία που χαρακτηρίζεται από συνεχή συσσώρευση ινώδους εξωκυττάριας μήτρας (ECM) [2]. Τα κύρια κύτταρα που εμπλέκονται στην ίνωση του ήπατος είναι τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα (HSCs), τα οποία εμφανίζουν τέσσερις γνωστούς φαινοτύπους: αδρανή, ενεργοποιημένα, απενεργοποιημένα και γηρασμένα [3, 4]. Τα HSCs μπορούν να ενεργοποιηθούν και να διαφοροποιηθούν από μια αδρανή μορφή σε πολλαπλασιαστικά κύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες με υψηλές ενεργειακές απαιτήσεις, με αυξημένη έκφραση α-ακτίνης λείων μυών (α-SMA) και κολλαγόνου τύπου Ι (Col-I) [5, 6]. Κατά την αντιστροφή της ίνωσης του ήπατος, τα ενεργοποιημένα HSCs αποβάλλονται μέσω απόπτωσης ή απενεργοποίησης. Αυτές οι διεργασίες περιλαμβάνουν την καταστολή των ινωδογόνων γονιδίων και την τροποποίηση των γονιδίων που προάγουν την επιβίωση (όπως οι σηματοδοτικές οδοί NF-κB και PI3K/Akt) [7, 8], καθώς και αλλαγές στη μιτοχονδριακή δυναμική και λειτουργία [9].
Τα επίπεδα ορού του μεταβολίτη τρυπτοφάνης ινδολο-3-προπιονικού οξέος (IPA), που παράγεται στο έντερο, έχουν βρεθεί ότι είναι μειωμένα σε ανθρώπινες μεταβολικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της MASLD [10-13]. Η IPA σχετίζεται με την πρόσληψη διαιτητικών ινών, είναι γνωστή για τις αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις της και εξασθενεί τον φαινότυπο της μη αλκοολικής στεατοηπατίτιδας (NASH) που προκαλείται από τη διατροφή in vivo και in vitro [11-14]. Ορισμένα στοιχεία προέρχονται από την προηγούμενη μελέτη μας, η οποία έδειξε ότι τα επίπεδα IPA στον ορό ήταν χαμηλότερα σε ασθενείς με ηπατική ίνωση από ό,τι σε παχύσαρκους ασθενείς χωρίς ηπατική ίνωση στη Μελέτη Βαριατρικής Χειρουργικής Kuopio (KOBS). Επιπλέον, δείξαμε ότι η θεραπεία με IPA θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση γονιδίων που είναι κλασικοί δείκτες κυτταρικής προσκόλλησης, κυτταρικής μετανάστευσης και ενεργοποίησης αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων σε ένα μοντέλο ανθρώπινων ηπατικών αστεροειδών κυττάρων (LX-2) και είναι ένας πιθανός ηπατοπροστατευτικός μεταβολίτης [15]. Ωστόσο, παραμένει ασαφές πώς η IPA προκαλεί υποχώρηση της ηπατικής ίνωσης ενεργοποιώντας την απόπτωση των HSC και τη μιτοχονδριακή βιοενέργεια.
Εδώ, καταδεικνύουμε ότι η IPA στον ορό σχετίζεται με την έκφραση γονιδίων εμπλουτισμένων σε οδούς απόπτωσης, μιτοφαγίας και μακροζωίας στο ήπαρ παχύσαρκων ατόμων που δεν πάσχουν από διαβήτη τύπου 2 (KOBS). Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η IPA μπορεί να προκαλέσει την κάθαρση και την αποικοδόμηση των ενεργοποιημένων αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων (HSCs) μέσω της οδού απενεργοποίησης. Αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν έναν νέο ρόλο για την IPA, καθιστώντας την έναν πιθανό θεραπευτικό στόχο για την προώθηση της υποχώρησης της ίνωσης του ήπατος.
Μια προηγούμενη μελέτη στην ομάδα KOBS έδειξε ότι οι ασθενείς με ηπατική ίνωση είχαν χαμηλότερα επίπεδα IPA στην κυκλοφορία του αίματος σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς ηπατική ίνωση [15]. Για να αποκλειστεί η πιθανή συγχυτική επίδραση του διαβήτη τύπου 2, στρατολογήσαμε 116 παχύσαρκους ασθενείς χωρίς διαβήτη τύπου 2 (μέση ηλικία ± τυπική απόκλιση: 46,8 ± 9,3 έτη· ΔΜΣ: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Πίνακας 1) από την τρέχουσα μελέτη KOBS ως πληθυσμό μελέτης [16]. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Νοσοκομείου της Κομητείας North Savo σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι (54/2005, 104/2008 και 27/2010).
Δείγματα βιοψίας ήπατος ελήφθησαν κατά τη διάρκεια βαριατρικής χειρουργικής επέμβασης και αξιολογήθηκαν ιστολογικά από έμπειρους παθολόγους σύμφωνα με τα κριτήρια που περιγράφηκαν προηγουμένως [17, 18]. Τα κριτήρια αξιολόγησης συνοψίζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1 και έχουν περιγραφεί προηγουμένως [19].
Δείγματα ορού νηστείας αναλύθηκαν με μη στοχευμένη υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (LC-MS) για μεταβολομική ανάλυση (n = 116). Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) όπως περιγράφηκε προηγουμένως19. Η ταυτοποίηση της ισοπροπυλικής αλκοόλης (IPA) βασίστηκε στον χρόνο κατακράτησης και στη σύγκριση του φάσματος MS/MS με καθαρά πρότυπα. Η ένταση του σήματος IPA (περιοχή κορυφής) λήφθηκε υπόψη σε όλες τις περαιτέρω αναλύσεις [20].
Η αλληλούχιση ολόκληρου του RNA του ήπατος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Illumina HiSeq 2500 και τα δεδομένα προεπεξεργάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19, 21, 22]. Πραγματοποιήσαμε στοχευμένη ανάλυση διαφορικής έκφρασης μεταγραφών που επηρεάζουν τη μιτοχονδριακή λειτουργία/βιογένεση χρησιμοποιώντας 1957 γονίδια που επιλέχθηκαν από τη βάση δεδομένων MitoMiner 4.0 [23]. Η ανάλυση μεθυλίωσης του DNA του ήπατος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας την ίδια μεθοδολογία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24, 25].
Ανθρώπινα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα (LX-2) παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον Καθηγητή Stefano Romeo και καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Για να επιλεγεί η λειτουργική δόση IPA, τα κύτταρα LX-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές συγκεντρώσεις IPA (10 μM, 100 μM και 1 mM; Sigma, 220027) σε μέσο DMEM/F12 για 24 ώρες. Επιπλέον, για να διερευνηθεί η ικανότητα της IPA να απενεργοποιεί τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs), τα κύτταρα LX-2 υποβλήθηκαν σε ταυτόχρονη αγωγή με 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) και 1 mM IPA σε μέσο χωρίς ορό για 24 ώρες. Για τους αντίστοιχους μάρτυρες-φορείς, χρησιμοποιήθηκε 4 nM HCL που περιείχε 0,1% BSA για την αγωγή με TGF-β1 και 0,05% DMSO για την αγωγή με IPA, και τα δύο χρησιμοποιήθηκαν μαζί για τη συνδυαστική αγωγή.
Η απόπτωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης FITC Annexin V με 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, ΗΠΑ, Cat# 640922) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, LX-2 (1 × 105 κύτταρα/φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα σε πλάκες 12 φρεατίων και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε πολλαπλές δόσεις IPA ή IPA και TGF-β1. Την επόμενη ημέρα, συλλέχθηκαν επιπλέοντα και προσκολλημένα κύτταρα, υποβλήθηκαν σε θρυψινοποίηση, πλύθηκαν με PBS, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης Annexin V και επωάστηκαν με FITC-Annexin V και 7-AAD για 15 λεπτά.
