Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη για CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Σε αντίθεση με τα σπονδυλωτά, τα έντομα θεωρείται ευρέως ότι δεν έχουν αρσενικές στεροειδείς ορμόνες φύλου. Στο Anopheles gambiae, το στεροειδές εκδυζόνης 20-υδροξυεκδυζόνη (20Ε) φαίνεται να έχει εξελιχθεί για να ελέγχει την ανάπτυξη των αυγών όταν συντίθεται από θηλυκά2 και να προκαλεί μια περίοδο ζευγαρώματος-ανερέθιστου όταν μεταφέρεται σεξουαλικά από αρσενικά3. Δεδομένου ότι η ανάπτυξη και το ζευγάρωμα των αυγών είναι βασικά αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά, η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο τα θηλυκά κουνούπια Anopheles ενσωματώνουν αυτά τα ορμονικά σήματα θα μπορούσε να διευκολύνει τον σχεδιασμό νέων προγραμμάτων ελέγχου της ελονοσίας. Εδώ, αποκαλύπτουμε ότι αυτές οι αναπαραγωγικές λειτουργίες ρυθμίζονται από διακριτά στεροειδή φύλου μέσω ενός πολύπλοκου δικτύου ενζύμων ενεργοποίησης/απενεργοποίησης των εκδυστεροειδών. Εντοπίσαμε μια ειδική για αρσενικά οξειδωμένη εκδυζόνη, την 3-δεϋδρο-20Ε (3D20E), η οποία προστατεύει την καταγωγή διακόπτοντας τη θηλυκή σεξουαλική δεκτικότητα μετά από σεξουαλική μεταφορά και ενεργοποίηση μέσω αποφωσφορυλίωσης. Αξιοσημείωτα, η μεταφορά 3D20E προκάλεσε επίσης την έκφραση αναπαραγωγικών γονιδίων που διατηρούν την ανάπτυξη των αυγών κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από Plasmodium, διασφαλίζοντας την υγεία των μολυσμένων θηλυκών. Το 20Ε που προέρχεται από θηλυκά δεν προκαλεί σεξουαλική απόκριση, αλλά επιτρέπει στα ζευγαρωμένα άτομα να γεννήσουν αυγά μετά την αναστολή των κινασών που αναστέλλουν το 20Ε. Η ταυτοποίηση αυτής της ειδικής για τα αρσενικά στεροειδούς ορμόνης εντόμων και ο ρόλος της στη ρύθμιση της γυναικείας σεξουαλικής δεκτικότητας, της γονιμότητας και της αλληλεπίδρασης με το Plasmodium υποδηλώνει τη δυνατότητα μείωσης της αναπαραγωγικής επιτυχίας των κουνουπιών που μεταδίδουν την ελονοσία.
Τα κρούσματα και οι θάνατοι από ελονοσία αυξάνονται ξανά4 λόγω της εκτεταμένης αντοχής στα εντομοκτόνα των κουνουπιών Anopheles, του μοναδικού φορέα των παρασίτων της ελονοσίας στον άνθρωπο. Η βιολογία ζευγαρώματος αυτών των κουνουπιών αποτελεί ιδιαίτερα ελκυστικό στόχο για νέες παρεμβάσεις ελέγχου της ελονοσίας, επειδή τα θηλυκά ζευγαρώνουν μόνο μία φορά5. Η στειρότητα αυτού του μοναδικού γεγονότος ζευγαρώματος θα είχε μεγάλες δυνατότητες για τη μείωση των πληθυσμών των κουνουπιών στο πεδίο.
