Η ταξινόμηση πρωτεϊνών στην εκκριτική οδό είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της διαμερισματοποίησης και της ομοιόστασης των κυττάρων. Εκτός από την ταξινόμηση που προκαλείται από το κέλυφος, ο ρόλος των λιπιδίων στην ταξινόμηση μέσω κινεσίνης στη διαδικασία της εκκριτικής μεταφοράς είναι ένα μακροχρόνιο βασικό ερώτημα που δεν έχει ακόμη απαντηθεί. Εδώ, πραγματοποιούμε τρισδιάστατη ταυτόχρονη πολύχρωμη απεικόνιση υψηλής ανάλυσης σε πραγματικό χρόνο για να αποδείξουμε in vivo ότι οι νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες ακινητοποιημένες με γλυκοζυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλη με πολύ μεγάλα τμήματα λιπιδίων κεραμιδίου ομαδοποιούνται και ταξινομούνται σε εξειδικευμένα ενδοπλάσματα. Θέση καθαρής εξόδου, η οποία είναι διαφορετική από αυτήν που χρησιμοποιείται από τις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες. Επιπλέον, δείχνουμε ότι το μήκος της αλυσίδας του κεραμιδίου στην μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου είναι κρίσιμο για αυτήν την επιλεκτικότητα ταξινόμησης. Η μελέτη μας παρέχει την πρώτη άμεση in vivo απόδειξη για την ταξινόμηση πρωτεϊνικών φορτίων με βάση το μήκος της λιπιδικής αλυσίδας σε επιλεκτικές θέσεις εξαγωγής στην εκκριτική οδό.
Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, οι πρωτεΐνες που συντίθενται στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) στη συνέχεια ταξινομούνται κατά τη μεταφορά μέσω της εκκριτικής οδού για την παράδοσή τους στον κατάλληλο κυτταρικό προορισμό τους (1). Εκτός από τη διαλογή που προκαλείται από το περίβλημα, υπήρχε εδώ και καιρό η εικασία ότι ορισμένα λιπίδια μπορούν επίσης να χρησιμεύσουν ως επιλεκτικά σημεία εξόδου, ομαδοποιώντας τα σε συγκεκριμένες περιοχές μεμβράνης που αφορούν συγκεκριμένες πρωτεΐνες (2-5). Ωστόσο, εξακολουθεί να υπάρχει έλλειψη άμεσων in vivo στοιχείων που να αποδεικνύουν αυτόν τον πιθανό μηχανισμό που βασίζεται στα λιπίδια. Προκειμένου να λύσουμε αυτό το βασικό πρόβλημα, μελετήσαμε σε ζυμομύκητες πώς οι πρωτεΐνες που αγκυρώνονται στη γλυκοζυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (GPI) (GPI-APs) εξάγονται διαφορικά από το ER. Τα GPI-APs είναι μια ποικιλία πρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας που συνδέονται με λιπίδια (6, 7). Το GPI-AP είναι μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη που συνδέεται με τα εξωτερικά φύλλα της πλασματικής μεμβράνης μέσω του γλυκολιπιδικού τμήματος (άγκυρα GPI). Δέχονται άγκυρες GPI ως συντηρητικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις στον αυλό του ER (8). Μετά την προσκόλληση, η GPI-AP διέρχεται από το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) μέσω της συσκευής Golgi (5, 9) στην πλασματική μεμβράνη. Η παρουσία αγκυρών GPI προκαλεί τη μεταφορά της GPI-AP ξεχωριστά από τις διαμεμβρανικές εκκρινόμενες πρωτεΐνες (συμπεριλαμβανομένων άλλων πρωτεϊνών της πλασματικής μεμβράνης) κατά μήκος της εκκριτικής οδού (5, 9, 10). Στα κύτταρα ζύμης, οι GPI-AP διαχωρίζονται από άλλες εκκρινόμενες πρωτεΐνες στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στη συνέχεια συσκευάζονται σε μοναδικά κυστίδια που τυλίγονται από το σύμπλεγμα πρωτεΐνης περιβλήματος II (COPII) (6, 7). Οι καθοριστικοί παράγοντες αυτής της διαδικασίας ταξινόμησης στη διαδικασία εξαγωγής του ER είναι ασαφείς, αλλά εικάζεται ότι αυτός ο μηχανισμός μπορεί να απαιτεί λιπίδια, ειδικά τη δομική αναδιαμόρφωση του λιπιδικού τμήματος της άγκυρας GPI (5, 8). Στη ζύμη, η αναδιαμόρφωση των λιπιδίων της GPI ξεκινά αμέσως μετά την προσκόλληση της GPI και, σε πολλές περιπτώσεις, προκαλεί τη σύνδεση του κεραμιδίου με το κορεσμένο λιπαρό οξύ μακράς αλυσίδας 26 ατόμων άνθρακα (C26:0) (11, 12). Το κεραμίδιο C26 είναι το κύριο κεραμίδιο που παράγεται από τα κύτταρα ζύμης μέχρι στιγμής. Συντίθεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και το μεγαλύτερο μέρος του εξάγεται στη συσκευή Golgi μέσω κυστιδίων COPII (13). Η εξαγωγή του GPI-AP από το ER απαιτεί συγκεκριμένα συνεχή σύνθεση κεραμιδίου (14, 15) και, με τη σειρά της, η μετατροπή του κεραμιδίου σε κεραμίδιο φωσφορικής ινοσιτόλης (IPC) στη συσκευή Golgi εξαρτάται από τη σύνθεση άγκυρας GPI (16). Βιοφυσικές μελέτες με τεχνητές μεμβράνες έχουν δείξει ότι τα κεραμίδια πολύ μακρών ακυλικών αλυσίδων μπορούν να συγχωνευθούν για να σχηματίσουν διατεταγμένες περιοχές με μοναδικές φυσικές ιδιότητες (17, 18). Αυτά τα δεδομένα οδηγούν στην υπόθεση ότι το κεραμίδιο C26 και το GPI-AP με κεραμίδιο C26 χρησιμοποιούν τις φυσικές τους ιδιότητες για να συγχωνευθούν σε διατεταγμένες περιοχές ή περιοχές στο σχετικά ακατάστατο λιπιδικό περιβάλλον της μεμβράνης του ER. Αποτελείται κυρίως από βραχέα και ακόρεστα γλυκερολιπίδια (C16:1 και C18:1) (19, 20). Αυτές οι περιοχές θα επικεντρωθούν επιλεκτικά σε συγκεκριμένες θέσεις εξόδου του ER (ERES), όπου το κεραμίδιο και το GPI-AP με βάση το κεραμίδιο μπορούν να μεταφερθούν ταυτόχρονα στο σύμπλεγμα Golgi στο ίδιο ειδικό κυστίδιο COPII (5).
Σε αυτήν τη μελέτη, δοκιμάσαμε άμεσα αυτόν τον μηχανισμό που βασίζεται στα λιπίδια χρησιμοποιώντας μικροσκοπία απεικόνισης ομοεστιακού πραγματικού χρόνου υπερ-ανάλυσης (SCLIM), η οποία είναι μια πρωτοποριακή τεχνική μικροσκοπίας που μπορεί να παρατηρήσει ταυτόχρονα πρωτεΐνες που έχουν επισημανθεί με φθορισμό. Οι τρισδιάστατες και τρισδιάστατες (3D) εικόνες έχουν εξαιρετικά υψηλή ανάλυση και ταχύτητα στα ζωντανά κύτταρα (21, 22).
Αρχικά εφαρμόσαμε την τεχνολογία SCLIM για να προσδιορίσουμε περαιτέρω τον τρόπο με τον οποίο η φυσιολογική GPI-AP με ομάδα κεραμιδίου C26 εξετάστηκε από τις διαμεμβρανικές εκκρινόμενες πρωτεΐνες μετά την έξοδο από το ενδοπλασματικό δίκτυο (ERES) στο S. cerevisiae. Προκειμένου να ελέγξουμε την ταξινόμηση του ER, χρησιμοποιήσαμε ένα γενετικό σύστημα που μπορεί να απεικονίσει άμεσα το νεοσυντιθέμενο φορτίο που εισέρχεται στο ERES in vivo (7, 23). Ως φορτίο, επιλέξαμε την GPI-AP Gas1 με βάση το κεραμίδιο C26, επισημασμένη με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και την διαμεμβρανική εκκρινόμενη πρωτεΐνη Mid2, επισημασμένη με φθορίζουσα πρωτεΐνη εγγύς υπέρυθρου (iRFP), οι οποίες στοχεύουν και οι δύο την πλασματική μεμβράνη (24-26). Στο μεταλλαγμένο στέλεχος sec31-1, ευαίσθητο στη θερμοκρασία, αυτά τα δύο φορτία εκφράζονται υπό έναν προαγωγέα που επάγεται από τη γαλακτόζη και έναν συστατικό δείκτη ERES. Σε ακραίες θερμοκρασίες (37°C), επειδή η μετάλλαξη sec31-1 επηρεάζει τη λειτουργία του συστατικού του περιβλήματος COPII Sec31 για να αναστέλλει τη βλάστηση του COPII και την εξαγωγή του ERES, το νεοσυντιθέμενο φορτίο συσσωρεύεται στο ER (23). Μετά την ψύξη σε χαμηλή θερμοκρασία (24°C), τα μεταλλαγμένα κύτταρα sec31-1 ανακτήθηκαν από την εκκριτική περιοχή και το συσσωρευμένο νέο συνθετικό φορτίο άρχισε να εξάγεται από το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER). Η απεικόνιση CLIM έδειξε ότι το μεγαλύτερο μέρος του νεοσυντιθέμενου Gas1-GFP και Mid2-iRFP εξακολουθούσε να συσσωρεύεται στο ER των μεταλλαγμένων κυττάρων sec31-1 μετά από επώαση στους 37°C και στη συνέχεια απελευθερώθηκε στους 24°C για 5 λεπτά (Σχήμα 1). Δεδομένου ότι το Mid2-iRFP κατανέμεται σε ολόκληρη τη μεμβράνη του ER και το Gas1-GFP συγκεντρώνεται και συγκεντρώνεται στην ασυνεχή περιοχή της μεμβράνης του ER, η κατανομή τους είναι εντελώς διαφορετική (Σχήμα 1, A έως C και Ταινία S1). Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1D, το σύμπλεγμα Gas1-GFP δεν έχει Mid2-iRFP. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η GPI-AP και οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε διαφορετικές περιοχές της μεμβράνης του ER νωρίς. Το σύμπλεγμα Gas1-GFP βρίσκεται δίπλα σε ένα συγκεκριμένο ERES που έχει επισημανθεί με την πρωτεΐνη περιβλήματος COPII Sec13 του mCherry (Σχήμα 1, E και F, και ταινία S1) (23).