Τα μιτοχόνδρια σε ζωντανά κύτταρα χρωματίστηκαν για οξειδωτική δράση χρησιμοποιώντας Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Για τις δοκιμασίες MTR, τα κύτταρα LX-2 επωάστηκαν σε ίσες πυκνότητες με IPA και TGF-β1. Μετά από 24 ώρες, τα ζωντανά κύτταρα υποβλήθηκαν σε θρυψινοποίηση, πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με 100 μM MTR σε μέσο χωρίς ορό στους 37 °C για 20 λεπτά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Για την ανάλυση μορφολογίας ζωντανών κυττάρων, το μέγεθος των κυττάρων και η κυτταροπλασματική πολυπλοκότητα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας παραμέτρους εμπρόσθιας σκέδασης (FSC) και πλευρικής σκέδασης (SSC), αντίστοιχα.
Όλα τα δεδομένα (30.000 συμβάντα) αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας το NovoCyte Quanteon (Agilent) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό NovoExpress® 1.4.1 ή FlowJo V.10.
Ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) και ο ρυθμός εξωκυτταρικής οξίνισης (ECAR) μετρήθηκαν σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας έναν Αναλυτή Εξωκυτταρικής Ροής Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) εξοπλισμένο με ένα Seahorse XF Cell Mito Stress σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2 × 104 κύτταρα LX-2/φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες κυτταροκαλλιέργειας XF96. Μετά από επώαση όλη τη νύχτα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ισοπροπανόλη (IPA) και TGF-β1 (Συμπληρωματικές Μέθοδοι 1). Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Seahorse XF Wave, το οποίο περιλαμβάνει τη Γεννήτρια Αναφοράς Δοκιμής Φαινότυπου Ενέργειας Κυττάρων Seahorse XF. Από αυτό, υπολογίστηκε ένας Δείκτης Βιοενεργειακής Υγείας (BHI) [27].
Το συνολικό RNA μεταγράφηκε σε cDNA. Για συγκεκριμένες μεθόδους, βλ. αναφορά [15]. Τα επίπεδα mRNA της ανθρώπινης 60S ριβοσωμικής όξινης πρωτεΐνης P0 (RPLP0) και της κυκλοφιλίνης A1 (PPIA) χρησιμοποιήθηκαν ως συστατικά μάρτυρες γονιδίων. Το σύστημα QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher, Landsmeer, Ολλανδία) χρησιμοποιήθηκε με το κιτ TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) ή το κιτ Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050) και η σχετική αναδίπλωση γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας συγκριτικές παραμέτρους κύκλου τιμής Ct (ΔΔCt) και τη μέθοδο ΔΔCt. Λεπτομέρειες για τους εκκινητές παρέχονται στους Συμπληρωματικούς Πίνακες S2 και S3.
Το πυρηνικό DNA (ncDNA) και το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ αίματος και ιστού DNeasy (Qiagen) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Η σχετική ποσότητα του mtDNA υπολογίστηκε υπολογίζοντας την αναλογία κάθε περιοχής-στόχου mtDNA προς τον γεωμετρικό μέσο όρο των τριών περιοχών του πυρηνικού DNA (mtDNA/ncDNA), όπως περιγράφεται λεπτομερώς στις Συμπληρωματικές Μεθόδους 2. Λεπτομέρειες για τους εκκινητές για το mtDNA και το ncDNA παρέχονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S4.
Τα ζωντανά κύτταρα χρωματίστηκαν με Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) για την απεικόνιση των διακυτταρικών και ενδοκυτταρικών μιτοχονδριακών δικτύων. Τα κύτταρα LX-2 (1 × 104 κύτταρα/φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες σε αντίστοιχες πλάκες καλλιέργειας με γυάλινο πυθμένα (Ibidi GmbH, Martinsried, Γερμανία). Μετά από 24 ώρες, τα ζωντανά κύτταρα LX-2 επωάστηκαν με 100 μM MTR για 20 λεπτά στους 37 °C και οι πυρήνες των κυττάρων χρωματίστηκαν με DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Τα μιτοχονδριακά δίκτυα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Γερμανία) εξοπλισμένο με μια ομοεστιακή μονάδα Zeiss LSM 800 στους 37 °C σε υγρή ατμόσφαιρα με 5% CO2 χρησιμοποιώντας έναν αντικειμενικό φακό 63×NA 1.3. Λάβαμε δέκα εικόνες σειράς Z για κάθε τύπο δείγματος. Κάθε σειρά Z περιέχει 30 τομές, η καθεμία με πάχος 9,86 μm. Για κάθε δείγμα, ελήφθησαν εικόνες δέκα διαφορετικών οπτικών πεδίων χρησιμοποιώντας το λογισμικό ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Γερμανία) και πραγματοποιήθηκε ανάλυση μιτοχονδριακής μορφολογίας χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (v1.54d) [30, 31] σύμφωνα με τις παραμέτρους που περιγράφονται λεπτομερώς στις Συμπληρωματικές Μεθόδους 3.
Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 2% γλουταραλδεΰδη σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,1 M, ακολουθούμενη από σταθεροποίηση με διάλυμα τετροξειδίου του οσμίου 1% (Sigma Aldrich, MO, ΗΠΑ), αφυδατώθηκαν σταδιακά με ακετόνη (Merck, Darmstadt, Γερμανία) και τέλος ενσωματώθηκαν σε εποξειδική ρητίνη. Παρασκευάστηκαν εξαιρετικά λεπτές τομές και χρωματίστηκαν με 1% οξικό ουρανύλιο (Merck, Darmstadt, Γερμανία) και 1% κιτρικό μόλυβδο (Merck, Darmstadt, Γερμανία). Οι υπερδομικές εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Τόκιο, Ιαπωνία) σε τάση επιτάχυνσης 80 kV.
Η μορφολογία των κυττάρων LX-2 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με IPA για 24 ώρες αναλύθηκε με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης σε μεγέθυνση 50x χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο ανεστραμμένου φωτός Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 και AxioCam MRm, Jena, Γερμανία).
Τα κλινικά δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση ή διάμεσος (ενδοτεταρτημοριακό εύρος: IQR). Χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (συνεχείς μεταβλητές) ή χ² δοκιμή (κατηγορικές μεταβλητές) για τη σύγκριση των διαφορών μεταξύ των τριών ομάδων μελέτης. Το ποσοστό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων (FDR) χρησιμοποιήθηκε για τη διόρθωση των πολλαπλών δοκιμών και τα γονίδια με FDR < 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικά. Χρησιμοποιήθηκε ανάλυση συσχέτισης Spearman για τη συσχέτιση της μεθυλίωσης του DNA CpG με την ένταση του σήματος IPA, με αναφερόμενες ονομαστικές τιμές p (p < 0,05).
Η ανάλυση της οδού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα διαδικτυακό εργαλείο ανάλυσης γονιδιακών συνόλων (WebGestalt) για 268 αντίγραφα (ονομαστικό p < 0,01), 119 αντίγραφα που σχετίζονται με μιτοχόνδρια (ονομαστικό p < 0,05) και 4350 CpG από 3093 αντίγραφα ήπατος που συσχετίστηκαν με τα επίπεδα IPA στον ορό της κυκλοφορίας. Το ελεύθερα διαθέσιμο εργαλείο Venny DB (έκδοση 2.1.0) χρησιμοποιήθηκε για την εύρεση επικαλυπτόμενων γονιδίων και το StringDB (έκδοση 11.5) χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης.
