Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε την πιο πρόσφατη έκδοση του προγράμματος περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Επιπλέον, για να διασφαλιστεί η συνεχής υποστήριξη, αυτός ο ιστότοπος δεν θα περιλαμβάνει στυλ ή JavaScript.
Το συνθετονικό 3-(ανθρακεν-9-υλ)-2-κυανοακρυλοϋλοχλωρίδιο 4 συντέθηκε και χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση μιας ποικιλίας ετεροκυκλικών ενώσεων υψηλής δραστικότητας μέσω της αντίδρασής του με διάφορα αζωτούχα πυρηνόφιλα. Η δομή κάθε συντιθέμενης ετεροκυκλικής ένωσης χαρακτηρίστηκε διεξοδικά χρησιμοποιώντας φασματοσκοπική και στοιχειακή ανάλυση. Δέκα από τις δεκατρείς νέες ετεροκυκλικές ενώσεις έδειξαν ενθαρρυντική αποτελεσματικότητα έναντι πολυανθεκτικών βακτηρίων (MRSA). Μεταξύ αυτών, οι ενώσεις 6, 7, 10, 13b και 14 έδειξαν την υψηλότερη αντιβακτηριακή δράση με ζώνες αναστολής κοντά στα 4 cm. Ωστόσο, μελέτες μοριακής σύνδεσης αποκάλυψαν ότι οι ενώσεις είχαν διαφορετικές συγγένειες σύνδεσης με την πρωτεΐνη δέσμευσης πενικιλίνης 2a (PBP2a), έναν βασικό στόχο για την αντοχή στο MRSA. Ορισμένες ενώσεις όπως οι 7, 10 και 14 έδειξαν υψηλότερη συγγένεια σύνδεσης και σταθερότητα αλληλεπίδρασης στην ενεργό θέση της PBP2a σε σύγκριση με τον συν-κρυσταλλωμένο υποκαταστάτη κιναζολινόνης. Αντίθετα, οι ενώσεις 6 και 13b είχαν χαμηλότερες βαθμολογίες πρόσδεσης, αλλά εξακολουθούσαν να εμφανίζουν σημαντική αντιβακτηριακή δράση, με την ένωση 6 να έχει τις χαμηλότερες τιμές MIC (9,7 μg/100 μL) και MBC (78,125 μg/100 μL). Η ανάλυση πρόσδεσης αποκάλυψε βασικές αλληλεπιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων των δεσμών υδρογόνου και της π-στοίβαξης, ιδιαίτερα με υπολείμματα όπως Lys 273, Lys 316 και Arg 298, τα οποία αναγνωρίστηκαν ως αλληλεπιδρώντα με τον συν-κρυσταλλωμένο υποκαταστάτη στην κρυσταλλική δομή της PBP2a. Αυτά τα υπολείμματα είναι απαραίτητα για την ενζυμική δράση της PBP2a. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι συντιθέμενες ενώσεις μπορούν να χρησιμεύσουν ως πολλά υποσχόμενα φάρμακα κατά του MRSA, υπογραμμίζοντας τη σημασία του συνδυασμού της μοριακής πρόσδεσης με βιοδοκιμασίες για τον εντοπισμό αποτελεσματικών θεραπευτικών υποψηφίων.
Τα πρώτα χρόνια αυτού του αιώνα, οι ερευνητικές προσπάθειες επικεντρώθηκαν κυρίως στην ανάπτυξη νέων, απλών διαδικασιών και μεθόδων για τη σύνθεση αρκετών καινοτόμων ετεροκυκλικών συστημάτων με αντιμικροβιακή δράση χρησιμοποιώντας άμεσα διαθέσιμα αρχικά υλικά.
Τα ακρυλονιτριλικά τμήματα θεωρούνται σημαντικά αρχικά υλικά για τη σύνθεση πολλών αξιοσημείωτων ετεροκυκλικών συστημάτων επειδή είναι ενώσεις υψηλής δραστικότητας. Επιπλέον, τα παράγωγα του 2-κυανοακρυλοϋλοχλωριδίου έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως τα τελευταία χρόνια για την ανάπτυξη και σύνθεση προϊόντων ζωτικής σημασίας στον τομέα των φαρμακολογικών εφαρμογών, όπως ενδιάμεσα φαρμάκων1,2,3, πρόδρομες ουσίες αντι-HIV, αντιιικών, αντικαρκινικών, αντιβακτηριακών, αντικαταθλιπτικών και αντιοξειδωτικών παραγόντων4,5,6,7,8,9,10. Πρόσφατα, η βιολογική αποτελεσματικότητα του ανθρακενίου και των παραγώγων του, συμπεριλαμβανομένων των αντιβιοτικών, αντικαρκινικών11,12, αντιβακτηριακών13,14,15 και εντομοκτόνων ιδιοτήτων16,17, έχει προσελκύσει μεγάλη προσοχή18,19,20,21. Οι αντιμικροβιακές ενώσεις που περιέχουν τμήματα ακρυλονιτριλίου και ανθρακενίου παρουσιάζονται στα Σχήματα 1 και 2.
Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) (2021), η μικροβιακή αντοχή (AMR) αποτελεί παγκόσμια απειλή για την υγεία και την ανάπτυξη22,23,24,25. Οι ασθενείς δεν μπορούν να θεραπευτούν, με αποτέλεσμα μεγαλύτερη διάρκεια νοσηλείας και την ανάγκη για πιο ακριβά φάρμακα, καθώς και αυξημένη θνησιμότητα και αναπηρία. Η έλλειψη αποτελεσματικών αντιμικροβιακών συχνά οδηγεί σε αποτυχία θεραπείας για διάφορες λοιμώξεις, ειδικά κατά τη διάρκεια χημειοθεραπείας και μεγάλων χειρουργικών επεμβάσεων.