Τα κύτταρα sec31-1 εκφράζουν εκκρίσεις που προκαλούνται από γαλακτόζη, ένα κεραμίδιο μακράς ακυλικής αλυσίδας (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, πράσινο) και την διαμεμβρανική πρωτεΐνη Mid2-iRFP (TMP, μπλε) και αυτή η εποικοδομητική σήμανση ERES. Η Sec13-mCherry (ERES, ματζέντα) επωάστηκε στους 37°C για 30 λεπτά, μετακινήθηκε στους 24°C και απεικονίστηκε με SCLIM 5 λεπτά αργότερα. (Α έως Γ) δείχνει μια αντιπροσωπευτική συγχωνευμένη ή μονή δισδιάστατη εικόνα ενός επιπέδου (Α), μια δισδιάστατη εικόνα προβολής 10 z-τμημάτων (Β) ή μια τρισδιάστατη εικόνα ημισφαιρίου κυττάρου του φορτίου και των δεικτών ERES (Γ). Γραμμή κλίμακας 1μm (Α και Β). Η μονάδα κλίμακας είναι 0,551μm (Γ). Το Gas1-GFP ανιχνεύθηκε σε διακριτές περιοχές ή συστάδες ERES, ενώ το Mid2-iRFP ανιχνεύθηκε και κατανεμήθηκε σε όλη τη μεμβράνη ER (Γ). (Δ) Το γράφημα δείχνει τη σχετική ένταση φθορισμού των Gas1-GFP και Mid2-iRFP στο σύμπλεγμα Gas1-GFP κατά μήκος της λευκής γραμμής βέλους (αριστερά). AU, αυθαίρετη μονάδα. (Ε και ΣΤ) αντιπροσωπεύουν την τρισδιάστατη εικόνα που συνδυάζει το σήμα goods και ERES. Τα συμπλέγματα Gas1-GFP ανιχνεύθηκαν κοντά στο συγκεκριμένο ERES. Η μονάδα κλίμακας είναι 0,551μm. (ΣΤ) Το λευκό συμπαγές βέλος σηματοδοτεί το σύμπλεγμα Gas1-GFP που σχετίζεται με το ERES. Τα μεσαία και δεξιά πλαίσια δείχνουν τη συγχωνευμένη μεγεθυμένη τρισδιάστατη εικόνα και μια περιστρεφόμενη όψη του επιλεγμένου συμπλέγματος Gas1-GFP.
Η στενή χωρική σχέση μεταξύ του συμπλέγματος Gas1-GFP και ενός συγκεκριμένου ERES υποδεικνύει ότι το Gas1-GFP μπορεί να εισέλθει σε επιλεκτικό ERES, κάτι που διαφέρει από την επιλεκτικότητα που χρησιμοποιείται από το Mid2-iRFP για την έξοδο από το ER. Για να αντιμετωπίσουμε αυτήν την πιθανότητα, ποσοτικοποιήσαμε την αναλογία ERES μόνο για ένα ή δύο αγαθά (Σχήμα 2, A έως C). Διαπιστώσαμε ότι τα περισσότερα ERES (70%) περιέχουν μόνο έναν τύπο φορτίου. Η κάτω εικόνα του Σχήματος 2C δείχνει δύο τυπικά παραδείγματα ERES με μόνο Gas1-GFP (Σχήμα 1) ή μόνο Mid2-iRFP (Σχήμα 2). Αντίθετα, περίπου το 20% του ERES περιέχει δύο φορτία που επικαλύπτονται στην ίδια περιοχή. Διαπιστώθηκε ότι ορισμένα ERES (10%) περιείχαν δύο τύπους φορτίου, αλλά ήταν απομονωμένα σε σαφώς διαφορετικές περιοχές. Επομένως, αυτή η στατιστική ανάλυση δείχνει ότι μετά την εξαγωγή του ER, το GPI-AP Gas1-GFP και το διαμεμβρανικό φορτίο Mid2-iRFP διαιρούνται σε διαφορετικά ERES (Σχήμα 2D). Αυτή η αποτελεσματικότητα ταξινόμησης είναι πολύ συνεπής με την προηγούμενη βιοχημική ανάλυση (6) και τον μορφολογικό προσδιορισμό (7). Μπορούμε επίσης να παρατηρήσουμε τη συμπεριφορά του φορτίου σε καραντίνα που εισέρχεται στο ERES (Σχήμα 2Ε και Ταινία S2). Το Σχήμα 2Ε δείχνει ότι μόνο ένα μικρό μέρος του Gas1-GFP (πάνελ 3) ή του Mid2-iRFP (πάνελ 4) εισέρχεται στο ERES από τη μία πλευρά και περιορίζεται σε μια διακριτή περιοχή. Το Πάνελ 5 του Σχήματος 2Ε δείχνει ότι το Gas1-GFP και το Mid2-iRFP μερικές φορές βρίσκονται στο ίδιο ERES, αλλά εισέρχονται από διαφορετικές πλευρές και συγκεντρώνονται σε ξεχωριστές περιοχές που μπορεί να αντιπροσωπεύουν διαφορετικά κυστίδια COPII. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι ο παρατηρούμενος διαχωρισμός και η ταξινόμηση του GPI-AP Gas1 με βάση το κεραμίδιο C26 ως επιλεκτικού ERES είναι ειδικός επειδή ένα άλλο φορτίο διαμεμβρανικής έκκρισης, η πρωτεΐνη πλασματικής μεμβράνης Axl2 με ετικέτα GFP (27), παρουσιάζει παρόμοια συμπεριφορά με το Mid2-iRFP. (Εικόνα S1 και Ταινία S3). Η νεοσυντιθέμενη Axl2-GFP κατανέμεται μέσω της μεμβράνης του ERES όπως η Mid2-iRFP (Σχήμα S1, A και B) και συνεντοπίζεται με την Mid2-iRFP στα περισσότερα ERES (Σχήμα S1, B έως D). Τα Πάνελ 1 και 2 του Σχήματος 1. S1C δείχνουν δύο τυπικά παραδείγματα ERES όπου δύο διαμεμβρανικά φορτία επικαλύπτονται. Σε αυτές τις περιπτώσεις, και τα δύο αγαθά εισέρχονται στο ERES μαζί (Σχήμα S1E, Πάνελ 3 και Ταινία S3).
Τα κύτταρα sec31-1 που εκφράζουν εκκρίσεις που προκαλούνται από γαλακτόζη, Gas1-GFP (GPI-AP, πράσινο) και Mid2-iRFP (TMP, μπλε) και η συστατική σήμανση ERES Sec13-mCherry (ERES, ματζέντα) τοποθετήθηκαν στους 37°C. Μετά από επώαση για 30 λεπτά στους °C, μετακινήστε τους στους 24°C για να απελευθερώσετε το μπλοκ έκκρισης και απεικονίστε με SCLIM μετά από 20 λεπτά. (A έως C) Αντιπροσωπευτικές εικόνες προβολής 2D (A· γραμμή κλίμακας, 1μm) ή εικόνες τρισδιάστατων ημισφαιρίων κυττάρων (B και C· μονάδα κλίμακας, 0,456μm) του φορτίου και 10 z-τομές που σημειώνονται με ERES. Το κάτω πλαίσιο στο (B) και το πλαίσιο στο (C) εμφανίζουν επεξεργασμένες εικόνες για να εμφανίσουν μόνο τα αγαθά που υπάρχουν στο ERES (ματζέντα) [Gas1-GFP (γκρι) και Mid2-iRFP (ανοιχτό μπλε)]. (C) Ανοιχτό βέλος: Το ERES φέρει μόνο ένα τεμάχιο φορτίου (1 έως 4). Γκρι βέλος: Το ERES περιέχει διαχωρισμένο φορτίο (5). Λευκό συμπαγές βέλος: Το ERES περιέχει συστεγασμένο φορτίο. Παρακάτω: Το επιλεγμένο μοναδικό ERES περιέχει μόνο Gas1-GFP (1) ή Mid2-iRFP (2). Γραμμή κλίμακας, 100 nm. (D) Ποσοτικοποίηση της φωτομικρογραφίας που περιγράφεται στο (C). Το μέσο ποσοστό του ERES που περιέχει μόνο ένα φορτίο (Gas1-GFP ή Mid2-iRFP), διαχωρισμένο φορτίο και επικαλυπτόμενο φορτίο. Σε τρία ανεξάρτητα πειράματα, n=432 σε 54 κελιά. Γραμμή σφάλματος = SD. Αμφίπλευρη μη ζευγαρωμένη δοκιμή t. *** P = 0,0002. (E) Τρισδιάστατη εικόνα επιλεγμένου ERES φορτίου σε καραντίνα που σημειώνεται με (C). Το Gas1-GFP (πράσινο) (3) ή το Mid2-iRFP (μπλε) (4) εισέρχεται στο ERES (ματζέντα) από τη μία πλευρά και περιορίζεται σε μια μικρή περιοχή εντός του ERES. Μερικές φορές, και οι δύο τύποι φορτίου εισέρχονται στο ίδιο ERES (5) από την ίδια πλευρά και περιορίζονται σε μια απομονωμένη περιοχή εντός του ERES. Γραμμή κλίμακας, 100 nm.