Για το πείραμα LX-2, τα δείγματα ελέγχθηκαν ως προς την κανονικότητα χρησιμοποιώντας τη δοκιμή D'Agostino-Pearson. Τα δεδομένα ελήφθησαν από τουλάχιστον τρία βιολογικά αντίγραφα και υποβλήθηκαν σε μονόδρομη ανάλυση ANOVA με δοκιμή Bonferroni post hoc. Μια τιμή p μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) και ο αριθμός των πειραμάτων υποδεικνύεται σε κάθε σχήμα. Όλες οι αναλύσεις και τα γραφήματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το στατιστικό λογισμικό GraphPad Prism 8 για Windows (GraphPad Software Inc., έκδοση 8.4.3, Σαν Ντιέγκο, ΗΠΑ).
Αρχικά, διερευνήσαμε τη συσχέτιση των επιπέδων IPA στον ορό με τα μεταγραφήματα ήπατος, ολόκληρου του σώματος και μιτοχονδρίων. Στο συνολικό προφίλ μεταγραφών, το ισχυρότερο γονίδιο που συσχετίστηκε με τα επίπεδα IPA στον ορό ήταν το MAPKAPK3 (FDR = 0,0077· πρωτεϊνική κινάση ενεργοποιούμενη από μιτογόνο κινάση 3)· στο προφίλ μεταγραφών που σχετίζεται με μιτοχόνδρια, το ισχυρότερο σχετιζόμενο γονίδιο ήταν το AKT1 (FDR = 0,7621· AKT σερίνη/θρεονίνη κινάση 1) (Πρόσθετο αρχείο 1 και Πρόσθετο αρχείο 2).
Στη συνέχεια αναλύσαμε τα συνολικά αντίγραφα (n = 268, p < 0,01) και τα αντίγραφα που σχετίζονται με τα μιτοχόνδρια (n = 119, p < 0,05), προσδιορίζοντας τελικά την απόπτωση ως την πιο σημαντική κανονική οδό (p = 0,0089). Για τα μιτοχονδριακά αντίγραφα που σχετίζονται με τα επίπεδα IPA στον ορό, εστιάσαμε στην απόπτωση (FDR = 0,00001), τη μιτοφαγία (FDR = 0,00029) και τις οδούς σηματοδότησης TNF (FDR = 0,000006) (Σχήμα 1Α, Πίνακας 2 και Συμπληρωματικά Σχήματα 1Α-Β).
Επικαλυπτόμενη ανάλυση καθολικών μεταγραφών που σχετίζονται με μιτοχόνδρια και μεθυλίωσης DNA στο ανθρώπινο ήπαρ σε σχέση με τα επίπεδα IPA στον ορό. Το A αντιπροσωπεύει 268 καθολικά μεταγραφήματα, 119 μεταγραφές που σχετίζονται με μιτοχόνδρια και μεθυλιωμένα μεταγραφήματα DNA που είναι χαρτογραφημένα σε 3092 θέσεις CpG που σχετίζονται με τα επίπεδα IPA στον ορό (τιμές p < 0,01 για καθολικά μεταγραφήματα και μεθυλιωμένο DNA, και τιμές p < 0,05 για μιτοχονδριακά μεταγραφήματα). Τα κύρια επικαλυπτόμενα μεταγραφήματα εμφανίζονται στη μέση (AKT1 και YKT6). Β Ο χάρτης αλληλεπίδρασης των 13 γονιδίων με την υψηλότερη βαθμολογία αλληλεπίδρασης (0,900) με άλλα γονίδια κατασκευάστηκε από τα 56 επικαλυπτόμενα γονίδια (περιοχή μαύρης γραμμής) που συσχετίστηκαν σημαντικά με τα επίπεδα IPA στον ορό χρησιμοποιώντας το διαδικτυακό εργαλείο StringDB. Πράσινο: Γονίδια που χαρτογραφήθηκαν στο κυτταρικό συστατικό της Οντολογίας Γονιδίων (GO): τα μιτοχόνδρια (GO:0005739). Η AKT1 είναι η πρωτεΐνη με την υψηλότερη βαθμολογία (0,900) για αλληλεπιδράσεις με άλλες πρωτεΐνες με βάση τα δεδομένα (βάσει εξόρυξης κειμένου, πειραμάτων, βάσεων δεδομένων και συνέκφρασης). Οι κόμβοι δικτύου αντιπροσωπεύουν πρωτεΐνες και οι ακμές αντιπροσωπεύουν συνδέσεις μεταξύ πρωτεϊνών.
Δεδομένου ότι οι μεταβολίτες του εντερικού μικροβιώματος μπορούν να ρυθμίσουν την επιγενετική σύνθεση μέσω της μεθυλίωσης του DNA [32], διερευνήσαμε εάν τα επίπεδα IPA στον ορό συσχετίζονταν με τη μεθυλίωση του DNA του ήπατος. Διαπιστώσαμε ότι οι δύο κύριες θέσεις μεθυλίωσης που συσχετίζονταν με τα επίπεδα IPA στον ορό ήταν κοντά στην πλούσια σε προλίνη-σερίνη περιοχή 3 (C19orf55) και στο μέλος 6 της οικογένειας πρωτεϊνών θερμικού σοκ Β (μικρό) (HSPB6) (Πρόσθετο αρχείο 3). Η μεθυλίωση του DNA της 4350 CpG (p < 0,01) συσχετίστηκε με τα επίπεδα IPA στον ορό και ήταν εμπλουτισμένη με οδούς ρύθμισης της μακροζωίας (p = 0,006) (Σχήμα 1Α, Πίνακας 2 και Συμπληρωματικό Σχήμα 1C).
Για να κατανοήσουμε τους βιολογικούς μηχανισμούς που διέπουν τις συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων IPA στον ορό, των συνολικών μεταγραφών, των μεταγραφών που σχετίζονται με τα μιτοχόνδρια και της μεθυλίωσης του DNA στο ανθρώπινο ήπαρ, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση επικάλυψης των γονιδίων που εντοπίστηκαν στην προηγούμενη ανάλυση οδών (Σχήμα 1Α). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης εμπλουτισμού οδών των 56 επικαλυπτόμενων γονιδίων (εντός της μαύρης γραμμής στο Σχήμα 1Α) έδειξαν ότι η οδός απόπτωσης (p = 0,00029) ανέδειξε δύο γονίδια κοινά και στις τρεις αναλύσεις: AKT1 και YKT6 (ομόλογο YKT6 v-SNARE), όπως φαίνεται στο διάγραμμα Venn (Συμπληρωματικό Σχήμα 2 και Σχήμα 1Α). Είναι ενδιαφέρον ότι διαπιστώσαμε ότι τα AKT1 (cg19831386) και YKT6 (cg24161647) συσχετίστηκαν θετικά με τα επίπεδα IPA στον ορό (Πρόσθετο αρχείο 3). Για να εντοπίσουμε πιθανές αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών μεταξύ γονιδιακών προϊόντων, επιλέξαμε 13 γονίδια με την υψηλότερη βαθμολογία κοινής περιοχής (0,900) μεταξύ 56 επικαλυπτόμενων γονιδίων ως είσοδο και κατασκευάσαμε έναν χάρτη αλληλεπίδρασης. Σύμφωνα με το επίπεδο εμπιστοσύνης (οριακή εμπιστοσύνη), το γονίδιο AKT1 με την υψηλότερη βαθμολογία (0,900) ήταν στην κορυφή (Σχήμα 1Β).