Οι γυναίκες καθίστανται σεξουαλικά ανίκανες μετά τη λήψη στεροειδών ορμονών υψηλού τίτλου από άνδρες. Μελέτες έχουν δείξει ότι η αιτία για τη δυσκολία στο περαιτέρω ζευγάρωμα είναι η 20-υδροξυεκδυσόνη (20Ε), μια στεροειδής ορμόνη, περισσότερο γνωστή ως ρυθμιστής του κύκλου πτερόρροιας στο στάδιο της προνύμφης. Η ικανότητα των αρσενικών να συνθέτουν και να μεταφέρουν 20Ε έχει εξελιχθεί ειδικά στα είδη Anopheles που αποτελούν μέρος του υπογένους Cellia7, το οποίο διανέμεται στην Αφρική και περιλαμβάνει τους πιο επικίνδυνους φορείς της ελονοσίας, συμπεριλαμβανομένου του Anopheles gambiae. Αυτό είναι ιδιαίτερα αξιοσημείωτο επειδή σε αυτά τα είδη τα θηλυκά παράγουν επίσης 20Ε μετά από κάθε γεύμα αίματος, και το 20Ε οδηγεί τον κύκλο ωογένεσης (βλ. παραπομπή 8). Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον τρόπο με τον οποίο τα θηλυκά ενσωματώνουν σήματα από δύο διαφορετικές πηγές εκδυσόνης (μεταφορά αρσενικών και επαγωγή σίτισης με αίμα) χωρίς να διακυβεύουν τη δική τους ικανότητα ζευγαρώματος. Στην πραγματικότητα, εάν το 20Ε που παράγεται από τα θηλυκά πυροδοτεί σεξουαλική δυσανεξία, αυτό θα οδηγήσει σε στειρότητα σε άτομα που τρέφονται παρθένα, μια πολύ κοινή συμπεριφορά σε αυτά τα κουνούπια5.
Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι τα αρσενικά A. gambiae μεταφέρουν μια τροποποιημένη εκδυσόνη ειδική για τα αρσενικά, η οποία ενεργοποιεί έναν καταρράκτη σηματοδότησης στην θηλυκή αναπαραγωγική οδό, με αποτέλεσμα την αστάθεια ζευγαρώματος. Ωστόσο, αν και τα σπονδυλωτά έχουν πολλαπλές στεροειδείς ορμόνες, όπως οιστρογόνα και ανδρογόνα (ανασκόπηση στην αναφορά 9), από όσο γνωρίζουμε, δεν έχουν εντοπιστεί ανδρογόνα-προκατειλημμένα στεροειδή σε έντομα.
Ξεκινήσαμε να προσδιορίσουμε το ρεπερτόριο των στεροειδών ορμονών στον αρσενικό επικουρικό αδένα (MAG) του σεξουαλικά ώριμου A. gambiae, αναζητώντας πιθανά τροποποιητικά στεροειδή. Χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας tandem (HPLC-MS/MS) αντί για τη λιγότερο ειδική μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως, ανιχνεύσαμε εκδυσόνη (E) και 20E σε αυτόν τον ιστό, επιβεβαιώνοντας το προηγούμενο αποτέλεσμα. Ωστόσο, το δείγμα κυριαρχούνταν από οξειδωμένα φωσφορυλιωμένα στεροειδή, σύμφωνα με τον τύπο 3-δεϋδρο-20E-22-φωσφορικό (3D20E22P)12 (Σχήμα 1). Άλλες μορφές περιλαμβάνουν 3-δεϋδρο-20E (3D20E) και 20E-22-φωσφορικό (20E22P). Η ένταση του σήματος HPLC-MS/MS του 3D20E22P ήταν δύο τάξεις μεγέθους υψηλότερη από την αποφωσφορυλιωμένη μορφή του, 3D20E, και τρεις τάξεις μεγέθους υψηλότερη από αυτή του E και 20E (Σχήμα 1). Αν και σε άλλα μέρη του σώματος και στο κάτω μέρος αναπαραγωγική οδός (LRT· Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 1α). Αναλύσαμε επίσης τα εκδυστεροειδή σε πρόσφατα κλειστά (<1 ημέρας) αρσενικά και θηλυκά και ανιχνεύσαμε 3D20E και 3D20E22P μόνο στο MAG. Τα E, 20E και 20E22P ήταν παρόντα και στα δύο φύλα (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 1β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα ενήλικα αρσενικά A. gambiae παράγουν υψηλούς τίτλους τροποποιητικών ορμονών στα MAG τους που δεν συντίθενται από τα θηλυκά.