Στη συνέχεια, εξετάσαμε μια υπόθεση ότι το κεραμίδιο μακράς ακυλικής αλυσίδας (C26) που υπάρχει στη μεμβράνη του ER οδηγεί στην ειδική ομαδοποίηση και ταξινόμηση του Gas1 σε επιλεκτικό ERES. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε ένα τροποποιημένο στέλεχος ζύμης GhLag1, στο οποίο οι δύο ενδογενείς συνθάσες κεραμιδίου Lag1 και Lac1 αντικαταστάθηκαν από GhLag1 (το ομόλογο Lag1 του βαμβακιού), με αποτέλεσμα ένα στέλεχος ζύμης με στέλεχος κεραμιδίου κυτταρικής μεμβράνης μικρότερο από το άγριο τύπο (Σχήμα 3Α) (28). Η ανάλυση φασματομετρίας μάζας (MS) έδειξε ότι στα στελέχη άγριου τύπου, το 95% του συνολικού κεραμιδίου είναι κεραμίδιο πολύ μακράς (C26) αλυσίδας, ενώ στο GhLag1, το 85% του κεραμιδίου είναι πολύ μακριά (C18 και C16). Μόνο το 2% του κεραμιδίου είναι κεραμίδιο πολύ μακράς (C26) αλυσίδας. Παρόλο που τα κεραμίδια C18 και C16 είναι τα κύρια κεραμίδια που έχουν ανιχνευθεί μέχρι στιγμής στη μεμβράνη GhLag1, η ανάλυση MS επιβεβαίωσε επίσης ότι η άγκυρα GPI του Gas1-GFP που εκφράζεται στο στέλεχος GhLag1 περιέχει κεραμίδιο C26, το οποίο είναι συγκρίσιμο με τα λιπίδια άγριου τύπου. Η ποιότητα είναι η ίδια (Εικ. 3Α) (26). Επομένως, αυτό σημαίνει ότι το ένζυμο αναδιαμόρφωσης κεραμιδίου Cwh43 είναι εξαιρετικά επιλεκτικό για το κεραμίδιο C26, όπως φαίνεται στο Σχήμα 26, ενσωματώνει κατά προτίμηση την άγκυρα GPI από μια μικρή ποσότητα κεραμιδίου C26 στο στέλεχος GhLag1. S2 (29). Παρ' όλα αυτά, η κυτταρική μεμβράνη του GhLag1 περιέχει βασικά μόνο κεραμίδιο C18-C16, ενώ το Gas1-GFP εξακολουθεί να έχει κεραμίδιο C26. Αυτό το γεγονός καθιστά αυτό το στέλεχος ιδανικό εργαλείο για την ειδική επίλυση του προβλήματος του μήκους της ακυλικής αλυσίδας του κεραμιδίου μεμβράνης στο ER. Ο υποθετικός ρόλος της τάξης και της ταξινόμησης. Στη συνέχεια, μελετήσαμε αρχικά την ικανότητα του C26 Gas1-GFP να συσσωρεύεται σε συστάδες στο GhLag1 με ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο sec31-1 ευαίσθητο στη θερμοκρασία μέσω συμβατικής μικροσκοπίας φθορισμού, όπου μόνο η μακριά (C18-C16) αλυσίδα υπάρχει στην μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ERC Ceramide) (Εικ. 3). Παρατηρήσαμε ότι στο sec31-1, το μεγαλύτερο μέρος του Gas1-GFP ήταν συγκεντρωμένο σε συστάδες, ενώ το Gas1-GFP στο sec31-1 GhLag1 με μακριά (C18-C16) μεμβράνη ER κεραμιδίου δεν ήταν κυρίως συσταδοποιημένο και κατανεμημένο σε ολόκληρη τη μεμβράνη του ER. Για να είμαστε ακριβείς, επειδή η συσταδοποίηση με βάση το κεραμίδιο C26 σχετίζεται στενά με συγκεκριμένα ERES (Εικόνα 1), στη συνέχεια διερευνήσαμε εάν αυτή η διαδικασία μπορεί επίσης να περιλαμβάνει τη λειτουργία του μηχανισμού εξαγωγής πρωτεΐνης ER. Το GPI-AP χρησιμοποιεί ένα ειδικό σύστημα COPII για την εξαγωγή ER, το οποίο ρυθμίζεται ενεργά από τη δομική αναδιαμόρφωση του τμήματος γλυκάνης της άγκυρας GPI από το Ted1 (30, 31). Η ανασυνδυασμένη GPI-γλυκάνη αναγνωρίζεται στη συνέχεια από το σύμπλεγμα διαμεμβρανικού υποδοχέα φορτίου p24, το οποίο με τη σειρά του στρατολογεί επιλεκτικά την Lst1, η οποία είναι μια ειδική ισομορφή της κύριας υπομονάδας δέσμευσης φορτίου COPII Sec24, σχηματίζοντας μια πλούσια σε GPI-AP υπομονάδα COPII. Είναι απαραίτητα κυστίδια (31-33). Επομένως, κατασκευάσαμε ένα διπλό μεταλλαγμένο στέλεχος που συνδύαζε τη διαγραφή αυτών των μεμονωμένων πρωτεϊνών (το συστατικό του συμπλέγματος p24 Emp24, το ένζυμο αναδιαμόρφωσης GPI-γλυκάνης Ted1 και η ειδική υπομονάδα COPII Lst1) με το μεταλλαγμένο στέλεχος sec31-1 και μελετήσαμε εάν είναι δυνατόν να σχηματιστεί GFP συμπλέγματος Gas1 (Σχήμα 3). Παρατηρήσαμε ότι στις sec31-1emp24Δ και sec31-1ted1Δ, η Gas1-GFP είναι κυρίως μη συμπλεγμένη και κατανεμημένη σε όλη την μεμβράνη του ER, όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως στο sec31-1 GhLag1, ενώ στο sec31-1lst1Δ, η Gas1-GFP είναι όπως η sec31-1. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι εκτός από την παρουσία κεραμιδίου C26 στη μεμβράνη του ER, η συσσωμάτωση του Gas1-GFP πρέπει επίσης να συνδεθεί με το σύμπλοκο p24 και δεν απαιτεί ειδική στρατολόγηση Lst1. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την πιθανότητα το μήκος της αλυσίδας του κεραμιδίου στη μεμβράνη του ER να μπορεί να ρυθμίζει τη σύνδεση του Gas1-GFP με το p24. Ωστόσο, διαπιστώσαμε ότι η παρουσία κεραμιδίου C18-C16 στη μεμβράνη δεν επηρεάζει τις GPI-γλυκάνες που ανακατασκευάζονται από το σύμπλοκο p24 (Σχήματα S3 και S4, A και B) ή τη σύνδεση με GPI-AP και την εξαγωγή GPI-AP. Στρατολόγηση υποτύπου COPII Lst1 (Σχήμα S4C). Επομένως, η συσσωμάτωση που εξαρτάται από το κεραμίδιο C26 δεν απαιτεί αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών με διαφορετικούς μηχανισμούς εξαγωγής πρωτεΐνης ER, αλλά υποστηρίζει έναν εναλλακτικό μηχανισμό διαλογής που καθοδηγείται από το μήκος των λιπιδίων. Στη συνέχεια, αναλύσαμε εάν το μήκος της αλυσίδας ακυλίου κεραμιδίου στη μεμβράνη του ER είναι σημαντικό για την αποτελεσματική ταξινόμηση του Gas1-GFP ως επιλεκτικού ERES. Δεδομένου ότι το Gas1 στο στέλεχος GhLag1 με κεραμίδιο βραχείας αλυσίδας εγκαταλείπει το ERS και εισέρχεται στην πλασματική μεμβράνη (Σχήμα S5), πιστεύουμε ότι εάν η διαλογή καθοδηγείται από το μήκος της ακυλο αλυσίδας του κεραμιδίου, το Gas1 στο στέλεχος GhLag1 μπορεί να ανακατευθυνθεί και να διασταυρωθεί. Αγαθά ERES με την ίδια μεμβράνη.