Με βάση την ανάλυση της οδού, διαπιστώσαμε ότι η απόπτωση ήταν η κύρια οδός, επομένως διερευνήσαμε εάν η θεραπεία με IPA θα επηρέαζε την απόπτωση των HSCs in vitro. Προηγουμένως είχαμε δείξει ότι διαφορετικές δόσεις IPA (10 μM, 100 μM και 1 mM) ήταν μη τοξικές για τα κύτταρα LX-2 [15]. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η θεραπεία με IPA στα 10 μM και 100 μM αύξησε τον αριθμό των βιώσιμων και νεκρωτικών κυττάρων. Ωστόσο, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σε συγκέντρωση IPA 1 mM, ενώ ο ρυθμός νέκρωσης των κυττάρων παρέμεινε αμετάβλητος (Σχήμα 2Α, Β). Στη συνέχεια, για να βρούμε τη βέλτιστη συγκέντρωση για την πρόκληση απόπτωσης σε κύτταρα LX-2, δοκιμάσαμε 10 μM, 100 μM και 1 mM IPA για 24 ώρες (Σχήμα 2Α-Ε και Συμπληρωματικό Σχήμα 3Α-Β). Είναι ενδιαφέρον ότι το IPA 10 μM και 100 μM μείωσε τον ρυθμό απόπτωσης (%), ωστόσο, το IPA 1 mM αύξησε την όψιμη απόπτωση και τον ρυθμό απόπτωσης (%) σε σύγκριση με τον έλεγχο και ως εκ τούτου επιλέχθηκε για περαιτέρω πειράματα (Σχήματα 2Α-Δ).
Η IPA προκαλεί απόπτωση των κυττάρων LX-2. Η μέθοδος διπλής χρώσης Annexin V και 7-AAD χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του ρυθμού απόπτωσης και της μορφολογίας των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα BA επωάστηκαν με 10 μM, 100 μM και 1 mM IPA για 24 ώρες ή με F–H TGF-β1 (5 ng/ml) και 1 mM IPA σε μέσο χωρίς ορό για 24 ώρες. A: ζωντανά κύτταρα (Annexin V -/ 7AAD-). B: νεκρωτικά κύτταρα (Annexin V -/ 7AAD+). C, F: πρώιμα (Annexin V +/ 7AAD-). D, G: όψιμα (Annexin V+/7AAD.+). E, H: ποσοστό των συνολικών πρώιμων και όψιμων αποπτωτικών κυττάρων σε ρυθμό απόπτωσης (%). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD, n = 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι στατιστικές συγκρίσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA με δοκιμή Bonferroni post hoc. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Όπως έχουμε δείξει προηγουμένως, 5 ng/ml TGF-β1 μπορούν να προκαλέσουν ενεργοποίηση των HSC αυξάνοντας την έκφραση των κλασικών γονιδίων-δεικτών [15]. Τα κύτταρα LX-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5 ng/ml TGF-β1 και 1 mM IPA σε συνδυασμό (Εικ. 2E-H). Η αγωγή με TGF-β1 δεν άλλαξε τον ρυθμό απόπτωσης, ωστόσο, η ταυτόχρονη αγωγή με IPA αύξησε την όψιμη απόπτωση και τον ρυθμό απόπτωσης (%) σε σύγκριση με τη αγωγή με TGF-β1 (Εικ. 2E-H). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι 1 mM IPA μπορεί να προάγει την απόπτωση σε κύτταρα LX-2 ανεξάρτητα από την επαγωγή του TGF-β1.
Διερευνήσαμε περαιτέρω την επίδραση της IPA στην μιτοχονδριακή αναπνοή σε κύτταρα LX-2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 1 mM IPA μείωσε τις παραμέτρους του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (OCR): μη μιτοχονδριακή αναπνοή, βασική και μέγιστη αναπνοή, διαρροή πρωτονίων και παραγωγή ATP σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 3Α, Β), ενώ ο δείκτης βιοενεργειακής υγείας (BHI) δεν άλλαξε.
Η IPA μειώνει τη μιτοχονδριακή αναπνοή στα κύτταρα LX-2. Η καμπύλη μιτοχονδριακής αναπνοής (OCR) παρουσιάζεται ως παράμετροι μιτοχονδριακής αναπνοής (μη μιτοχονδριακή αναπνοή, βασική αναπνοή, μέγιστη αναπνοή, διαρροή πρωτονίων, παραγωγή ATP, SRC και BHI). Τα κύτταρα A και B επωάστηκαν με 10 μM, 100 μM και 1 mM IPA για 24 ώρες, αντίστοιχα. Τα κύτταρα C και D επωάστηκαν με TGF-β1 (5 ng/ml) και 1 mM IPA σε μέσο χωρίς ορό για 24 ώρες, αντίστοιχα. Όλες οι μετρήσεις ομαλοποιήθηκαν ως προς την περιεκτικότητα σε DNA χρησιμοποιώντας το κιτ CyQuant. BHI: δείκτης βιοενεργειακής υγείας. SRC: ικανότητα αναπνευστικού αποθέματος. OCR: ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD), n = 5 ανεξάρτητα πειράματα. Οι στατιστικές συγκρίσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και δοκιμή Bonferroni post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; και ***p < 0,001
Για να αποκτήσουμε μια πιο ολοκληρωμένη κατανόηση της επίδρασης της IPA στο βιοενεργειακό προφίλ των κυττάρων LX-2 που ενεργοποιούνται από τον TGF-β1, αναλύσαμε την οξειδωτική φωσφορυλίωση των μιτοχονδρίων με OCR (Εικ. 3C,D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με TGF-β1 θα μπορούσε να μειώσει τη μέγιστη αναπνοή, την αναπνευστική εφεδρική ικανότητα (SRC) και την BHI σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 3C,D). Επιπλέον, η συνδυαστική θεραπεία μείωσε τη βασική αναπνοή, τη διαρροή πρωτονίων και την παραγωγή ATP, αλλά η SRC και η BHI ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες που έλαβαν θεραπεία με TGF-β1 (Εικ. 3C,D).
Πραγματοποιήσαμε επίσης τη «Δοκιμή Φαινότυπου Κυτταρικής Ενέργειας» που παρέχεται από το λογισμικό Seahorse (Συμπληρωματικό Σχήμα 4Α-Δ). Όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 3Β, τα μεταβολικά δυναμικά τόσο του OCR όσο και του ECAR μειώθηκαν μετά τη θεραπεία με TGF-β1, ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε διαφορά στις ομάδες συνδυασμού και θεραπείας με IPA σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Επιπλέον, τόσο τα βασικά επίπεδα όσο και τα επίπεδα στρες του OCR μειώθηκαν μετά τον συνδυασμό και τη θεραπεία με IPA σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα 4C). Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήθηκε παρόμοιο μοτίβο με τη συνδυαστική θεραπεία, όπου δεν παρατηρήθηκε καμία αλλαγή στα βασικά επίπεδα και τα επίπεδα στρες του ECAR σε σύγκριση με τη θεραπεία με TGF-β1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 4C). Στα HSCs, η μείωση της μιτοχονδριακής οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και η ικανότητα της συνδυαστικής θεραπείας να αποκαθιστά την SCR και την BHI μετά την έκθεση σε θεραπεία με TGF-β1 δεν άλλαξαν το μεταβολικό δυναμικό (OCR και ECAR). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η IPA μπορεί να μειώσει τη βιοενεργειακή δράση στα HSC, υποδηλώνοντας ότι η IPA μπορεί να προκαλέσει ένα χαμηλότερο ενεργειακό προφίλ που μετατοπίζει τον φαινότυπο HSC προς την απενεργοποίηση (Συμπληρωματικό Σχήμα 4D).