Σύμφωνα με την έκθεση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας για το 2024, ο ανθεκτικός στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA) και το E. coli περιλαμβάνονται στον κατάλογο των παθογόνων οργανισμών προτεραιότητας. Και τα δύο βακτήρια είναι ανθεκτικά σε πολλά αντιβιοτικά, επομένως αντιπροσωπεύουν λοιμώξεις που είναι δύσκολο να αντιμετωπιστούν και να ελεγχθούν, και υπάρχει επείγουσα ανάγκη ανάπτυξης νέων και αποτελεσματικών αντιμικροβιακών ενώσεων για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος. Το ανθρακένιο και τα παράγωγά του είναι γνωστά αντιμικροβιακά που μπορούν να δράσουν τόσο σε Gram-θετικά όσο και σε Gram-αρνητικά βακτήρια. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η σύνθεση ενός νέου παραγώγου που μπορεί να καταπολεμήσει αυτά τα παθογόνα που είναι επικίνδυνα για την υγεία.
Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) αναφέρει ότι πολλά βακτηριακά παθογόνα είναι ανθεκτικά σε πολλά αντιβιοτικά, συμπεριλαμβανομένου του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA), μιας κοινής αιτίας λοίμωξης στην κοινότητα και σε περιβάλλοντα υγειονομικής περίθαλψης. Ασθενείς με λοιμώξεις από MRSA αναφέρεται ότι έχουν 64% υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας από εκείνους με λοιμώξεις ευαίσθητες σε φάρμακα. Επιπλέον, το E. coli αποτελεί παγκόσμιο κίνδυνο επειδή η τελευταία γραμμή άμυνας κατά των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες Enterobacteriaceae (δηλαδή, E. coli) είναι η κολιστίνη, αλλά πρόσφατα έχουν αναφερθεί βακτήρια ανθεκτικά στην κολιστίνη σε αρκετές χώρες. 22,23,24,25
Συνεπώς, σύμφωνα με το Παγκόσμιο Σχέδιο Δράσης για την Αντιμικροβιακή Αντοχή του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας26, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανακάλυψη και σύνθεση νέων αντιμικροβιακών. Το μεγάλο δυναμικό του ανθρακενίου και του ακρυλονιτριλίου ως αντιβακτηριακών27, αντιμυκητιασικών28, αντικαρκινικών29 και αντιοξειδωτικών30 παραγόντων έχει επισημανθεί σε πολυάριθμες δημοσιευμένες εργασίες. Από αυτή την άποψη, μπορεί να ειπωθεί ότι αυτά τα παράγωγα είναι καλοί υποψήφιοι για χρήση κατά του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη σταφυλόκοκκου χρυσίζοντος σταφυλόκοκκου (MRSA).
Προηγούμενες βιβλιογραφικές ανασκοπήσεις μας ώθησαν να συνθέσουμε νέα παράγωγα σε αυτές τις κατηγορίες. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη στόχευε στην ανάπτυξη νέων ετεροκυκλικών συστημάτων που περιέχουν τμήματα ανθρακενίου και ακρυλονιτριλίου, στην αξιολόγηση της αντιμικροβιακής και αντιβακτηριακής τους αποτελεσματικότητας και στη διερεύνηση των πιθανών αλληλεπιδράσεών τους με την πρωτεΐνη δέσμευσης πενικιλίνης 2α (PBP2a) μέσω μοριακής σύνδεσης. Βασιζόμενη στις προηγούμενες μελέτες, η παρούσα μελέτη συνέχισε τη σύνθεση, τη βιολογική αξιολόγηση και την υπολογιστική ανάλυση ετεροκυκλικών συστημάτων για τον εντοπισμό πολλά υποσχόμενων παραγόντων ανθεκτικών στην μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA) με ισχυρή ανασταλτική δράση στην PBP2a31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49.
Η τρέχουσα έρευνά μας επικεντρώνεται στη σύνθεση και την αντιμικροβιακή αξιολόγηση νέων ετεροκυκλικών ενώσεων που περιέχουν τμήματα ανθρακενίου και ακρυλονιτριλίου. Παρασκευάστηκε 3-(ανθρακεν-9-υλ)-2-κυανοακρυλοϋλοχλωρίδιο 4 και χρησιμοποιήθηκε ως δομικό στοιχείο για την κατασκευή νέων ετεροκυκλικών συστημάτων.
Η δομή της ένωσης 4 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας φασματικά δεδομένα. Το φάσμα 1H-NMR έδειξε την παρουσία CH= στα 9,26 ppm, το φάσμα IR έδειξε την παρουσία μιας καρβονυλομάδας στα 1737 cm−1 και μιας κυανοομάδας στα 2224 cm−1, και το φάσμα 13CNMR επιβεβαίωσε επίσης την προτεινόμενη δομή (βλ. Πειραματική ενότητα).
Η σύνθεση του 3-(ανθρακεν-9-υλ)-2-κυανοακρυλοϋλοχλωριδίου 4 πραγματοποιήθηκε με υδρόλυση των αρωματικών ομάδων 250, 41, 42, 53 με αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (10%) για να δώσει τα οξέα 354, 45, 56, τα οποία στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θειονυλοχλωρίδιο σε υδατόλουτρο για να δώσουν το παράγωγο ακρυλοϋλοχλωριδίου 4 σε υψηλή απόδοση (88,5%), όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.
Για τη δημιουργία νέων ετεροκυκλικών ενώσεων με την αναμενόμενη αντιβακτηριακή αποτελεσματικότητα, πραγματοποιήθηκε η αντίδραση του ακυλοχλωριδίου 4 με διάφορα δινουκλεόφιλα.
Το χλωρίδιο οξέος 4 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένυδρη υδραζίνη στους 0° για μία ώρα. Δυστυχώς, δεν ελήφθη πυραζολόνη 5. Το προϊόν ήταν ένα παράγωγο ακρυλαμιδίου του οποίου η δομή επιβεβαιώθηκε από φασματικά δεδομένα. Το φάσμα IR του έδειξε ζώνες απορρόφησης C=O στα 1720 cm−1, C≡N στα 2228 cm−1 και NH στα 3424 cm−1. Το φάσμα 1H-NMR έδειξε ένα σήμα ανταλλαγής singlet των πρωτονίων ολεφίνης και των πρωτονίων NH στα 9,3 ppm (βλ. Πειραματική Ενότητα).