(Α) Η κυτταρική μεμβράνη του GhLag1 περιέχει κυρίως βραχύτερα κεραμίδια C18-C16, ενώ η άγκυρα GPI του Gas1-GFP εξακολουθεί να έχει την ίδια IPC C26 με τα κύτταρα άγριου τύπου. Πάνω: ανάλυση μήκους ακυλικής αλυσίδας του κεραμιδίου στην κυτταρική μεμβράνη στελεχών άγριου τύπου (Wt) και GhLag1p με φασματομετρία μάζας (MS). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό του συνολικού κεραμιδίου. Ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Γραμμή σφάλματος = SD. Δοκιμή t δύο ουρών χωρίς ζεύγη. **** P <0,0001. Κάτω πλαίσιο: Ανάλυση MS του μήκους ακυλικής αλυσίδας του IPC που υπάρχει στην άγκυρα GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) που εκφράζεται στα στελέχη άγριου τύπου και GhLag1p. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό του συνολικού σήματος IPC. Μέσος όρος πέντε ανεξάρτητων πειραμάτων. Γραμμή σφάλματος = SD. Δοκιμή t δύο ουρών χωρίς ζεύγη. ns, δεν είναι σημαντικό. P = 0,9134. (Β) Μικρογραφίες φθορισμού κυττάρων sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ και sec31-1lst1Δ που εκφράζουν Gas1-GFP που προκαλείται από γαλακτόζη επωάστηκαν στους 37°C για 30 λεπτά και διαβιβάστηκαν σε ρουτίνα μικροσκοπίας φθορισμού μετά από 24°C. Λευκό βέλος: Συστάδα Gas1-GFP ER. Ανοιχτό βέλος: Η μη συσσωματωμένη Gas1-GFP κατανέμεται σε ολόκληρη τη μεμβράνη ER, δείχνοντας τη χαρακτηριστική χρώση του πυρηνικού δακτυλίου ER. Γραμμή κλίμακας, 5μm. (Γ) Ποσοτικοποίηση της φωτομικρογραφίας που περιγράφεται στο (Β). Το μέσο ποσοστό κυττάρων με διάστικτη δομή Gas1-GFP. Σε τρία ανεξάρτητα πειράματα, n≥300 κύτταρα. Γραμμή σφάλματος = SD. Δοκιμή t δύο ουρών χωρίς ζεύγη. **** P <0,0001.
Για να λύσουμε άμεσα αυτό το πρόβλημα, πραγματοποιήσαμε απεικόνιση SCLIM της Gas1-GFP και της Mid2-iRFP στο GhLag1 με το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο sec31-1 ευαίσθητο στη θερμοκρασία (Σχήμα 4 και Ταινία S4). Αφού το ER διατηρήθηκε στους 37°C και στη συνέχεια απελευθερώθηκε στους 24°C, το μεγαλύτερο μέρος της νεοσυντιθέμενης Gas1-GFP δεν ήταν ομαδοποιημένο και κατανεμημένο σε όλη τη μεμβράνη του ER, όπως παρατηρήθηκε από συμβατικά μικροσκόπια (Σχήμα 4, Α και Β). Επιπλέον, ένα μεγάλο ποσοστό του ERES (67%) περιλαμβάνει δύο τύπους φορτίου που βρίσκονται ταυτόχρονα σε αυτό (Σχήμα 4D). Τα Πάνελ 1 και 2 του Σχήματος 4C δείχνουν δύο τυπικά παραδείγματα ERES με επικαλυπτόμενα Gas1-GFP και Mid2-GFP. Επιπλέον, και τα δύο αγαθά στρατολογήθηκαν στο ίδιο ERES (Σχήμα 4Ε, πάνελ 3 και ταινία S4). Επομένως, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το μήκος της αλυσίδας ακυλίου κεραμιδίου στη μεμβράνη του ER είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας για τη συσσωμάτωση και την ταξινόμηση της πρωτεΐνης ER.
Κύτταρα Sec31-1 GhLag1 που εκφράζουν εκκρίσεις που προκαλούνται από γαλακτόζη, Gas1-GFP (GPI-AP, πράσινο) και Mid2-iRFP (TMP, μπλε) και συστατικό Sec13-mCherry με σήμανση ERES (ERES, ματζέντα). Επωάστε στους 37°C. Συνεχίστε για 30 λεπτά, μειώστε τη θερμοκρασία στους 24°C για την απελευθέρωση εκκρίσεων και απεικονίστε με SCLIM μετά από 20 λεπτά. (A έως C) Αντιπροσωπευτικές εικόνες προβολής 2D (A· γραμμή κλίμακας, 1μm) ή εικόνες τρισδιάστατων ημισφαιρίων κυττάρων (B και C· μονάδα κλίμακας, 0,45μm) των 10 z-τμημάτων που σημειώνονται με φορτίο και ERES. Το κάτω πλαίσιο στο (B) και το πλαίσιο στο (C) εμφανίζουν επεξεργασμένες εικόνες για να εμφανίσουν μόνο τα αγαθά που υπάρχουν στο ERES (ματζέντα) [Gas1-GFP (γκρι) και Mid2-iRFP (ανοιχτό μπλε)]. (C) Βέλος γεμάτο λευκό: ERES, αγαθά επικαλύπτονται. Ανοιχτό βέλος: Το ERES περιέχει μόνο ένα στοιχείο. Κάτω πλαίσιο: Το επιλεγμένο ERES έχει επικαλυπτόμενα αγαθά (1 και 2) που σημειώνονται στο (C). Γραμμή κλίμακας, 100 nm. (D) Ποσοτικοποίηση της φωτομικρογραφίας που περιγράφεται στο (C). Στις μονάδες sec31-1 και sec31-1 GhLag1, περιλαμβάνεται μόνο ένα φορτίο (Gas1-GFP ή Mid2-iRFP) και το μέσο ποσοστό ERES για μεμονωμένο φορτίο και επικαλυπτόμενο φορτίο. Σε τρία ανεξάρτητα πειράματα, n = 432 σε 54 κελιά (sec31-1) και n = 430 σε 47 κελιά (sec31-1 GhLag1). Γραμμή σφάλματος = SD. Δοκιμή t δύο ουρών χωρίς ζεύγη. *** P = 0,0002 (sec31-1) και ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Τρισδιάστατη εικόνα επιλεγμένου ERES με επικαλυπτόμενο φορτίο (3) που σημειώνεται στο (C). Τα Gas1-GFP (πράσινο) και Mid2-iRFP (μπλε) προσεγγίζουν το ERES (ματζέντα) από την ίδια πλευρά και παραμένουν στην ίδια περιορισμένη περιοχή ERES. Γραμμή κλίμακας, 100 nm.
Αυτή η μελέτη παρέχει άμεσες in vivo αποδείξεις ότι τα πρωτεϊνικά φορτία με βάση τα λιπίδια ταξινομούνται σε επιλεκτικές θέσεις εξαγωγής στην εκκριτική οδό και αποκαλύπτει τη σημασία του μήκους της ακυλικής αλυσίδας για την επιλεκτικότητα της ταξινόμησης. Χρησιμοποιώντας μια ισχυρή και πρωτοποριακή τεχνική μικροσκοπίας που ονομάζεται SCLIM, παρουσιάσαμε το πρόσφατα συντεθειμένο Gas1-GFP (ένα σημαντικό GPI-AP της πλασματικής μεμβράνης με ένα πολύ μακρύ τμήμα λιπιδίου κεραμιδίου ακυλικής αλυσίδας (C26)) σε ζυμομύκητες. Οι περιοχές που ομαδοποιούνται σε διακριτά ERS σχετίζονται με συγκεκριμένα ERES, ενώ οι διαμεμβρανικές εκκρινόμενες πρωτεΐνες κατανέμονται σε όλη τη μεμβράνη του ER (Σχήμα 1). Επιπλέον, αυτοί οι δύο τύποι αγαθών εισέρχονται επιλεκτικά σε διαφορετικά ERES (Σχήμα 2). Το μήκος της ακυλικής αλυσίδας του κυτταρικού κεραμιδίου στη μεμβράνη μειώνεται από C26 σε C18-C16, η συστάδα Gas1-GFP διασπάται στην διακριτή περιοχή ER και η Gas1-GFP αναδρομολογείται για να εγκαταλείψει το ER με την διαμεμβρανική πρωτεΐνη μέσω του ίδιου ERES (Σχήμα 3 και Σχήμα 3). 4).
Παρόλο που το GPI-AP χρησιμοποιεί έναν εξειδικευμένο πρωτεϊνικό μηχανισμό για την έξοδο από το ERES, διαπιστώσαμε ότι ο διαχωρισμός που εξαρτάται από τα κεραμίδια C26 δεν βασίζεται σε διαφορικές αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών που μπορεί να οδηγήσουν σε εξειδίκευση του ERES (Σχήματα S4 και S5). Αντίθετα, τα ευρήματά μας υποστηρίζουν έναν εναλλακτικό μηχανισμό ταξινόμησης που καθοδηγείται από τη συσσωμάτωση πρωτεϊνών με βάση τα λιπίδια και τον επακόλουθο αποκλεισμό άλλων φορτίων. Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι η περιοχή ή η συσσωμάτωση Gas1-GFP που σχετίζεται με ένα συγκεκριμένο ERES δεν διαθέτει την διαμεμβρανική εκκρινόμενη πρωτεΐνη Mid2-iRFP, γεγονός που υποδηλώνει ότι η συσσωμάτωση GPI-AP που εξαρτάται από τα κεραμίδια C26 θα διευκολύνει την είσοδό τους στο σχετικό ERES και ταυτόχρονα θα αποκλείσει τις διαμεμβρανικές εκκρίσεις που εισέρχονται σε αυτό το συγκεκριμένο ERES (Σχήματα 1 και 2). Αντίθετα, η παρουσία κεραμιδίων C18-C16 στη μεμβράνη του ER δεν προκαλεί το σχηματισμό περιοχών ή συσσωματωμάτων από το GPI-AP, επομένως δεν αποκλείουν ή αντικαθιστούν τις διαμεμβρανικές εκκρινόμενες πρωτεΐνες στο ίδιο ERES (Σχήματα 3 και 4). Επομένως, προτείνουμε ότι το κεραμίδιο C26 οδηγεί στον διαχωρισμό και την ταξινόμηση διευκολύνοντας τη συσσωμάτωση πρωτεϊνών που συνδέονται με συγκεκριμένα ERES.