Η επίδραση της IPA στη μιτοχονδριακή δυναμική διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας τρισδιάστατη ποσοτικοποίηση της μιτοχονδριακής μορφολογίας και των συνδέσεων δικτύου, καθώς και χρώση MTR (Σχήμα 4 και Συμπληρωματικό Σχήμα 5). Το Σχήμα 4 δείχνει ότι, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η θεραπεία με TGF-β1 μείωσε τη μέση επιφάνεια, τον αριθμό των διακλαδώσεων, το συνολικό μήκος των διακλαδώσεων και τον αριθμό των συνδέσεων διακλαδώσεων (Σχήμα 4Α και Β) και άλλαξε την αναλογία των μιτοχονδρίων από σφαιρική σε ενδιάμεση μορφολογία (Σχήμα 4C). Μόνο η θεραπεία με IPA μείωσε τον μέσο μιτοχονδριακό όγκο και άλλαξε την αναλογία των μιτοχονδρίων από σφαιρική σε ενδιάμεση μορφολογία σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 4Α). Αντίθετα, η σφαιρικότητα, το μέσο μήκος των διακλαδώσεων και η μιτοχονδριακή δραστηριότητα που αξιολογήθηκαν με MTR που εξαρτάται από το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Σχήμα 4Α και Ε) παρέμειναν αμετάβλητες και αυτές οι παράμετροι δεν διέφεραν μεταξύ των ομάδων. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία με TGF-β1 και IPA φαίνεται να τροποποιεί το σχήμα και το μέγεθος των μιτοχονδρίων, καθώς και την πολυπλοκότητα του δικτύου σε ζωντανά κύτταρα LX-2.
Η IPA μεταβάλλει τη μιτοχονδριακή δυναμική και την αφθονία του μιτοχονδριακού DNA στα κύτταρα LX-2. Α. Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές εικόνες ζωντανών κυττάρων LX-2 που επωάστηκαν με TGF-β1 (5 ng/ml) και 1 mM IPA για 24 ώρες σε μέσο χωρίς ορό, που δείχνουν μιτοχονδριακά δίκτυα χρωματισμένα με Mitotracker™ Red CMXRos και πυρήνες χρωματισμένους μπλε με DAPI. Όλα τα δεδομένα περιείχαν τουλάχιστον 15 εικόνες ανά ομάδα. Λήφθηκαν 10 εικόνες Z-stack για κάθε τύπο δείγματος. Κάθε αλληλουχία άξονα Z περιείχε 30 τομές, η καθεμία με πάχος 9,86 μm. Γραμμή κλίμακας: 10 μm. Β. Αντιπροσωπευτικά αντικείμενα (μόνο μιτοχόνδρια) που αναγνωρίστηκαν εφαρμόζοντας προσαρμοστική κατώφλι στην εικόνα. Πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση και σύγκριση των μιτοχονδριακών μορφολογικών συνδέσεων δικτύου για όλα τα κύτταρα σε κάθε ομάδα. Γ. Συχνότητα των λόγων σχήματος μιτοχονδρίων. Τιμές κοντά στο 0 υποδεικνύουν σφαιρικά σχήματα και τιμές κοντά στο 1 υποδεικνύουν νηματοειδή σχήματα. Δ Η περιεκτικότητα σε μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Ε Η ανάλυση Mitotracker™ Red CMXRos πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής (30.000 συμβάντα) όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση, n = 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι στατιστικές συγκρίσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και δοκιμή Bonferroni post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Στη συνέχεια, αναλύσαμε την περιεκτικότητα σε μιτοχονδριακό DNA στα κύτταρα LX-2 ως δείκτη του αριθμού των μιτοχονδρίων. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η περιεκτικότητα σε μιτοχονδριακό DNA αυξήθηκε στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με TGF-β1 (Σχήμα 4D). Σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε θεραπεία με TGF-β1, η περιεκτικότητα σε μιτοχονδριακό DNA μειώθηκε στην ομάδα συνδυαστικής θεραπείας (Σχήμα 4D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η IPA μπορεί να μειώσει την περιεκτικότητα σε μιτοχονδριακό DNA και πιθανώς τον αριθμό των μιτοχονδρίων, καθώς και την μιτοχονδριακή αναπνοή (Σχήμα 3C). Επιπλέον, η IPA φάνηκε να μειώνει την περιεκτικότητα σε μιτοχονδριακό DNA στη συνδυαστική θεραπεία, αλλά δεν επηρέασε τη μιτοχονδριακή δραστηριότητα που προκαλείται από την MTR (Σχήματα 4A–C).
Διερευνήσαμε τη συσχέτιση της IPA με τα επίπεδα mRNA γονιδίων που σχετίζονται με την ίνωση, την απόπτωση, την επιβίωση και τη μιτοχονδριακή δυναμική σε κύτταρα LX-2 (Σχήμα 5A–D). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η ομάδα που έλαβε θεραπεία με TGF-β1 έδειξε αυξημένη έκφραση γονιδίων όπως η αλυσίδα α2 κολλαγόνου τύπου Ι (COL1A2), η α-ακτίνη λείων μυών (αSMA), η μεταλλοπρωτεϊνάση μήτρας 2 (MMP2), ο αναστολέας ιστού της μεταλλοπρωτεϊνάσης 1 (TIMP1) και το γονίδιο τύπου δυναμίνης 1 (DRP1), υποδεικνύοντας αυξημένη ίνωση και ενεργοποίηση. Επιπλέον, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η θεραπεία με TGF-β1 μείωσε τα επίπεδα mRNA του πυρηνικού υποδοχέα πρεγνάνης Χ (PXR), της κασπάσης 8 (CASP8), της MAPKAPK3, του αναστολέα του ελαφρού πεπτιδίου Β-κυττάρων, του ενισχυτή του ελαφρού πεπτιδίου του πυρηνικού παράγοντα κ (NFκB1A) και του αναστολέα της υπομονάδας β κινάσης κΒ του πυρηνικού παράγοντα (IKBKB) (Σχήμα 5A–D). Σε σύγκριση με τη θεραπεία με TGF-β1, η συνδυασμένη θεραπεία με TGF-β1 και IPA μείωσε την έκφραση των COL1A2 και MMP2, αλλά αύξησε τα επίπεδα mRNA των PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β και IKBKB. Η θεραπεία με IPA μείωσε σημαντικά την έκφραση των MMP2, Bcl-2-associated protein X (BAX), AKT1, optic atrophy protein 1 (OPA1) και mitochondrial fusion protein 2 (MFN2), ενώ η έκφραση των CASP8, NFκB1A, NFκB1B και IKBKB αυξήθηκε σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, δεν βρέθηκε διαφορά στην έκφραση της κασπάσης-3 (CASP3), του apoptotic peptidase activation factor 1 (APAF1), της mitochondrial fusion protein 1 (MFN1) και της fission protein 1 (FIS1). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία με IPA τροποποιεί την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ίνωση, την απόπτωση, την επιβίωση και τη μιτοχονδριακή δυναμική. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η θεραπεία με IPA μειώνει την ίνωση στα κύτταρα LX-2. Ταυτόχρονα, διεγείρει την επιβίωση μετατοπίζοντας τον φαινότυπο προς την απενεργοποίηση.