Δύο γραμμομόρια χλωριδίου οξέος 4 αντέδρασαν με ένα γραμμομόριο φαινυλυδραζίνης για να δώσουν το παράγωγο Ν-φαινυλακρυλοϋλυδραζίνης 7 σε καλή απόδοση (77%) (Σχήμα 5). Η δομή του 7 επιβεβαιώθηκε με δεδομένα φασματοσκοπίας υπερύθρου, τα οποία έδειξαν απορρόφηση δύο ομάδων C=O στα 1691 και 1671 cm−1, απορρόφηση της ομάδας CN στα 2222 cm−1 και απορρόφηση της ομάδας NH στα 3245 cm−1, και το φάσμα 1H-NMR έδειξε ομάδα CH στα 9,15 και 8,81 ppm και πρωτόνιο NH στα 10,88 ppm (βλ. Πειραματική ενότητα).
Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήθηκε η αντίδραση του ακυλοχλωριδίου 4 με 1,3-δινουκλεόφιλα. Η επεξεργασία του ακυλοχλωριδίου 4 με 2-αμινοπυριδίνη σε 1,4-διοξάνιο με TEA ως βάση σε θερμοκρασία δωματίου έδωσε το παράγωγο ακρυλαμιδίου 8 (Σχήμα 5), η δομή του οποίου ταυτοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φασματικά δεδομένα. Τα φάσματα IR έδειξαν ζώνες απορρόφησης κυανίου που εκτείνονται στα 2222 cm−1, NH στα 3148 cm−1 και καρβονυλίου στα 1665 cm−1. Τα φάσματα 1H NMR επιβεβαίωσαν την παρουσία πρωτονίων ολεφίνης στα 9,14 ppm (βλ. Πειραματική Ενότητα).
Η ένωση 4 αντιδρά με θειουρία για να δώσει πυριμιδινοθειόνη 9. η ένωση 4 αντιδρά με θειοσεμικαρβαζίδιο για να δώσει παράγωγο θειοπυραζόλης 10 (Σχήμα 5). Οι δομές των ενώσεων 9 και 10 επιβεβαιώθηκαν με φασματική και στοιχειακή ανάλυση (βλ. Πειραματική ενότητα).
Η τετραζίνη-3-θειόλη 11 παρασκευάστηκε με την αντίδραση της ένωσης 4 με θειοκαρβαζίδιο ως 1,4-δινουκλεόφιλο (Σχήμα 5) και η δομή της επιβεβαιώθηκε με φασματοσκοπία και στοιχειακή ανάλυση. Στο υπέρυθρο φάσμα, ο δεσμός C=N εμφανίστηκε στα 1619 cm−1. Ταυτόχρονα, το φάσμα 1H-NMR διατήρησε σήματα πολλαπλών πλακών αρωματικών πρωτονίων στα 7,78–8,66 ppm και πρωτονίων SH στα 3,31 ppm (βλ. Πειραματική Ενότητα).
Το ακρυλοϋλοχλωρίδιο 4 αντιδρά με 1,2-διαμινοβενζόλιο, 2-αμινοθειοφαινόλη, ανθρανιλικό οξύ, 1,2-διαμινοαιθάνιο και αιθανολαμίνη ως 1,4-δινουκλεόφιλα για να σχηματίσει νέα ετεροκυκλικά συστήματα (13–16).
Οι δομές αυτών των νεοσυντιθέμενων ενώσεων επιβεβαιώθηκαν με φασματική και στοιχειακή ανάλυση (βλ. Πειραματική ενότητα). Το παράγωγο 2-υδροξυφαινυλακρυλαμιδίου 17 ελήφθη με αντίδραση με 2-αμινοφαινόλη ως δινουκλεόφιλο (Σχήμα 6) και η δομή του επιβεβαιώθηκε με φασματική και στοιχειακή ανάλυση. Το φάσμα υπερύθρου της ένωσης 17 έδειξε ότι τα σήματα C=O και C≡N εμφανίστηκαν στα 1681 και 2226 cm−1, αντίστοιχα. Εν τω μεταξύ, το φάσμα 1H-NMR διατήρησε το σήμα singlet του πρωτονίου ολεφίνης στα 9,19 ppm και το πρωτόνιο OH εμφανίστηκε στα 9,82 ppm (βλ. Πειραματική ενότητα).
Η αντίδραση του χλωριδίου οξέος 4 με ένα πυρηνόφιλο (π.χ. αιθυλαμίνη, 4-τολουιδίνη και 4-μεθοξυανιλίνη) σε διοξάνιο ως διαλύτη και TEA ως καταλύτη σε θερμοκρασία δωματίου έδωσε τα πράσινα κρυσταλλικά παράγωγα ακρυλαμιδίου 18, 19a και 19b. Τα στοιχειακά και φασματικά δεδομένα των ενώσεων 18, 19a και 19b επιβεβαίωσαν τις δομές αυτών των παραγώγων (βλ. Πειραματική Ενότητα) (Σχήμα 7).