Πώς επιτυγχάνεται αυτή η συσσωμάτωση που εξαρτάται από το κεραμίδιο C26 σε μια συγκεκριμένη περιοχή του ενδοπλασματικού δικτύου (ER); Η τάση του κεραμιδίου της μεμβράνης να διαχωρίζεται πλευρικά μπορεί να προκαλέσει τον σχηματισμό μικρών και ακαριαία διατεταγμένων λιπιδίων από το GPI-AP και το κεραμίδιο C26 στο πιο ακανόνιστο λιπιδικό περιβάλλον του ER, που περιέχει βραχύτερα και ακόρεστα γλυκερολιπίδια. Συσσωματώματα ποιότητας (17, 18). Αυτά τα μικρά προσωρινά συσσωματώματα μπορούν να συγχωνευθούν περαιτέρω σε μεγαλύτερα, πιο σταθερά συσσωματώματα μετά τη σύνδεση με το σύμπλεγμα p24 (34). Σε συμφωνία με αυτό, δείξαμε ότι το C26 Gas1-GFP πρέπει να αλληλεπιδράσει με το σύμπλεγμα p24 για να σχηματίσει μεγαλύτερα ορατά συσσωματώματα (Σχήμα 3). Το σύμπλεγμα p24 είναι ένα ετερόζυγο ολιγομερές που αποτελείται από τέσσερις διαφορετικές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες p24 σε ζυμομύκητες (35), το οποίο παρέχει πολυσθενή σύνδεση, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε διασταυρούμενη σύνδεση μικρών συσσωματωμάτων GPI-AP, δημιουργώντας έτσι μεγαλύτερο σταθερό συσσωμάτωμα (34). Η αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνικών εξωτομέων των GPI-APs μπορεί επίσης να συμβάλλει στη συσσωμάτωσή τους, όπως φαίνεται κατά τη μεταφορά Golgi σε πολωμένα επιθηλιακά κύτταρα θηλαστικών (36). Ωστόσο, όταν υπάρχει κεραμίδιο C18-C16 στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ER), όταν το σύμπλοκο p24 συνδέεται με το Gas1-GFP, δεν θα σχηματιστούν μεγάλες ξεχωριστές συστάδες. Ο υποκείμενος μηχανισμός μπορεί να εξαρτάται από τις συγκεκριμένες φυσικές και χημικές ιδιότητες του κεραμιδίου μακράς ακυλικής αλυσίδας. Βιοφυσικές μελέτες τεχνητών μεμβρανών δείχνουν ότι αν και τόσο τα κεραμίδια μακράς (C24) όσο και τα βραχείας (C18-C16) ακυλικής αλυσίδας μπορούν να προκαλέσουν διαχωρισμό φάσεων, μόνο τα κεραμίδια μακράς ακυλικής αλυσίδας (C24) μπορούν να προάγουν υψηλή καμπυλότητα και κάμψη της μεμβράνης για να αναδιαμορφώσουν την μεμβράνη. Μέσω αμοιβαίας αναφοράς (17, 37, 38). Έχει αποδειχθεί ότι η διαμεμβρανική έλικα του TMED2, του ανθρώπινου ομολόγου του Emp24, αλληλεπιδρά επιλεκτικά με σφιγγομυελίνη με βάση το κεραμίδιο C18 στα κυτταροπλασματικά λοβίδια (39). Χρησιμοποιώντας προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (MD), διαπιστώσαμε ότι τόσο τα κεραμίδια C18 όσο και τα C26 συσσωρεύονται γύρω από τα κυτταροπλασματικά λοβίδια της διαμεμβρανικής έλικας Emp24 και έχουν παρόμοιες προτιμήσεις (Σχήμα S6). Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτό υποδεικνύει ότι η διαμεμβρανική έλικα του Emp24 μπορεί να οδηγήσει σε ασύμμετρη κατανομή λιπιδίων στη μεμβράνη. Αυτό είναι ένα πρόσφατο αποτέλεσμα που βασίζεται σε κύτταρα θηλαστικών. Παρόμοιες προσομοιώσεις MD δείχνουν επίσης την παρουσία αιθερικών λιπιδίων (40). Επομένως, εικάζουμε ότι το κεραμίδιο C26 στα δύο λοβίδια του ER26 είναι τοπικά εμπλουτισμένο. Όταν η GPI-AP στα λοβίδια του αυλού συνδέεται απευθείας με την πολυσθενή p24 και η συσσώρευση κεραμιδίου C26 γύρω από την p24 στα κυτταροπλασματικά λοβίδια, μπορεί να προωθήσει τη συνοδευτική συσσωμάτωση πρωτεϊνών και η καμπυλότητα της μεμβράνης δημιουργείται μέσω των δακτύλων (41), προκαλώντας τον διαχωρισμό της GPI-AP σε διακριτές περιοχές δίπλα στο ERES, γεγονός που ευνοεί επίσης τις έντονα καμπυλωμένες περιοχές της μεμβράνης ER (42). Προηγούμενες αναφορές υποστήριξαν τον προτεινόμενο μηχανισμό (43, 44). Η πολυδύναμη σύνδεση ολιγολεκτινών, παθογόνων ή αντισωμάτων σε γλυκοσφιγγολιπίδια (GSL) με βάση το κεραμίδιο στην πλασματική μεμβράνη πυροδοτεί μεγάλη συσσωμάτωση GSL, ενισχύει τον διαχωρισμό φάσεων και προκαλεί παραμόρφωση και εσωτερίκευση της μεμβράνης (44). Iwabuchi κ.λπ. (43) Διαπιστώθηκε ότι παρουσία μακρών (C24) αλλά όχι βραχέων (C16) ακυλικών αλυσίδων, ο πολυδύναμος υποκαταστάτης που συνδέεται με το λακτοσυλκεραμίδιο GSL προκάλεσε τον σχηματισμό μεγάλων συστάδων και την εισχώρηση της μεμβράνης, και η μεταγωγή σήματος που προκαλείται από το Lyn στο κυτταρόπλασμα στα φυλλίδια παρεμβάλλεται από ακυλικές αλυσίδες σε συζευγμένα ουδετερόφιλα.
Στα πολωμένα επιθηλιακά κύτταρα των θηλαστικών, η συγκέντρωση του δικτύου αντι-Golgi (TGN) στο επίπεδο της κορυφαίας πλασματικής μεμβράνης ελέγχει τον διαχωρισμό και τη διαλογή του GPI-AP (10, 45). Αυτή η συσσωμάτωση καθοδηγείται από τον ολιγομερισμό του GPI-AP (36), αλλά μπορεί επίσης να εξαρτάται από το μήκος της αλυσίδας κεραμιδίου που βρίσκουμε στη ζύμη. Αν και το GPI-AP των θηλαστικών έχει μια άγκυρα με βάση αιθερικά λιπίδια και η χημική του δομή είναι πολύ διαφορετική από το κεραμίδιο πολύ μακριάς ακυλικής αλυσίδας, μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι και τα δύο λιπίδια έχουν εξελικτικά παρόμοιες φυσικές και χημικές ιδιότητες και λειτουργία (40). Επομένως, το αιθερικό λιπιδικό μέρος στα κύτταρα των θηλαστικών μπορεί να είναι παρόμοιο με το κεραμίδιο C26 στη ζύμη και ο ρόλος του είναι να συνδέεται με το κεραμίδιο μακράς αλυσίδας στη μεμβράνη για να προάγει τη συσσωμάτωση και τη διαλογή του GPI-AP. Αν και αυτή η πιθανότητα πρέπει ακόμη να δοκιμαστεί άμεσα, προηγούμενα ευρήματα υποστηρίζουν ότι η μεταφορά του κεραμιδίου μακράς ακυλικής αλυσίδας στο σώμα Golgi δεν πραγματοποιείται από κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες μεταφοράς, αλλά εξαρτάται από τη σύνθεση άγκυρων GPI όπως η ζύμη. Επομένως, ο εξελικτικός συντηρητικός μηχανισμός φαίνεται να είναι σε θέση να μεταφέρει επιλεκτικά κεραμίδιο πολύ μακράς ακυλικής αλυσίδας και GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) στο ίδιο κυστίδιο μεταφοράς.