Η IPA ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων ινοβλαστών, αποπτωτικών, βιωσιμότητας και μιτοχονδριακής δυναμικής σε κύτταρα LX-2. Τα ιστογράμματα εμφανίζουν την έκφραση mRNA σε σχέση με τον ενδογενή έλεγχο (RPLP0 ή PPIA) μετά από επαγωγή κυττάρων LX-2 με TGF-β1 και IPA σε μέσο χωρίς ορό για 24 ώρες. Το A υποδεικνύει ινοβλάστες, το B υποδεικνύει αποπτωτικά κύτταρα, το C υποδεικνύει επιζώντα κύτταρα και το D υποδεικνύει την έκφραση γονιδίων μιτοχονδριακής δυναμικής. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD), n = 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι στατιστικές συγκρίσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και δοκιμή Bonferroni post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Στη συνέχεια, οι αλλαγές στο μέγεθος των κυττάρων (FSC-H) και η κυτταροπλασματική πολυπλοκότητα (SSC-H) αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 6Α,Β) και οι αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων μετά την αγωγή με IPA αξιολογήθηκαν με ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (TEM) και μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (Συμπληρωματικό Σχήμα 6Α-Β). Όπως αναμενόταν, τα κύτταρα στην ομάδα που έλαβε αγωγή με TGF-β1 αυξήθηκαν σε μέγεθος σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 6Α,Β), δείχνοντας την κλασική επέκταση του τραχιού ενδοπλασματικού δικτύου (ER*) και των φαγολυσοσωμάτων (P), υποδεικνύοντας ενεργοποίηση αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων (HSC) (Συμπληρωματικό Σχήμα 6Α). Ωστόσο, σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε αγωγή με TGF-β1, το μέγεθος των κυττάρων, η κυτταροπλασματική πολυπλοκότητα (Σχήμα 6Α,Β) και η περιεκτικότητα σε ER* μειώθηκαν στην ομάδα συνδυαστικής αγωγής TGF-β1 και IPA (Συμπληρωματικό Σχήμα 6Α). Επιπλέον, η θεραπεία με IPA μείωσε το μέγεθος των κυττάρων, την κυτταροπλασματική πολυπλοκότητα (Εικόνες 6Α, Β), την περιεκτικότητα σε P και ER* (Συμπληρωματικό Σχήμα 6Α) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Επιπλέον, η περιεκτικότητα σε αποπτωτικά κύτταρα αυξήθηκε μετά από 24 ώρες θεραπείας με IPA σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (λευκά βέλη, Συμπληρωματικό Σχήμα 6Β). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι 1 mM IPA μπορεί να διεγείρει την απόπτωση των HSC και να αντιστρέψει τις αλλαγές στις μορφολογικές παραμέτρους των κυττάρων που προκαλούνται από τον TGF-β1, ρυθμίζοντας έτσι το μέγεθος και την πολυπλοκότητα των κυττάρων, οι οποίες μπορεί να σχετίζονται με την απενεργοποίηση των HSC.
Η IPA μεταβάλλει το μέγεθος των κυττάρων και την κυτταροπλασματική πολυπλοκότητα στα κύτταρα LX-2. Αντιπροσωπευτικές εικόνες ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής. Η ανάλυση χρησιμοποίησε μια στρατηγική gating ειδική για τα κύτταρα LX-2: SSC-A/FSC-A για τον ορισμό του κυτταρικού πληθυσμού, FSC-H/FSC-A για την αναγνώριση διπλών κυττάρων και SSC-H/FSC-H για την ανάλυση μεγέθους και πολυπλοκότητας των κυττάρων. Τα κύτταρα επωάστηκαν με TGF-β1 (5 ng/ml) και 1 mM IPA σε μέσο χωρίς ορό για 24 ώρες. Τα κύτταρα LX-2 κατανεμήθηκαν στο κάτω αριστερό τεταρτημόριο (SSC-H-/FSC-H-), στο άνω αριστερό τεταρτημόριο (SSC-H+/FSC-H-), στο κάτω δεξί τεταρτημόριο (SSC-H-/FSC-H+) και στο άνω δεξί τεταρτημόριο (SSC-H+/FSC-H+) για την ανάλυση μεγέθους και κυτταροπλασματικής πολυπλοκότητας των κυττάρων. Β. Η μορφολογία των κυττάρων αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας FSC-H (προς τα εμπρός σκέδαση, μέγεθος κυττάρου) και SSC-H (πλάγια σκέδαση, κυτταροπλασματική πολυπλοκότητα) (30.000 συμβάντα). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση, n = 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι στατιστικές συγκρίσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και δοκιμή Bonferroni post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 και ****p < 0,0001
Οι μεταβολίτες του εντέρου, όπως η IPA, έχουν γίνει ένα καυτό θέμα έρευνας, υποδηλώνοντας ότι νέοι στόχοι μπορεί να ανακαλυφθούν στο μικροβίωμα του εντέρου. Είναι επομένως ενδιαφέρον ότι η IPA, ένας μεταβολίτης που έχουμε συνδέσει με την ηπατική ίνωση στους ανθρώπους [15], έχει αποδειχθεί ότι είναι μια πιθανή αντιινωτική ένωση σε ζωικά μοντέλα [13, 14]. Εδώ, καταδεικνύουμε για πρώτη φορά μια συσχέτιση μεταξύ της IPA ορού και της παγκόσμιας ηπατικής μεταγραφωμικής και της μεθυλίωσης του DNA σε παχύσαρκα άτομα χωρίς διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ2), επισημαίνοντας την απόπτωση, τη μιτοφαγία και τη μακροζωία, καθώς και ένα πιθανό υποψήφιο γονίδιο AKT1 που ρυθμίζει την ηπατική ομοιόσταση. Μια άλλη καινοτομία της μελέτης μας είναι ότι καταδείξαμε την αλληλεπίδραση της θεραπείας με IPA με την απόπτωση, τη μορφολογία των κυττάρων, τη μιτοχονδριακή βιοενέργεια και τη δυναμική στα κύτταρα LX-2, υποδεικνύοντας ένα χαμηλότερο ενεργειακό φάσμα που μετατοπίζει τον φαινότυπο HSC προς την απενεργοποίηση, καθιστώντας την IPA πιθανό υποψήφιο για τη βελτίωση της ηπατικής ίνωσης.
Διαπιστώσαμε ότι η απόπτωση, η μιτοφαγία και η μακροζωία ήταν οι πιο σημαντικές κανονικές οδοί εμπλουτισμένες σε ηπατικά γονίδια που σχετίζονται με την κυκλοφορούσα IPA ορού. Η διαταραχή του συστήματος ελέγχου ποιότητας των μιτοχονδρίων (MQC) μπορεί να οδηγήσει σε μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, μιτοφαγία και απόπτωση, προωθώντας έτσι την εμφάνιση MASLD [33, 34]. Επομένως, μπορούμε να υποθέσουμε ότι η IPA μπορεί να εμπλέκεται στη διατήρηση της κυτταρικής δυναμικής και της μιτοχονδριακής ακεραιότητας μέσω της απόπτωσης, της μιτοφαγίας και της μακροζωίας στο ήπαρ. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι δύο γονίδια ήταν κοινά και στις τρεις δοκιμασίες: το YKT6 και το AKT1. Αξίζει να σημειωθεί ότι το YKT6 είναι μια πρωτεΐνη SNARE που εμπλέκεται στη διαδικασία σύντηξης της κυτταρικής μεμβράνης. Παίζει ρόλο στην αυτοφαγία και τη μιτοφαγία σχηματίζοντας ένα σύμπλεγμα έναρξης με STX17 και SNAP29 στο αυτοφαγόσωμα, προωθώντας έτσι τη σύντηξη αυτοφαγοσωμάτων και λυσοσωμάτων [35]. Επιπλέον, η απώλεια της λειτουργίας του YKT6 οδηγεί σε μειωμένη μιτοφαγία[36], ενώ η ανοδική ρύθμιση του YKT6 σχετίζεται με την εξέλιξη του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC), δείχνοντας αυξημένη κυτταρική επιβίωση[37]. Από την άλλη πλευρά, το AKT1 είναι το πιο σημαντικό αλληλεπιδρών γονίδιο και παίζει σημαντικό ρόλο στις ηπατικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της σηματοδοτικής οδού PI3K/AKT, του κυτταρικού κύκλου, της κυτταρικής μετανάστευσης, του πολλαπλασιασμού, της εστιακής προσκόλλησης, της μιτοχονδριακής λειτουργίας και της έκκρισης κολλαγόνου[38-40]. Η ενεργοποιημένη σηματοδοτική οδός PI3K/AKT μπορεί να ενεργοποιήσει τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs), τα οποία είναι τα κύτταρα που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή εξωκυτταρικής μήτρας (ECM), και η δυσλειτουργία της μπορεί να συμβάλει στην εμφάνιση και εξέλιξη της ηπατικής ίνωσης[40]. Επιπλέον, το AKT είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες επιβίωσης των κυττάρων που αναστέλλει την απόπτωση των κυττάρων που εξαρτάται από το p53, και η ενεργοποίηση του AKT μπορεί να σχετίζεται με την αναστολή της απόπτωσης των ηπατικών κυττάρων[41, 42]. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν υποδηλώνουν ότι η IPA μπορεί να εμπλέκεται στην απόπτωση που σχετίζεται με τα μιτοχόνδρια του ήπατος, επηρεάζοντας την απόφαση των ηπατοκυττάρων μεταξύ της εισόδου σε απόπτωση και της επιβίωσης. Αυτές οι επιδράσεις μπορεί να ρυθμίζονται από τα υποψήφια γονίδια AKT και/ή YKT6, τα οποία είναι κρίσιμα για την ομοιόσταση του ήπατος.
Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι 1 mM IPA προκάλεσε απόπτωση και μειωμένη μιτοχονδριακή αναπνοή σε κύτταρα LX-2 ανεξάρτητα από τη θεραπεία με TGF-β1. Αξίζει να σημειωθεί ότι η απόπτωση είναι μια σημαντική οδός για την επίλυση της ίνωσης και την ενεργοποίηση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων (HSC), και είναι επίσης ένα βασικό γεγονός στην αναστρέψιμη φυσιολογική απόκριση της ίνωσης του ήπατος [4, 43]. Επιπλέον, η αποκατάσταση του BHI σε κύτταρα LX-2 μετά από συνδυαστική θεραπεία παρείχε νέες γνώσεις σχετικά με τον πιθανό ρόλο του IPA στη ρύθμιση της μιτοχονδριακής βιοενεργειακής ικανότητας. Υπό συνθήκες ηρεμίας και ανενεργού κατάστασης, τα αιμοποιητικά κύτταρα χρησιμοποιούν κανονικά τη μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση για την παραγωγή ATP και έχουν χαμηλή μεταβολική δραστηριότητα. Από την άλλη πλευρά, η ενεργοποίηση των HSC ενισχύει τη μιτοχονδριακή αναπνοή και βιοσύνθεση για να αντισταθμίσει τις ενεργειακές απαιτήσεις εισόδου στη γλυκολυτική κατάσταση [44]. Το γεγονός ότι το IPA δεν επηρέασε το μεταβολικό δυναμικό και το ECAR υποδηλώνει ότι η γλυκολυτική οδός έχει μικρότερη προτεραιότητα. Ομοίως, μια άλλη μελέτη έδειξε ότι 1 mM IPA ήταν σε θέση να τροποποιήσει τη δραστηριότητα της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας σε καρδιομυοκύτταρα, κυτταρική σειρά ανθρώπινων ηπατοκυττάρων (Huh7) και ενδοθηλιακά κύτταρα ανθρώπινης ομφαλικής φλέβας (HUVEC). Ωστόσο, δεν βρέθηκε καμία επίδραση της IPA στη γλυκόλυση στα καρδιομυοκύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η IPA μπορεί να επηρεάσει τη βιοενεργειακή ικανότητα άλλων κυτταρικών τύπων [45]. Επομένως, εικάζουμε ότι 1 mM IPA μπορεί να δρα ως ήπιος χημικός αποσυνδέτης, καθώς μπορεί να μειώσει σημαντικά την έκφραση των ινωδογόνων γονιδίων, τη μορφολογία των κυττάρων και τη βιοενεργειακή ικανότητα των μιτοχονδρίων χωρίς να αλλάξει την ποσότητα του μιτοχονδριακού DNA [46]. Οι μιτοχονδριακοί αποσυνδέτες μπορούν να αναστείλουν την ίνωση που προκαλείται από καλλιέργεια και την ενεργοποίηση των HSC [47] και να μειώσουν την παραγωγή μιτοχονδριακού ATP που ρυθμίζεται ή προκαλείται από ορισμένες πρωτεΐνες όπως οι πρωτεΐνες αποσύνδεσης (UCP) ή η τρανσλοκάση αδενίνης νουκλεοτιδίων (ANT). Ανάλογα με τον τύπο κυττάρου, αυτό το φαινόμενο μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από την απόπτωση ή/και να προάγει την απόπτωση [46]. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί ο ρόλος της IPA ως μιτοχονδριακού αποσυνδέτη στην απενεργοποίηση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων.
Στη συνέχεια, διερευνήσαμε εάν οι αλλαγές στην μιτοχονδριακή αναπνοή αντικατοπτρίζονται στη μιτοχονδριακή μορφολογία στα ζωντανά κύτταρα LX-2. Είναι ενδιαφέρον ότι η θεραπεία με TGF-β1 μεταβάλλει την αναλογία των μιτοχονδρίων από σφαιρική σε ενδιάμεση, με μειωμένη μιτοχονδριακή διακλάδωση και αυξημένη έκφραση του DRP1, ενός βασικού παράγοντα στη μιτοχονδριακή σχάση [48]. Επιπλέον, ο κατακερματισμός των μιτοχονδρίων σχετίζεται με τη συνολική πολυπλοκότητα του δικτύου και η μετάβαση από τη σύντηξη στη σχάση είναι κρίσιμη για την ενεργοποίηση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων (HSC), ενώ η αναστολή της μιτοχονδριακής σχάσης οδηγεί σε απόπτωση των HSC [49]. Έτσι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η θεραπεία με TGF-β1 μπορεί να προκαλέσει μείωση της πολυπλοκότητας του μιτοχονδριακού δικτύου με μειωμένη διακλάδωση, η οποία είναι πιο συχνή στη μιτοχονδριακή σχάση που σχετίζεται με ενεργοποιημένα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (HSC). Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η IPA θα μπορούσε να αλλάξει την αναλογία των μιτοχονδρίων από σφαιρικό σε ενδιάμεσο σχήμα, μειώνοντας έτσι την έκφραση των OPA1 και MFN2. Μελέτες έχουν δείξει ότι η μείωση της ρύθμισης του OPA1 θα μπορούσε να προκαλέσει μείωση στο δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης και να πυροδοτήσει την απόπτωση των κυττάρων [50]. Η MFN2 είναι γνωστό ότι μεσολαβεί στη μιτοχονδριακή σύντηξη και απόπτωση [51]. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν υποδηλώνουν ότι η επαγωγή των κυττάρων LX-2 από τον TGF-β1 ή/και την IPA φαίνεται να τροποποιεί το σχήμα και το μέγεθος των μιτοχονδρίων, καθώς και την κατάσταση ενεργοποίησης και την πολυπλοκότητα του δικτύου.