Μετά την εξέταση της αντιμικροβιακής δράσης διαφόρων συνθετικών ενώσεων, ελήφθησαν διαφορετικά αποτελέσματα, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1 και στο Σχήμα 8 (βλ. αρχείο σχήματος). Όλες οι ενώσεις που εξετάστηκαν έδειξαν διαφορετικούς βαθμούς αναστολής έναντι του Gram-θετικού βακτηρίου MRSA, ενώ το Gram-αρνητικό βακτήριο Escherichia coli έδειξε πλήρη αντοχή σε όλες τις ενώσεις. Οι ενώσεις που εξετάστηκαν μπορούν να χωριστούν σε τρεις κατηγορίες με βάση τη διάμετρο της ζώνης αναστολής έναντι του MRSA. Η πρώτη κατηγορία ήταν η πιο δραστική και αποτελούνταν από πέντε ενώσεις (6, 7, 10, 13b και 14). Η διάμετρος της ζώνης αναστολής αυτών των ενώσεων ήταν κοντά στα 4 cm. οι πιο δραστικές ενώσεις σε αυτήν την κατηγορία ήταν οι ενώσεις 6 και 13b. Η δεύτερη κατηγορία ήταν μέτρια δραστική και αποτελούνταν από άλλες πέντε ενώσεις (11, 13a, 15, 18 και 19a). Η ζώνη αναστολής αυτών των ενώσεων κυμαινόταν από 3,3 έως 3,65 cm, με την ένωση 11 να εμφανίζει τη μεγαλύτερη ζώνη αναστολής 3,65 ± 0,1 cm. Από την άλλη πλευρά, η τελευταία ομάδα περιείχε τρεις ενώσεις (8, 17 και 19b) με τη χαμηλότερη αντιμικροβιακή δράση (λιγότερο από 3 cm). Το Σχήμα 9 δείχνει την κατανομή των διαφόρων ζωνών αναστολής.
Περαιτέρω διερεύνηση της αντιμικροβιακής δράσης των υπό εξέταση ενώσεων περιελάμβανε τον προσδιορισμό της MIC και της MBC για κάθε ένωση. Τα αποτελέσματα διέφεραν ελαφρώς (όπως φαίνεται στους Πίνακες 2, 3 και στο Σχήμα 10 (βλ. αρχείο σχήματος)), με τις ενώσεις 7, 11, 13a και 15 προφανώς να αναταξινομούνται ως οι καλύτερες ενώσεις. Είχαν τις ίδιες χαμηλότερες τιμές MIC και MBC (39,06 μg/100 μL). Αν και οι ενώσεις 7 και 8 είχαν χαμηλότερες τιμές MIC (9,7 μg/100 μL), οι τιμές MBC τους ήταν υψηλότερες (78,125 μg/100 μL). Επομένως, θεωρήθηκαν ασθενέστερες από τις προαναφερθείσες ενώσεις. Ωστόσο, αυτές οι έξι ενώσεις ήταν οι πιο αποτελεσματικές από αυτές που εξετάστηκαν, καθώς οι τιμές MBC τους ήταν κάτω από 100 μg/100 μL.
Οι ενώσεις (10, 14, 18 και 19b) ήταν λιγότερο δραστικές σε σύγκριση με άλλες ενώσεις που εξετάστηκαν, καθώς οι τιμές MBC τους κυμαίνονταν από 156 έως 312 μg/100 μL. Από την άλλη πλευρά, οι ενώσεις (8, 17 και 19a) ήταν οι λιγότερο ελπιδοφόρες, καθώς είχαν τις υψηλότερες τιμές MBC (625, 625 και 1250 μg/100 μL, αντίστοιχα).
Τέλος, σύμφωνα με τα επίπεδα ανοχής που παρουσιάζονται στον Πίνακα 3, οι ενώσεις που εξετάστηκαν μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες με βάση τον τρόπο δράσης τους: ενώσεις με βακτηριοκτόνο δράση (7, 8, 10, 11, 13a, 15, 18, 19b) και ενώσεις με αντιβακτηριακή δράση (6, 13b, 14, 17, 19a). Μεταξύ αυτών, προτιμώνται οι ενώσεις 7, 11, 13a και 15, οι οποίες εμφανίζουν θανατωτική δράση σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση (39,06 μg/100 μL).
Δέκα από τις δεκατρείς ενώσεις που εξετάστηκαν έδειξαν δυναμικό έναντι του ανθεκτικού στα αντιβιοτικά Staphylococcus aureus, ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη, MRSA. Συνεπώς, συνιστάται περαιτέρω έλεγχος με περισσότερα ανθεκτικά στα αντιβιοτικά παθογόνα (ειδικά τοπικά απομονωμένα στελέχη που καλύπτουν παθογόνα Gram-θετικά και Gram-αρνητικά βακτήρια) και παθογόνους ζυμομύκητες, καθώς και κυτταροτοξικές δοκιμές κάθε ένωσης για την αξιολόγηση της ασφάλειάς της.
Διεξήχθησαν μελέτες μοριακής σύνδεσης για την αξιολόγηση του δυναμικού των συνθετικών ενώσεων ως αναστολέων της πρωτεΐνης δέσμευσης πενικιλίνης 2a (PBP2a) στον ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA). Η PBP2a είναι ένα βασικό ένζυμο που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος και η αναστολή αυτού του ενζύμου παρεμβαίνει στον σχηματισμό του κυτταρικού τοιχώματος, οδηγώντας τελικά σε βακτηριακή λύση και κυτταρικό θάνατο1. Τα αποτελέσματα της σύνδεσης παρατίθενται στον Πίνακα 4 και περιγράφονται λεπτομερέστερα στο συμπληρωματικό αρχείο δεδομένων και τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αρκετές ενώσεις εμφάνισαν ισχυρή συγγένεια σύνδεσης για την PBP2a, ιδιαίτερα βασικά υπολείμματα ενεργού κέντρου όπως η Lys 273, η Lys 316 και η Arg 298. Οι αλληλεπιδράσεις, συμπεριλαμβανομένου του δεσμού υδρογόνου και της π-στοίβαξης, ήταν πολύ παρόμοιες με εκείνες του συν-κρυσταλλωμένου υποκαταστάτη κιναζολινόνης (CCL), υποδεικνύοντας το δυναμικό αυτών των ενώσεων ως ισχυρών αναστολέων.