Στα συστήματα πολωμένων επιθηλιακών κυττάρων ζύμης και θηλαστικών, η συσσωμάτωση και ο διαχωρισμός της GPI-AP από άλλες πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης συμβαίνουν πριν φτάσουν στην κυτταρική επιφάνεια. Οι Paladino et al. (48) διαπίστωσαν ότι στο TGN των πολωμένων επιθηλιακών κυττάρων θηλαστικών, η ομαδοποίηση της GPI-AP δεν είναι απαραίτητη μόνο για την επιλεκτική ταξινόμηση των GPI-AP στην κορυφαία πλασματική μεμβράνη, αλλά ρυθμίζει επίσης την οργάνωση ομαδοποίησης των GPI-AP και τη βιολογική της δράση. Κυτταρική επιφάνεια. Στη ζύμη, αυτή η μελέτη έδειξε ότι η εξαρτώμενη από κεραμίδιο C26 συστάδα GPI-AP στο ER μπορεί να ρυθμίσει την οργάνωση της συστάδας και τη λειτουργική δραστηριότητα της GPI-AP στην πλασματική μεμβράνη (24, 49). Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, τα κύτταρα GhLag1 είναι αλλεργικά σε αναστολείς GPI ή σε φάρμακα που επηρεάζουν την ακεραιότητα του κυτταρικού τοιχώματος (28), και η ανάγκη για λειτουργικές συστάδες Gas1-GFP (49) του κεραμιδίου της άκρης που προβάλλεται κατά το ζευγάρωμα των κυττάρων ζύμης υποδεικνύει G​​​ Πιθανές φυσιολογικές συνέπειες των κυττάρων hLag1. Σφάλμα GPI-AP. Ωστόσο, η περαιτέρω διερεύνηση του κατά πόσον η λειτουργική οργάνωση της κυτταρικής επιφάνειας έχει προγραμματιστεί από το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) με μια μέθοδο ταξινόμησης που βασίζεται στο μήκος των λιπιδίων θα αποτελέσει το αντικείμενο της μελλοντικής μας έρευνας.
Τα στελέχη Saccharomyces cerevisiae που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή την εργασία παρατίθενται στον Πίνακα S1. Τα στελέχη MMY1583 και MMY1635 του SCLIM για απεικόνιση ζωντανών κυττάρων κατασκευάστηκαν στο υπόβαθρο του W303. Αυτά τα στελέχη που εκφράζουν Sec13-mCherry με φθορίζουσα πρωτεϊνική ετικέτα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μια μέθοδο βασισμένη στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) με πλασμίδιο pFA6a ως πρότυπο (23). Το στέλεχος που εκφράζει Mid2-iRFP επισημασμένο με φθορίζουσα πρωτεΐνη υπό τον έλεγχο του υποκινητή GAL1 κατασκευάστηκε ως εξής. Ενίσχυση PCR της αλληλουχίας iRFP-KanMx από τον φορέα pKTiRFP-KAN (δωρεά του E. O'Shea, αριθμός πλασμιδίου Addgene 64687· http://n2t.net/addgene: 64687· αναγνωριστικό ερευνητικού πόρου (RRID): Addgene_64687) και εισήχθησαν στο C-τελικό άκρο του ενδογενούς Mid2. Αφού η αλληλουχία γονιδιώματος Mid2-iRFP ενισχύθηκε και κλωνοποιήθηκε στον υποκινητή GAL1, ενσωματώθηκε στη θέση Not I-Sac I του πλασμιδίου ενσωμάτωσης pRS306. Το προκύπτον πλασμίδιο pRGS7 γραμμικοποιήθηκε με Pst I για να ενσωματωθεί στον τόπο URA3.
Το γονίδιο σύντηξης Gas1-GFP εκφράζεται υπό τον έλεγχο του υποκινητή GAL1 στο πλασμίδιο κεντρομερούς (CEN), το οποίο κατασκευάζεται ως εξής. Η αλληλουχία Gas1-GFP ενισχύθηκε με PCR από το πλασμίδιο pRS416-GAS1-GFP (24) (δώρο του L. Popolo) και κλωνοποιήθηκε στη θέση Xma I–Xho I του πλασμιδίου CEN pBEVY-GL LEU2 (δώρο του C). Miller; Αριθμός πλασμιδίου Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Το προκύπτον πλασμίδιο ονομάστηκε pRGS6. Το γονίδιο σύντηξης Axl2-GFP εκφράζεται επίσης υπό τον έλεγχο του υποκινητή GAL1 του φορέα pBEVY-GL LEU2 και η κατασκευή του έχει ως εξής. Η αλληλουχία Axl2-GFP ενισχύθηκε από το πλασμίδιο pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) με PCR και κλωνοποιήθηκε στη θέση Bam HI-Pst I του φορέα pBEVY-GL LEU2. Το προκύπτον πλασμίδιο ονομάστηκε pRGS12. Η αλληλουχία των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη παρατίθεται στον Πίνακα S2.
Το στέλεχος συμπληρώθηκε με 0,2% αδενίνη και 2% γλυκόζη [YP-δεξτρόζη (YPD)], 2% ραφινόζη [YP-ραφινόζη] πλούσιο σε μέσο πρωτεΐνης εκχυλίσματος ζύμης (YP) (1% εκχύλισμα ζύμης και 2% πρωτεΐνη ept. (YPR)] ή 2% γαλακτόζη [YP-γαλακτόζη (YPG)] ως πηγή άνθρακα ή σε συνθετικό ελάχιστο μέσο (0,15% βάση αζώτου ζύμης και 0,5% θειικό αμμώνιο) για την συμπλήρωση των κατάλληλων αμινοξέων και βάσεων που απαιτούνται για τη διατροφή, και που περιείχε 2% γλυκόζη (συνθετικό ελάχιστο μέσο γλυκόζης) ή 2% γαλακτόζη (συνθετικό ελάχιστο μέσο γαλακτόζης) ως πηγή άνθρακα.
Για απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο, μεταλλαγμένα κύτταρα sec31-1 ευαίσθητα στη θερμοκρασία που εκφράζουν το κατασκεύασμα υπό τον υποκινητή GAL1 αναπτύχθηκαν σε μέσο YPR στους 24°C όλη τη νύχτα έως τη φάση mid-log. Μετά από επαγωγή σε YPG στους 24°C για 1 ώρα, τα κύτταρα επωάστηκαν σε SG στους 37°C για 30 λεπτά και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στους 24°C για απελευθέρωση από το μπλοκ έκκρισης. Η κονκαναβαλίνη Α χρησιμοποιήθηκε για τη σταθεροποίηση των κυττάρων σε γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα και απεικονίστηκαν με SCLIM. Το SCLIM είναι ένας συνδυασμός ανεστραμμένου μικροσκοπίου φθορισμού Olympus IX-71 και φακού λαδιού αριθμητικού διαφράγματος UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), σαρωτή ομοεστιακού περιστρεφόμενου δίσκου υψηλής ταχύτητας και υψηλής αναλογίας σήματος προς θόρυβο (Yokogawa Electric), προσαρμοσμένου φασματόμετρου και προσαρμοσμένης ψύξης. Ο ενισχυτής εικόνας του συστήματος (Hamamatsu Photonics) μπορεί να παρέχει ένα σύστημα μεγεθυντικών φακών με τελική μεγέθυνση ×266,7 και μια κάμερα συζευγμένου φορτίου που πολλαπλασιάζει ηλεκτρόνια (Hamamatsu Photonics) (21). Η λήψη εικόνας εκτελείται από προσαρμοσμένο λογισμικό (Yokogawa Electric). Για τρισδιάστατες εικόνες, χρησιμοποιήσαμε έναν ειδικά κατασκευασμένο πιεζοηλεκτρικό ενεργοποιητή για να δονήσουμε τον αντικειμενικό φακό κάθετα και συλλέξαμε τα οπτικά μέρη σε απόσταση 100 nm μεταξύ τους σε μια στοίβα. Η εικόνα Z-stack μετατρέπεται σε δεδομένα τρισδιάστατου voxel και η θεωρητική συνάρτηση εξάπλωσης σημείων που χρησιμοποιείται για το ομοεστιακό μικροσκόπιο περιστρεφόμενου δίσκου χρησιμοποιείται για την επεξεργασία αποσυνέλιξης από το λογισμικό Volocity (PerkinElmer). Χρησιμοποιώντας το λογισμικό Volocity για την αυτόματη ευθυγράμμιση του ορίου για την ανάλυση συντοπισμού, μετρήθηκε το ERES συμπεριλαμβανομένου του φορτίου. Η ανάλυση γραμμικής σάρωσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό MetaMorph (Molecular Devices).
Χρησιμοποιήστε το λογισμικό GraphPad Prism για να προσδιορίσετε τη στατιστική σημαντικότητα. Για το αμφίπλευρο t-test του Student και το τεστ συνήθους μονόδρομης ανάλυσης διακύμανσης (ANOVA), οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεωρούνται ότι έχουν σημαντικό αντίκτυπο στο P <0,05 (*).
Για τη φθορίζουσα μικροσκοπία του Gas1-GFP, τα κύτταρα λογαριθμικής φάσης αναπτύχθηκαν όλη τη νύχτα σε YPD και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, πλύθηκαν δύο φορές με αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά και επωάστηκαν σε πάγο για τουλάχιστον 15 λεπτά και στη συνέχεια προχώρησαν στο μικροσκόπιο όπως περιγράφηκε προηγουμένως στο Έλεγχος (24). Για τη λήψη χρησιμοποιήθηκε το μικροσκόπιο Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) εξοπλισμένο με αντικειμενικό φακό, φίλτρο L5 (GFP), κάμερα Hamamatsu και λογισμικό Application Suite X (LAS X).