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία με TGFβ-1 και IPA θα μπορούσε να μειώσει τις παραμέτρους του mtDNA και της κυτταρικής μορφολογίας ρυθμίζοντας την έκφραση mRNA των γονιδίων ίνωσης, απόπτωσης και επιβίωσης σε κύτταρα που αποφεύγουν την απόπτωση. Πράγματι, η IPA μείωσε το επίπεδο έκφρασης mRNA του AKT1 και σημαντικών γονιδίων ίνωσης όπως τα COL1A2 και MMP2, αλλά αύξησε το επίπεδο έκφρασης του CASP8, το οποίο σχετίζεται με την απόπτωση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι μετά τη θεραπεία με IPA, η έκφραση BAX μειώθηκε και η έκφραση mRNA των υπομονάδων της οικογένειας TIMP1, BCL-2 και NF-κB αυξήθηκε, υποδηλώνοντας ότι η IPA θα μπορούσε να διεγείρει σήματα επιβίωσης σε αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (HSCs) που αποφεύγουν την απόπτωση. Αυτά τα μόρια μπορεί να λειτουργούν ως σήματα προ-επιβίωσης σε ενεργοποιημένα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα, τα οποία μπορεί να σχετίζονται με αυξημένη έκφραση αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (όπως η Bcl-2), μειωμένη έκφραση προ-αποπτωτικού BAX και μια σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ TIMP και NF-κB [5, 7]. Η IPA ασκεί τις επιδράσεις της μέσω της PXR και διαπιστώσαμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία με TGF-β1 και IPA αύξησε τα επίπεδα έκφρασης mRNA του PXR, υποδεικνύοντας καταστολή της ενεργοποίησης των HSC. Η ενεργοποιημένη σηματοδότηση PXR είναι γνωστό ότι αναστέλλει την ενεργοποίηση των HSC τόσο in vivo όσο και in vitro [52, 53]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η IPA μπορεί να συμμετέχει στην κάθαρση των ενεργοποιημένων HSCs προάγοντας την απόπτωση, μειώνοντας την ίνωση και τον μιτοχονδριακό μεταβολισμό και ενισχύοντας τα σήματα επιβίωσης, τα οποία είναι τυπικές διεργασίες που μετατρέπουν τον ενεργοποιημένο φαινότυπο HSC σε απενεργοποιημένο. Μια άλλη πιθανή εξήγηση για τον πιθανό μηχανισμό και τον ρόλο της IPA στην απόπτωση είναι ότι σαρώνει τα δυσλειτουργικά μιτοχόνδρια κυρίως μέσω της μιτοφαγίας (ενδογενής οδός) και της εξωγενούς οδού σηματοδότησης TNF (Πίνακας 1), η οποία συνδέεται άμεσα με την οδό σηματοδότησης επιβίωσης NF-κB (Συμπληρωματικό Σχήμα 7). Είναι ενδιαφέρον ότι τα εμπλουτισμένα με IPA γονίδια είναι ικανά να προκαλέσουν προ-αποπτωτικά και προ-επιβιωτικά σήματα στην αποπτωτική οδό [54], γεγονός που υποδηλώνει ότι η IPA μπορεί να προκαλέσει την αποπτωτική οδό ή την επιβίωση αλληλεπιδρώντας με αυτά τα γονίδια. Ωστόσο, ο τρόπος με τον οποίο η IPA προκαλεί απόπτωση ή επιβίωση κατά την ενεργοποίηση των HSC και οι μηχανιστικές της οδοί παραμένουν ασαφείς.
Το IPA είναι ένας μικροβιακός μεταβολίτης που σχηματίζεται από την τρυπτοφάνη της τροφής μέσω του εντερικού μικροβιώματος. Μελέτες έχουν δείξει ότι έχει αντιφλεγμονώδεις, αντιοξειδωτικές και επιγενετικές ρυθμιστικές ιδιότητες στο εντερικό περιβάλλον.[55] Μελέτες έχουν δείξει ότι το IPA μπορεί να τροποποιήσει τη λειτουργία του εντερικού φραγμού και να μειώσει το οξειδωτικό στρες, το οποίο μπορεί να συμβάλλει στις τοπικές φυσιολογικές επιδράσεις του.[56] Στην πραγματικότητα, το IPA μεταφέρεται στα όργανα-στόχους μέσω της κυκλοφορίας του αίματος και, δεδομένου ότι το IPA μοιράζεται μια παρόμοια δομή κύριου μεταβολίτη με την τρυπτοφάνη, τη σεροτονίνη και τα παράγωγα ινδόλης, το IPA ασκεί μεταβολικές δράσεις με αποτέλεσμα ανταγωνιστικές μεταβολικές μοίρες.[52] Το IPA μπορεί να ανταγωνίζεται τους μεταβολίτες που προέρχονται από την τρυπτοφάνη για θέσεις σύνδεσης σε ένζυμα ή υποδοχείς, ενδεχομένως διαταράσσοντας τις φυσιολογικές μεταβολικές οδούς. Αυτό υπογραμμίζει την ανάγκη για περαιτέρω μελέτες σχετικά με τη φαρμακοκινητική και τη φαρμακοδυναμική του για την καλύτερη κατανόηση του θεραπευτικού του παραθύρου.[57] Μένει να δούμε αν αυτό μπορεί επίσης να συμβεί σε αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs).
Αναγνωρίζουμε ότι η μελέτη μας έχει ορισμένους περιορισμούς. Για να εξετάσουμε συγκεκριμένα τις συσχετίσεις που σχετίζονται με την IPA, αποκλείσαμε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔΤ2). Αναγνωρίζουμε ότι αυτό περιορίζει την ευρεία εφαρμογή των ευρημάτων μας σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και προχωρημένη ηπατική νόσο. Αν και η φυσιολογική συγκέντρωση της IPA στον ανθρώπινο ορό είναι 1-10 μM [11, 20], επιλέχθηκε συγκέντρωση 1 mM IPA με βάση την υψηλότερη μη τοξική συγκέντρωση [15] και το υψηλότερο ποσοστό απόπτωσης, χωρίς διαφορά στο ποσοστό του πληθυσμού των νεκρωτικών κυττάρων. Αν και σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν υπερφυσιολογικά επίπεδα IPA, προς το παρόν δεν υπάρχει συναίνεση σχετικά με την αποτελεσματική δόση της IPA [52]. Αν και τα αποτελέσματά μας είναι σημαντικά, η ευρύτερη μεταβολική μοίρα της IPA παραμένει ένα ενεργό πεδίο έρευνας. Επιπλέον, τα ευρήματά μας σχετικά με τη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων IPA στον ορό και της μεθυλίωσης του DNA των ηπατικών μεταγράφων ελήφθησαν όχι μόνο από αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (HSCs) αλλά και από ιστούς ήπατος. Επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε ανθρώπινα κύτταρα LX-2 με βάση τα προηγούμενα ευρήματά μας από την ανάλυση μεταγραφώματος ότι η IPA σχετίζεται με την ενεργοποίηση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων (HSC) [15], και τα HSC είναι τα κύρια κύτταρα που εμπλέκονται στην εξέλιξη της ηπατικής ίνωσης. Το ήπαρ αποτελείται από πολλαπλούς τύπους κυττάρων, επομένως άλλα κυτταρικά μοντέλα, όπως το σύστημα συν-καλλιέργειας ηπατοκυττάρων-HSC-ανοσοποιητικών κυττάρων σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση κασπάσης και τον κατακερματισμό του DNA, καθώς και ο μηχανισμός δράσης, συμπεριλαμβανομένου του επιπέδου πρωτεΐνης, θα πρέπει να ληφθούν υπόψη για τη μελέτη του ρόλου της IPA και της αλληλεπίδρασής της με άλλους τύπους ηπατικών κυττάρων.