Τα δεδομένα μοριακής σύνδεσης, μαζί με άλλες υπολογιστικές παραμέτρους, υποδηλώνουν έντονα ότι η αναστολή της PBP2a ήταν ο βασικός μηχανισμός που ευθύνεται για την παρατηρούμενη αντιβακτηριακή δράση αυτών των ενώσεων. Οι βαθμολογίες σύνδεσης και οι τιμές της μέσης τετραγωνικής απόκλισης (RMSD) αποκάλυψαν περαιτέρω τη συγγένεια σύνδεσης και τη σταθερότητα, υποστηρίζοντας αυτήν την υπόθεση. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, ενώ αρκετές ενώσεις έδειξαν καλή συγγένεια σύνδεσης, ορισμένες ενώσεις (π.χ., 7, 9, 10 και 14) είχαν υψηλότερες βαθμολογίες σύνδεσης από τον συν-κρυσταλλωμένο υποκαταστάτη, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να έχουν ισχυρότερες αλληλεπιδράσεις με τα υπολείμματα ενεργού θέσης της PBP2a. Ωστόσο, οι πιο βιοδραστικές ενώσεις 6 και 13b έδειξαν ελαφρώς χαμηλότερες βαθμολογίες σύνδεσης (-5,98 και -5,63, αντίστοιχα) σε σύγκριση με τους άλλους υποκαταστάτες. Αυτό υποδηλώνει ότι παρόλο που οι βαθμολογίες σύνδεσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη της συγγένειας σύνδεσης, άλλοι παράγοντες (π.χ., η σταθερότητα του υποκαταστάτη και οι μοριακές αλληλεπιδράσεις στο βιολογικό περιβάλλον) παίζουν επίσης βασικό ρόλο στον προσδιορισμό της αντιβακτηριακής δράσης. Αξιοσημείωτα, οι τιμές RMSD όλων των συνθετικών ενώσεων ήταν κάτω από 2 Å, επιβεβαιώνοντας ότι οι θέσεις πρόσδεσής τους είναι δομικά συμβατές με τη διαμόρφωση σύνδεσης του συν-κρυσταλλωμένου υποκαταστάτη, υποστηρίζοντας περαιτέρω τις δυνατότητές τους ως ισχυροί αναστολείς της PBP2a.
Παρόλο που οι βαθμολογίες πρόσδεσης και οι τιμές RMS παρέχουν πολύτιμες προβλέψεις, η συσχέτιση μεταξύ αυτών των αποτελεσμάτων πρόσδεσης και της αντιμικροβιακής δράσης δεν είναι πάντα σαφής με την πρώτη ματιά. Παρόλο που η αναστολή της PBP2a υποστηρίζεται έντονα ως βασικός παράγοντας που επηρεάζει την αντιμικροβιακή δράση, αρκετές διαφορές υποδηλώνουν ότι και άλλες βιολογικές ιδιότητες παίζουν σημαντικό ρόλο. Οι ενώσεις 6 και 13b εμφάνισαν την υψηλότερη αντιμικροβιακή δράση, τόσο με διάμετρο ζώνης αναστολής 4 cm όσο και με τις χαμηλότερες τιμές MIC (9,7 μg/100 μL) και MBC (78,125 μg/100 μL), παρά τις χαμηλότερες βαθμολογίες πρόσδεσης σε σύγκριση με τις ενώσεις 7, 9, 10 και 14. Αυτό υποδηλώνει ότι παρόλο που η αναστολή της PBP2a συμβάλλει στην αντιμικροβιακή δράση, παράγοντες όπως η διαλυτότητα, η βιοδιαθεσιμότητα και η δυναμική αλληλεπίδρασης στο βακτηριακό περιβάλλον επηρεάζουν επίσης τη συνολική δράση. Το Σχήμα 11 δείχνει τις θέσεις πρόσδεσης, υποδεικνύοντας ότι και οι δύο ενώσεις, ακόμη και με σχετικά χαμηλές βαθμολογίες σύνδεσης, εξακολουθούν να είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με βασικά υπολείμματα της PBP2a, ενδεχομένως σταθεροποιώντας το σύμπλοκο αναστολής. Αυτό υπογραμμίζει ότι ενώ η μοριακή σύνδεση παρέχει σημαντικές πληροφορίες για την αναστολή της PBP2a, πρέπει να ληφθούν υπόψη και άλλοι βιολογικοί παράγοντες για την πλήρη κατανόηση των αντιμικροβιακών επιδράσεων αυτών των ενώσεων στον πραγματικό κόσμο.
Χρησιμοποιώντας την κρυσταλλική δομή της PBP2a (PDB ID: 4CJN), κατασκευάστηκαν δισδιάστατοι και τρισδιάστατοι χάρτες αλληλεπίδρασης των πιο δραστικών ενώσεων 6 και 13b που συνδέονται με την πρωτεΐνη δέσμευσης πενικιλίνης 2a (PBP2a) του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA). Αυτοί οι χάρτες συγκρίνουν τα πρότυπα αλληλεπίδρασης αυτών των ενώσεων με τον επανασυνδεδεμένο συν-κρυσταλλωμένο υποκαταστάτη κιναζολινόνης (CCL), επισημαίνοντας βασικές αλληλεπιδράσεις όπως ο δεσμός υδρογόνου, η π-στοίβαξη και οι ιοντικές αλληλεπιδράσεις.
Παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε για την ένωση 7, η οποία έδειξε σχετικά υψηλό σκορ πρόσδεσης (-6,32) και παρόμοια διάμετρο ζώνης αναστολής (3,9 cm) με την ένωση 10. Ωστόσο, η MIC (39,08 μg/100 μL) και η MBC (39,06 μg/100 μL) ήταν σημαντικά υψηλότερες, υποδεικνύοντας ότι απαιτούσε υψηλότερες συγκεντρώσεις για να επιδείξει αντιβακτηριακή δράση. Αυτό υποδηλώνει ότι παρόλο που η ένωση 7 έδειξε ισχυρή συγγένεια σύνδεσης σε μελέτες πρόσδεσης, παράγοντες όπως η βιοδιαθεσιμότητα, η κυτταρική πρόσληψη ή άλλες φυσικοχημικές ιδιότητες μπορεί να περιορίσουν τη βιολογική της αποτελεσματικότητα. Παρόλο που η ένωση 7 έδειξε βακτηριοκτόνες ιδιότητες, ήταν λιγότερο αποτελεσματική στην αναστολή της βακτηριακής ανάπτυξης σε σύγκριση με τις ενώσεις 6 και 13b.