Τα δείγματα μετουσιώθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS στους 65°C για 10 λεπτά και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου SDS (PAGE). Για ανάλυση ανοσοστύπωσης, φορτώθηκαν 10 μl δείγματος ανά λωρίδα. Πρωτογενές αντίσωμα: Χρησιμοποιήστε πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-Gas1 σε αραίωση 1:3000, πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-Emp24 σε αραίωση 1:500 και πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-GFP (δωρεά από τον H. Riezman) σε αραίωση 1:3000. Το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-Pgk1 χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:5000 (δωρεά από τον J. de la Cruz). Δευτερογενές αντίσωμα: Συζευγμένη με υπεροξειδάση χρένου (HRP) ανοσοσφαιρίνη G (IgG) αίγας κατά κουνελιού σε αραίωση 1:3000 (Pierce). Συζευγμένη με HRP αίγας αντι-IgG ποντικού σε αραίωση 1:3000 (Pierce). Η ζώνη ανοσολογικής απόκρισης παρατηρήθηκε με τη μέθοδο χημειοφωταύγειας του αντιδραστηρίου SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Όπως περιγράφεται στο (31), πραγματοποιήθηκε ένα πείραμα φυσικής ανοσοκαθίζησης στο εμπλουτισμένο κλάσμα ER. Εν ολίγοις, πλύνετε τα κύτταρα ζύμης με ρυθμιστικό διάλυμα TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο και μείγμα αναστολέα πρωτεάσης) στα 600 nm (OD600) σε οπτική πυκνότητα 100 δύο φορές. Έσπασε με γυάλινες χάντρες και στη συνέχεια τα κυτταρικά υπολείμματα και οι γυάλινες χάντρες απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση. Το υπερκείμενο στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 17.000 g για 15 λεπτά στους 4°C. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε TNE και προστέθηκε σαπωνίνη δακτυλίτιδας σε τελική συγκέντρωση 1%. Το εναιώρημα επωάστηκε για 1 ώρα με περιστροφή στους 4°C και στη συνέχεια τα αδιάλυτα συστατικά απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στις 13.000 g στους 4°C για 60 λεπτά. Για την ανοσοκατακρήμνιση Gas1-GFP, πρώτα προεπωάστε το δείγμα με κενά σφαιρίδια αγαρόζης (ChromoTek) στους 4°C για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστε με GFP-Trap_A (ChromoTek) στους 4°C για 3 ώρες. Τα ανοσοκατακρημνισμένα σφαιρίδια πλύθηκαν πέντε φορές με TNE που περιείχε 0,2% διγοξιγενίνη, εκλούστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS, διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση.
Όπως περιγράφεται στο (31), πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός διασύνδεσης στο εμπλουτισμένο κλάσμα ER. Εν συντομία, το εμπλουτισμένο κλάσμα ER επωάστηκε με 0,5 mM διθειοδις(ηλεκτριμιδυλοπροπιονικό) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, ΗΠΑ· 20°C, 20 λεπτά). Η αντίδραση διασύνδεσης σβήστηκε με την προσθήκη γλυκίνης (τελική συγκέντρωση 50 mM, 5 λεπτά, 20°C).
Όπως περιγράφηκε προηγουμένως (50), πραγματοποιήθηκε ανάλυση MS του κεραμιδίου σε στελέχη άγριου τύπου και GhLag1. Εν ολίγοις, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε εκθετική φάση (3 έως 4 μονάδες OD600/ml) σε YPD στους 30°C και συλλέχθηκαν 25×107 κύτταρα. Ο μεταβολισμός τους σβήνεται με τριχλωροοξικό οξύ. Χρησιμοποιήστε διαλύτη εκχύλισης [αιθανόλη, νερό, αιθέρας, πυριδίνη και υδροξείδιο του αμμωνίου 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] και 1,2 nmol εσωτερικού προτύπου ποιότητας κεραμιδίου C17 (860517, πολικό λιπίδιο Avanti)). Χρησιμοποιήστε αντιδραστήριο μονομεθυλαμίνης [μεθανόλη, νερό, n-βουτανόλη και διάλυμα μεθυλαμίνης (4:3:1:5 v/v)] για να πραγματοποιήσετε ήπια αλκαλική υδρόλυση του εκχυλίσματος και στη συνέχεια χρησιμοποιήστε n-βουτανόλη κορεσμένη με νερό για αφαλάτωση. Τέλος, το εκχύλισμα επαναιωρήθηκε σε διαλύτη θετικής λειτουργίας [χλωροφόρμιο/μεθανόλη/νερό (2:7:1) + 5 mM οξικό αμμώνιο] και εγχύθηκε στον φασματόμετρο μάζας. Πραγματοποιήθηκε παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων (MRM) για την ταυτοποίηση και την ποσοτικοποίηση των μορίων σφιγγολιπιδίων. Ο τριτοταγής τετραπολικός φασματόμετρο μάζας TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) είναι εξοπλισμένος με μια ρομποτική πηγή ιόντων νανοροής Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) για ανάλυση λιπιδίων. Η ενέργεια σύγκρουσης βελτιστοποιείται για κάθε κατηγορία κεραμιδίου. Τα δεδομένα MS ελήφθησαν σε θετική λειτουργία. Για κάθε βιολογική επανάληψη, το σήμα λιπιδίων είναι η διάμεση τιμή τριών ανεξάρτητων μετρήσεων.
Όπως περιγράφεται στο (31), τα κύτταρα (800×107) που εκφράζουν Gas1-GFP υποβλήθηκαν σε φυσική ανοσοκαθίζηση. Το καθαρισμένο Gas1-GFP διαχωρίστηκε με SDS-PAGE και μεταφέρθηκε σε μεμβράνη πολυβινυλιδενοφθοριδίου (PVDF). Η πρωτεΐνη απεικονίστηκε με χρώση του PVDF με μαύρο αμίδιο. Η ζώνη Gas1-GFP κόπηκε από το PVDF και πλύθηκε 5 φορές με μεθανόλη και μία φορά με νερό ποιότητας υγρής χρωματογραφίας-MS (LC-MS). Με επώαση της ταινίας μεμβράνης με 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), ρυθμιστικό διάλυμα και 500 μl φρεσκοδιαλυμένου μείγματος νιτρώδους νατρίου 1 M στους 37°C για 3 ώρες, το κλάσμα λιπιδίων απελευθερώνεται από το Gas1-GFP και λύεται. Απελευθέρωση κεραμιδίου φωσφορικής ινοσίνης μεταξύ γλυκοζαμίνης και ινοσιτόλης (51). Στη συνέχεια, η ταινία μεμβράνης πλύθηκε τέσσερις φορές με νερό ποιότητας LC-MS, ξηράνθηκε σε θερμοκρασία δωματίου και αποθηκεύτηκε σε ατμόσφαιρα αζώτου στους -80°C μέχρι την ανάλυση. Ως έλεγχος, χρησιμοποιήθηκε ένα κενό δείγμα μεμβράνης PVDF για κάθε πείραμα. Το λιπίδιο που εξήχθη από το Gas1-GFP αναλύθηκε στη συνέχεια με MS όπως περιγράφεται (50). Εν ολίγοις, οι ταινίες PVDF που περιείχαν GPI-λιπίδιο επαναιωρήθηκαν σε 75 μl αρνητικού διαλύτη μούχλας [χλωροφόρμιο/μεθανόλη (1:2) + 5 mM οξικό αμμώνιο] και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI)-MRM/MS των σφιγγολιπιδικών ειδών (TSQ Vantage). Σε αυτήν την περίπτωση, τα δεδομένα MS ελήφθησαν σε λειτουργία αρνητικών ιόντων.
Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, το λιπιδικό τμήμα της άγκυρας GPI διαχωρίστηκε από την GPI-AP που είχε επισημανθεί με [3H]-ινοσιτόλη (16). Τα λιπίδια διαχωρίστηκαν με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας χρησιμοποιώντας ένα σύστημα διαλύτη (55:45:10 χλωροφόρμιο-μεθανόλη-0,25% KCl) και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας FLA-7000 (Fujifilm).
Τα κύτταρα που εκφράζουν Gas1-GFP (600×107) πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα TNE με ρυθμιστικό διάλυμα TNE, θρυμματίστηκαν με γυάλινες χάντρες και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων και των γυάλινων σφαιριδίων. Το υπερκείμενο στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 17.000 g για 1 ώρα στους 4°C. Το ίζημα πλύθηκε σε TNE και επωάστηκε με 1 U PI-PLC (Invitrogen) σε TNE που περιείχε 0,2% σαπωνίνη δακτυλίτιδας για 1 ώρα στους 37°C. Μετά την ενζυμική επεξεργασία, η μεμβράνη απομακρύνθηκε με φυγοκέντρηση στις 17.000 g στους 4°C για 1 ώρα. Για την ανοσοκατακρήμνιση του Gas1-GFP, το υπερκείμενο επωάστηκε με GFP-Trap_A (ChromoTek) στους 4°C όλη τη νύχτα. Το καθαρισμένο Gas1-GFP που διαχωρίστηκε με SDS-PAGE χρωματίστηκε με λαμπρό μπλε Coomassie. Η ζώνη χρώσης Gas1-GFP αποκόπηκε από το γκρι που περιβάλλει το υδραγωγείο και στη συνέχεια, μετά από αλκυλίωση με ιωδοακεταμίδιο και αναγωγή με διθειοθρεϊτόλη, πραγματοποιήθηκε πέψη εντός πηκτής με θρυψίνη. Εκχύλιση και ξήρανση τρυπτικών πεπτιδίων και πεπτιδίων με GPI-γλυκάνες. Το ξηρό πεπτίδιο διαλύθηκε σε 20 μl νερού. Εγχύθηκε ένα μέρος (8 μl) στο LC. Μια στήλη οκταδεκυλιλανίου (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5· εσωτερική διάμετρος 150 mm×1.0 mm· Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Ιαπωνία) χρησιμοποιήθηκε για τον διαχωρισμό πεπτιδίων υπό συγκεκριμένες συνθήκες κλίσης. Η κινητή φάση είναι ο διαλύτης Α (0,08% μυρμηκικό οξύ) και ο διαλύτης Β (0,15% μυρμηκικό οξύ σε 80% ακετονιτρίλιο). Ένα σύστημα Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Βοστώνη, Μασαχουσέτη) χρησιμοποιήθηκε για την έκλουση της στήλης με τον διαλύτη Α εντός 55 λεπτών με ρυθμό ροής 50 μl min-1 για 5 λεπτά και στη συνέχεια η συγκέντρωση του διαλύτη Β αυξήθηκε στο 40%. (Ηνωμένες Πολιτείες). Το έκλουσμα εισήχθη συνεχώς στην πηγή ιόντων ESI και τα τρυπτικά πεπτίδια και τα πεπτίδια με GPI-γλυκάνες αναλύθηκαν με το LTQ Orbitrap XL (υβριδικός γραμμικός φασματόμετρο μάζας παγίδευσης ιόντων-ορμπιτράπ· Thermo Fisher Scientific). Στη ρύθμιση MS, η τάση της τριχοειδούς πηγής ρυθμίστηκε στα 4,5 kV και η θερμοκρασία του τριχοειδούς μεταφοράς διατηρήθηκε στους 300°C. Η τριχοειδής τάση και η τάση του φακού του σωλήνα ρυθμίστηκαν στα 15 V και 50 V, αντίστοιχα. Τα δεδομένα MS ελήφθησαν σε λειτουργία θετικών ιόντων (ανάλυση 60.000· ακρίβεια μάζας 10 μέρη ανά εκατομμύριο) σε εύρος μάζας 300/m/z με λόγο μάζας/φορτίου (m/z) 3000. Τα δεδομένα MS/MS λαμβάνονται μέσω της παγίδας ιόντων στο LTQ Orbitrap XL [τα πρώτα 3 ψηφία από τα οποία εξαρτώνται τα δεδομένα, διάσπαση που προκαλείται από σύγκρουση (CID)].