Η ένωση 10 παρουσίασε μια πιο δραματική διαφορά με την υψηλότερη βαθμολογία πρόσδεσης (-6,40), υποδεικνύοντας ισχυρή συγγένεια σύνδεσης με την PBP2a. Ωστόσο, η διάμετρος ζώνης αναστολής της (3,9 cm) ήταν συγκρίσιμη με την ένωση 7 και η MBC της (312 μg/100 μL) ήταν σημαντικά υψηλότερη από τις ενώσεις 6, 7 και 13b, υποδεικνύοντας ασθενέστερη βακτηριοκτόνο δράση. Αυτό υποδηλώνει ότι παρά τις καλές προβλέψεις πρόσδεσης, η ένωση 10 ήταν λιγότερο αποτελεσματική στην εξόντωση του MRSA λόγω άλλων περιοριστικών παραγόντων όπως η διαλυτότητα, η σταθερότητα ή η κακή διαπερατότητα της βακτηριακής μεμβράνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την κατανόηση ότι ενώ η αναστολή της PBP2a παίζει βασικό ρόλο στην αντιβακτηριακή δράση, δεν εξηγεί πλήρως τις διαφορές στη βιολογική δράση που παρατηρήθηκαν μεταξύ των ενώσεων που εξετάστηκαν. Αυτές οι διαφορές υποδηλώνουν ότι απαιτούνται περαιτέρω πειραματικές αναλύσεις και εις βάθος βιολογικές αξιολογήσεις για την πλήρη διαλεύκανση των εμπλεκόμενων αντιβακτηριακών μηχανισμών.
Τα αποτελέσματα μοριακής σύνδεσης στον Πίνακα 4 και στο Συμπληρωματικό Αρχείο Δεδομένων υπογραμμίζουν την πολύπλοκη σχέση μεταξύ των βαθμολογιών σύνδεσης και της αντιμικροβιακής δράσης. Αν και οι ενώσεις 6 και 13b έχουν χαμηλότερες βαθμολογίες σύνδεσης από τις ενώσεις 7, 9, 10 και 14, εμφανίζουν την υψηλότερη αντιμικροβιακή δράση. Οι χάρτες αλληλεπίδρασής τους (που φαίνονται στο Σχήμα 11) δείχνουν ότι παρά τις χαμηλότερες βαθμολογίες σύνδεσης, εξακολουθούν να σχηματίζουν σημαντικούς δεσμούς υδρογόνου και αλληλεπιδράσεις π-stacking με βασικά υπολείμματα της PBP2a που μπορούν να σταθεροποιήσουν το σύμπλοκο ενζύμου-αναστολέα με βιολογικά ευεργετικό τρόπο. Παρά τις σχετικά χαμηλές βαθμολογίες σύνδεσης των 6 και 13b, η ενισχυμένη αντιμικροβιακή τους δράση υποδηλώνει ότι άλλες ιδιότητες όπως η διαλυτότητα, η σταθερότητα και η κυτταρική πρόσληψη θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη σε συνδυασμό με τα δεδομένα σύνδεσης κατά την αξιολόγηση του δυναμικού αναστολέα. Αυτό υπογραμμίζει τη σημασία του συνδυασμού των μελετών σύνδεσης με την πειραματική αντιμικροβιακή ανάλυση για την ακριβή αξιολόγηση του θεραπευτικού δυναμικού των νέων ενώσεων.
Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν ότι ενώ η μοριακή σύνδεση είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την πρόβλεψη της συγγένειας σύνδεσης και τον εντοπισμό πιθανών μηχανισμών αναστολής, δεν πρέπει να βασίζεται μόνο σε αυτήν για τον προσδιορισμό της αντιμικροβιακής αποτελεσματικότητας. Τα μοριακά δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της PBP2a είναι ένας βασικός παράγοντας που επηρεάζει την αντιμικροβιακή δράση, αλλά οι αλλαγές στη βιολογική δράση υποδηλώνουν ότι άλλες φυσικοχημικές και φαρμακοκινητικές ιδιότητες πρέπει να βελτιστοποιηθούν για την ενίσχυση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας. Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να επικεντρωθούν στη βελτιστοποίηση της χημικής δομής των ενώσεων 7 και 10 για τη βελτίωση της βιοδιαθεσιμότητας και της κυτταρικής πρόσληψης, διασφαλίζοντας ότι οι ισχυρές αλληλεπιδράσεις σύνδεσης μεταφράζονται σε πραγματική αντιμικροβιακή δράση. Περαιτέρω μελέτες, συμπεριλαμβανομένων πρόσθετων βιοδοκιμασιών και ανάλυσης σχέσης δομής-δραστικότητας (SAR), θα είναι κρίσιμες για την περαιτέρω κατανόηση του τρόπου με τον οποίο αυτές οι ενώσεις λειτουργούν ως αναστολείς της PBP2a και για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών αντιμικροβιακών παραγόντων.
Οι ενώσεις που συντέθηκαν από το 3-(ανθρακεν-9-υλ)-2-κυανοακρυλοϋλοχλωρίδιο 4 εμφάνισαν ποικίλους βαθμούς αντιμικροβιακής δράσης, με αρκετές ενώσεις να επιδεικνύουν σημαντική αναστολή του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA). Η ανάλυση της σχέσης δομής-δραστικότητας (SAR) αποκάλυψε βασικά δομικά χαρακτηριστικά που αποτελούν τη βάση της αντιμικροβιακής αποτελεσματικότητας αυτών των ενώσεων.
Η παρουσία τόσο των ομάδων ακρυλονιτριλίου όσο και του ανθρακενίου αποδείχθηκε κρίσιμη για την ενίσχυση της αντιμικροβιακής δράσης. Η εξαιρετικά δραστική ομάδα νιτριλίου στο ακρυλονιτρίλιο είναι απαραίτητη για τη διευκόλυνση των αλληλεπιδράσεων με βακτηριακές πρωτεΐνες, συμβάλλοντας έτσι στις αντιμικροβιακές ιδιότητες της ένωσης. Οι ενώσεις που περιέχουν τόσο ακρυλονιτρίλιο όσο και ανθρακένιο επέδειξαν σταθερά ισχυρότερες αντιμικροβιακές επιδράσεις. Η αρωματικότητα της ομάδας ανθρακενίου σταθεροποίησε περαιτέρω αυτές τις ενώσεις, ενισχύοντας ενδεχομένως τη βιολογική τους δράση.
Η εισαγωγή ετεροκυκλικών δακτυλίων βελτίωσε σημαντικά την αντιβακτηριακή αποτελεσματικότητα αρκετών παραγώγων. Συγκεκριμένα, το παράγωγο βενζοθειαζόλης 13b και το παράγωγο ακρυλυδραζιδίου 6 εμφάνισαν την υψηλότερη αντιβακτηριακή δράση με ζώνη αναστολής περίπου 4 cm. Αυτά τα ετεροκυκλικά παράγωγα εμφάνισαν πιο σημαντικές βιολογικές επιδράσεις, υποδεικνύοντας ότι η ετεροκυκλική δομή παίζει βασικό ρόλο στις αντιβακτηριακές επιδράσεις. Ομοίως, η πυριμιδινοθειόνη στην ένωση 9, η θειοπυραζόλη στην ένωση 10 και ο δακτύλιος τετραζίνης στην ένωση 11 συνέβαλαν στις αντιβακτηριακές ιδιότητες των ενώσεων, υπογραμμίζοντας περαιτέρω τη σημασία της ετεροκυκλικής τροποποίησης.
Μεταξύ των συντεθειμένων ενώσεων, οι ενώσεις 6 και 13b ξεχώρισαν για την εξαιρετική αντιβακτηριακή τους δράση. Η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (MIC) της ένωσης 6 ήταν 9,7 μg/100 μL και η ελάχιστη βακτηριοκτόνος συγκέντρωση (MBC) ήταν 78,125 μg/100 μL, υπογραμμίζοντας την εξαιρετική της ικανότητα να απομακρύνει τον ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA). Ομοίως, η ένωση 13b είχε ζώνη αναστολής 4 cm και χαμηλές τιμές MIC και MBC, επιβεβαιώνοντας την ισχυρή αντιβακτηριακή της δράση. Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τους βασικούς ρόλους των λειτουργικών ομάδων ακρυλοϋδραζιδίου και βενζοθειαζόλης στον προσδιορισμό της βιοαποτελεσματικότητας αυτών των ενώσεων.
Αντιθέτως, οι ενώσεις 7, 10 και 14 εμφάνισαν μέτρια αντιβακτηριακή δράση με ζώνες αναστολής που κυμαίνονταν από 3,65 έως 3,9 cm. Αυτές οι ενώσεις απαιτούσαν υψηλότερες συγκεντρώσεις για την πλήρη εξόντωση των βακτηρίων, όπως αντικατοπτρίζεται από τις σχετικά υψηλές τιμές MIC και MBC. Αν και αυτές οι ενώσεις ήταν λιγότερο δραστικές από τις ενώσεις 6 και 13b, εμφάνισαν σημαντικό αντιβακτηριακό δυναμικό, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενσωμάτωση τμημάτων ακρυλονιτριλίου και ανθρακενίου στον ετεροκυκλικό δακτύλιο συμβάλλει στην αντιβακτηριακή τους δράση.
Οι ενώσεις έχουν διαφορετικούς τρόπους δράσης, μερικές εμφανίζουν βακτηριοκτόνες ιδιότητες και άλλες βακτηριοστατικές επιδράσεις. Οι ενώσεις 7, 11, 13a και 15 είναι βακτηριοκτόνες και απαιτούν χαμηλότερες συγκεντρώσεις για την πλήρη εξόντωση των βακτηρίων. Αντίθετα, οι ενώσεις 6, 13b και 14 είναι βακτηριοστατικές και μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη των βακτηρίων σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις, αλλά απαιτούν υψηλότερες συγκεντρώσεις για την πλήρη εξόντωση των βακτηρίων.
Συνολικά, η ανάλυση της σχέσης δομής-δραστικότητας υπογραμμίζει τη σημασία της εισαγωγής τμημάτων ακρυλονιτριλίου και ανθρακενίου και ετεροκυκλικών δομών για την επίτευξη σημαντικής αντιβακτηριακής δράσης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η βελτιστοποίηση αυτών των δομικών συστατικών και η διερεύνηση περαιτέρω τροποποιήσεων για τη βελτίωση της διαλυτότητας και της διαπερατότητας της μεμβράνης μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών φαρμάκων κατά του MRSA.
Όλα τα αντιδραστήρια και οι διαλύτες καθαρίστηκαν και ξηράνθηκαν χρησιμοποιώντας τυπικές διαδικασίες (El Gomhouria, Αίγυπτος). Τα σημεία τήξης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια ηλεκτρονική συσκευή σημείου τήξης GallenKamp και αναφέρονται χωρίς διόρθωση. Τα φάσματα υπερύθρου (IR) (cm⁻1) καταγράφηκαν στο Τμήμα Χημείας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Ain Shams χρησιμοποιώντας σφαιρίδια βρωμιούχου καλίου (KBr) σε φασματόμετρο Thermo Electron Nicolet iS10 FTIR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ).