Οι προσομοιώσεις MD πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GROMACS (52) και το πεδίο δυνάμεων MARTINI 2 (53-55). Το εργαλείο δημιουργίας μεμβρανών CHARMM GUI (56, 57) χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για την κατασκευή μιας διπλοστιβάδας που περιείχε διολεοϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (DOPC) και Cer C18 ή DOPC και Cer C26. Η τοπολογία και οι συντεταγμένες του Cer C26 προέρχονται από το DXCE αφαιρώντας τα επιπλέον σφαιρίδια από την ουρά σφιγγοσίνης. Χρησιμοποιήστε τη διαδικασία που περιγράφεται παρακάτω για να εξισορροπήσετε τη διπλή στιβάδα και να την εκτελέσετε, στη συνέχεια χρησιμοποιήστε τις τελευταίες συντεταγμένες του συστήματος για να δημιουργήσετε ένα σύστημα που περιέχει Emp24. Η διαμεμβρανική περιοχή του ζυμομύκητα Emp24 (υπολείμματα 173 έως 193) κατασκευάστηκε ως α-έλικα χρησιμοποιώντας το οπτικό εργαλείο MD (VMD) μοριακή δομή (58). Στη συνέχεια, μετά την αφαίρεση των επικαλυπτόμενων λιπιδίων, η πρωτεΐνη κοκκοποιήθηκε χονδροειδώς και εισήχθη στη διπλοστιβάδα χρησιμοποιώντας το CHARMM GUI. Το τελικό σύστημα περιέχει 1202 DOPC και 302 Cer C26 ή 1197 DOPC και 295 Cer C18 και Emp24. Ιονίστε το σύστημα σε συγκέντρωση 0,150M. Πραγματοποιήθηκαν τέσσερις ανεξάρτητες επαναλήψεις για δύο συνθέσεις διπλοστοιβάδας.
Η λιπιδική διπλοστιβάδα εξισορροπείται χρησιμοποιώντας τη διαδικασία CHARMM GUI, η οποία περιλαμβάνει την ελαχιστοποίηση και στη συνέχεια την εξισορρόπηση 405.000 βημάτων, όπου οι περιορισμοί θέσης μειώνονται και εξαλείφονται σταδιακά και το χρονικό βήμα αυξάνεται από 0,005 ps σε 0,02 ps. Μετά την εξισορρόπηση, παράγει 6 µs με χρονικό βήμα 0,02 ps. Μετά την εισαγωγή του Emp24, χρησιμοποιήστε την ίδια διαδικασία CHARMM GUI για να ελαχιστοποιήσετε και να εξισορροπήσετε το σύστημα και στη συνέχεια εκτελέστε το για 8 δευτερόλεπτα στην παραγωγή.
Για όλα τα συστήματα, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας εξισορρόπησης, η πίεση ελέγχεται από τον βαροστάτη Berendsen (59), και κατά τη διάρκεια της διαδικασίας παραγωγής, η πίεση ελέγχεται από τον βαροστάτη Parrinello-Rahman (60). Σε όλες τις περιπτώσεις, η μέση πίεση είναι 1 bar και χρησιμοποιείται ένα ημι-ισότροπο σχήμα σύζευξης πίεσης. Στη διαδικασία εξισορρόπησης και παραγωγής, χρησιμοποιείται ένας θερμοστάτης (61) με επαναβαθμονόμηση ταχύτητας για τη σύζευξη της θερμοκρασίας των σωματιδίων πρωτεΐνης, λιπιδίου και διαλύτη αντίστοιχα. Κατά τη διάρκεια ολόκληρης της λειτουργίας, η θερμοκρασία-στόχος είναι 310K. Η αλληλεπίδραση χωρίς δεσμό υπολογίζεται δημιουργώντας μια λίστα ζευγαρώματος χρησιμοποιώντας το σχήμα Verlet με ανοχή ρυθμιστικού διαλύματος 0,005. Ο όρος Coulomb υπολογίζεται χρησιμοποιώντας το πεδίο αντίδρασης και μια απόσταση αποκοπής 1,1 nm. Ο όρος Vander Waals χρησιμοποιεί ένα σχήμα αποκοπής με απόσταση αποκοπής 1,1 nm, και το σχήμα αποκοπής Verlet χρησιμοποιείται για πιθανή μετατόπιση (62).
Χρησιμοποιώντας VMD, το μήκος κύματος αποκοπής μεταξύ των σφαιριδίων φωσφορικού DOPC ή των σφαιριδίων κεραμιδίου AM1 και της πρωτεΐνης είναι 0,7 nm και υπολογίζεται ο αριθμός των λιπιδίων που αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη. Σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο, υπολογίστε τον συντελεστή εξάντλησης-εμπλουτισμού (DE) όπως στο (63): Συντελεστής DE = (η ποσότητα των συνολικών λιπιδίων στην πρωτεΐνη 0,7) στην πρωτεΐνη 0,7 (η ποσότητα Cer στα συνολικά λιπίδια)
Η αναφερόμενη τιμή λαμβάνεται ως μέσος όρος και οι γραμμές σφάλματος είναι τέσσερα ανεξάρτητα αντίγραφα του SE. Η στατιστική σημαντικότητα του παράγοντα DE υπολογίζεται με το t test [(averageDE-factor-1)/SE]. Υπολογίστε την τιμή P από την μονόπλευρη κατανομή.
Το εργαλείο GROMACS χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του δισδιάστατου χάρτη πλευρικής πυκνότητας του συστήματος που περιέχει Emp24 εντός των τελευταίων 250 ns του ίχνους. Για να ληφθεί ο χάρτης εμπλουτισμού/εξάντλησης του κεραμιδίου, ο χάρτης πυκνότητας του Cer διαιρείται με το άθροισμα του χάρτη του Cer και του DOPC και στη συνέχεια διαιρείται με τη συγκέντρωση του Cer στο σώμα. Χρησιμοποιείται η ίδια κλίμακα χρωματικού χάρτη.
Για συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο, ανατρέξτε στη διεύθυνση http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης που διανέμεται σύμφωνα με τους όρους της Άδειας Creative Commons Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση, η οποία επιτρέπει τη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​εφόσον η τελική χρήση δεν αποσκοπεί σε εμπορικό κέρδος και η προϋπόθεση είναι ότι το πρωτότυπο έργο είναι σωστό. Αναφορά.
Σημείωση: Σας ζητάμε μόνο να δώσετε τη διεύθυνση email σας, ώστε το άτομο που προτείνετε στη σελίδα να γνωρίζει ότι θέλετε να δει το email και ότι δεν είναι ανεπιθύμητο. Δεν θα καταγράψουμε καμία διεύθυνση email.
Αυτή η ερώτηση χρησιμοποιείται για να ελεγχθεί εάν είστε επισκέπτης και να αποτραπεί η αυτόματη υποβολή ανεπιθύμητων μηνυμάτων.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero-Lopero-Lopero Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Η τρισδιάστατη απεικόνιση υψηλής ανάλυσης σε πραγματικό χρόνο αποκαλύπτει τη σημασία του μήκους της αλυσίδας κεραμιδίου για την ταξινόμηση πρωτεϊνών σε επιλεκτικές θέσεις εξόδου.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero-Lopero-Lopero Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Η τρισδιάστατη απεικόνιση υψηλής ανάλυσης σε πραγματικό χρόνο αποκαλύπτει τη σημασία του μήκους της αλυσίδας κεραμιδίου για την ταξινόμηση πρωτεϊνών σε επιλεκτικές θέσεις εξόδου.
©2020 American Association for the Advancement of Science. διατηρούνται όλα τα δικαιώματα. Η AAAS είναι συνεργάτης των HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef και COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.