Τα φάσματα 1H NMR ελήφθησαν στα 300 MHz χρησιμοποιώντας φασματόμετρο GEMINI NMR (GEMINI Manufacturing & Engineering, Anaheim, CA, USA) και φασματόμετρο BRUKER 300 MHz NMR (BRUKER Manufacturing & Engineering, Inc.). Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε τετραμεθυλοσιλάνιο (TMS) με δευτεριωμένο διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO-d₆). Οι μετρήσεις NMR πραγματοποιήθηκαν στη Σχολή Θετικών Επιστημών του Πανεπιστημίου του Καΐρου, στη Γκίζα της Αιγύπτου. Η στοιχειακή ανάλυση (CHN) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν Στοιχειακό Αναλυτή Perkin-Elmer 2400 και τα αποτελέσματα που ελήφθησαν συμφωνούν σε μεγάλο βαθμό με τις υπολογισμένες τιμές.
Ένα μείγμα οξέος 3 (5 mmol) και θειονυλοχλωριδίου (5 ml) θερμάνθηκε σε υδατόλουτρο στους 65 °C για 4 ώρες. Η περίσσεια θειονυλοχλωριδίου απομακρύνθηκε με απόσταξη υπό μειωμένη πίεση. Το προκύπτον κόκκινο στερεό συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε χωρίς περαιτέρω καθαρισμό. Σημείο τήξης: 200-202 °C, απόδοση: 88,5%. IR (KBr, ν, cm−1): 2224 (C≡N), 1737 (C=O). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9,26 (s, 1H, CH=), 7,27-8,57 (m, 9H, ετεροαρωματοποίηση). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 115,11 (C≡N), 124,82–130,53 (CH3 ανθρακένιο), 155,34, 114,93 (CH3=C–C=O), 162,22 (C=O); HRMS (ESI) m/z [M + H]+: 291,73111. Αναλυτής. Υπολογίστηκε για C18H10ClNO3 (291,73): C, 74,11; H, 3,46; N, 4,80. Βρέθηκε: C, 74,41; H, 3,34; N, 4,66%.
Στους 0°C, το 4 (2 mmol, 0,7 g) διαλύθηκε σε άνυδρο διοξάνιο (20 ml) και προστέθηκε στάγδην ένυδρη υδραζίνη (2 mmol, 0,16 ml, 80%) και αναδεύτηκε για 1 ώρα. Το καθιζάνον στερεό συλλέχθηκε με διήθηση και ανακρυσταλλώθηκε από αιθανόλη για να δώσει την ένωση 6.
Πράσινοι κρύσταλλοι, σημείο τήξης 190-192℃, απόδοση 69,36%; IR (KBr) ν=3424 (NH), 2228 (C≡N), 1720 (C=O), 1621 (C=N) cm−1. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9,3 (br s, H, NH, ανταλλάξιμο), 7,69-8,51 (m, 18H, ετεροαρωματικό), 9,16 (s, 1H, CH=), 8,54 (s, 1H, CH=). Υπολογισμένη τιμή για C33H21N3O (475,53): C, 83,35; H, 4,45; N, 8,84. Βρέθηκαν: C, 84,01; H, 4,38; N, 8,05%.
Διαλύστε το 4 (2 mmol, 0,7 g) σε 20 ml διαλύματος άνυδρου διοξανίου (που περιέχει μερικές σταγόνες τριαιθυλαμίνης), προσθέστε φαινυλυδραζίνη/2-αμινοπυριδίνη (2 mmol) και αναδεύστε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 και 2 ώρες, αντίστοιχα. Ρίξτε το μείγμα αντίδρασης σε πάγο ή νερό και οξινίστε με αραιό υδροχλωρικό οξύ. Διηθήστε το διαχωρισμένο στερεό και ανακρυσταλλώστε από αιθανόλη για να ληφθεί το 7 και ανακρυσταλλώστε από βενζόλιο για να ληφθεί το 8.
Πράσινοι κρύσταλλοι, σημείο τήξης 160-162℃, απόδοση 77%· IR (KBr, ν, cm−1): 3245 (NH), 2222 (C≡N), 1691 (C=O), 1671 (C=O) cm−1. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm): 10,88 (s, 1H, NH, ανταλλάξιμο), 9,15 (s, 1H, CH=), 8,81 (s, 1H, CH=), 6,78-8,58 (m, 23H, ετεροαρωματικό). Υπολογισμένη τιμή για C42H26N4O2 (618,68): C, 81,54; H, 4,24; N, 9,06. Βρέθηκαν: C, 81,96; H, 3,91; Ν, 8,91%.
Το 4 (2 mmol, 0,7 g) διαλύθηκε σε 20 ml διαλύματος άνυδρου διοξανίου (που περιείχε μερικές σταγόνες τριαιθυλαμίνης), προστέθηκε 2-αμινοπυριδίνη (2 mmol, 0,25 g) και το μείγμα αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Το μείγμα αντίδρασης χύθηκε σε παγωμένο νερό και οξινίστηκε με αραιό υδροχλωρικό οξύ. Το σχηματισμένο ίζημα διηθήθηκε και ανακρυσταλλώθηκε από βενζόλιο, δίνοντας πράσινους κρυστάλλους του 8 με σημείο τήξης 146-148 °C και απόδοση 82,5%· φάσμα υπερύθρου (KBr) ν: 3148 (NH), 2222 (C≡N), 1665 (C=O) cm−1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm): 8,78 (s, H, NH, ανταλλάξιμο), 9,14 (s, 1H, CH=), 7,36-8,55 (m, 13H, ετεροαρωματοποίηση). Υπολογίστηκε για C23H15N3O (348,38): C, 79,07; H, 4,33; N, 12,03. Βρέθηκε: C, 78,93; H, 3,97; N, 12,36%.
Η ένωση 4 (2 mmol, 0,7 g) διαλύθηκε σε 20 ml ξηρής διοξανίου (που περιείχε μερικές σταγόνες τριαιθυλαμίνης και 2 mmol θειουρίας/ημικαρβαζιδίου) και θερμάνθηκε υπό αναρροή για 2 ώρες. Ο διαλύτης εξατμίστηκε υπό κενό. Το υπόλειμμα ανακρυσταλλώθηκε από διοξάνιο για να δώσει ένα μείγμα.