Η MAG και η θηλυκή LRT (συμπεριλαμβανομένων των κόλπων, των σπερματοδόχων κύστεων και του παροβάριου) ανατέμθηκαν από παρθένα αρσενικά ηλικίας 4 ημερών (4 ημερών) και παρθένα και ζευγαρωμένα θηλυκά (0,5, 3 και 12 hpm). Η εκδυσόνη σε αυτούς τους ιστούς αναλύθηκε με HPLC-MS/MS (μέσος όρος ± sem· μη ζευγαρωμένο t-test, αμφίπλευρο, διορθωμένο ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR)· NS, μη σημαντικό· *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 ώρες έναντι 0,5 ωρών, P = 0,035· 12 ώρες έναντι 3 ωρών, P = 0,0015· 12 ώρες έναντι 0,5 ωρών, P = 0,030. 3D20E22P: 3 ώρες έναντι 0,5 ωρών, P = 0,25· 12 ώρες έναντι 3 ωρών, P = 0,0032· 12 ώρες έναντι 0,5 ωρών, P = 0,015). Τα δεδομένα προέρχονται από τρία βιολογικά αντίγραφα. Η περιοχή κορυφής για κάθε εκδυσόνη ενδιαφέροντος υπολογίστηκε και ομαλοποιήθηκε με τον αριθμό των κουνουπιών. Η εκδυσόνη αναπαρίσταται με το χρώμα ως εξής: E, πράσινο· 20E, πορτοκαλί· 20E22P, μοβ· 3D20E, μπλε· 3D20E22P, ροζ. Το ένθετο αυξάνει την κλίμακα στον άξονα y για να δείξει χαμηλότερα επίπεδα εκδυσόνης.
Για να διερευνήσουμε εάν οι 3D20E22P και 3D20E μεταφέρονται κατά τη διάρκεια του ζευγαρώματος, αναλύσαμε θηλυκά LRT σε διάφορα χρονικά σημεία μετά το ζευγάρωμα. Παρόλο που δεν βρέθηκε εκδυσόνη σε παρθένα, παρατηρήσαμε σημαντικές ποσότητες 3D20E22P στο LRT αμέσως μετά το ζευγάρωμα (0,5 ώρα μετά το ζευγάρωμα, hpm), οι οποίες μειώνονταν με την πάροδο του χρόνου, ενώ τα επίπεδα 3D20E αυξήθηκαν σημαντικά (Εικ. 1). Χρησιμοποιώντας χημικά συντιθέμενη 3D20E ως πρότυπο, διαπιστώσαμε ότι τα επίπεδα αυτής της στεροειδούς ορμόνης σε LRT ζευγαρώματος ήταν τουλάχιστον 100 φορές υψηλότερα από την 20E (Εκτεταμένος Πίνακας Δεδομένων 1). Έτσι, η 3D20E22P είναι η κύρια αρσενική εκδυσόνη που μεταφέρεται στο θηλυκό LRT κατά τη διάρκεια του ζευγαρώματος, και η αποφωσφορυλιωμένη μορφή της, 3D20E, γίνεται εξαιρετικά άφθονη λίγο μετά το ζευγάρωμα. Αυτό υποδηλώνει έναν σημαντικό ρόλο για την τελευταία εκδυσόνη στη βιολογία των θηλυκών μετά το ζευγάρωμα.
Αφού δημιουργήσαμε ένα νέο σύνολο δεδομένων αλληλούχισης RNA (RNA-seq) (Εικ. 2α), χρησιμοποιώντας έναν ειδικά κατασκευασμένο βιοπληροφορικό αγωγό, αναζητήσαμε κινάση εκδυζόνης (EcK), οξειδάση εκδυζόνης (EO) και εκδυζόνη που κωδικοποιεί το γονίδιο φωσφατάσης τροποποιημένης με 20Ε. Το EPP) εκφράζεται σε αναπαραγωγικούς ιστούς. Εντοπίσαμε ένα υποψήφιο γονίδιο EPP και δύο πιθανά γονίδια EcK (EcK1 και EcK2), αλλά δεν μπορέσαμε να βρούμε ένα καλό υποψήφιο γονίδιο EO. Αξιοσημείωτα, μεμονωμένα γονίδια EPP εκφράστηκαν σε υψηλά επίπεδα (98,9ο εκατοστημόριο) σε MAGs της Γκάμπια, αλλά όχι σε θηλυκά LRTs (Εικ. 2β), σε αντίθεση με τις προσδοκίες μας, καθώς η αποφωσφορυλίωση του 3D20E22P έλαβε χώρα σε αυτόν τον θηλυκό ιστό. Επομένως, πιστεύουμε ότι το αρσενικό EPP μπορεί να μεταφερθεί κατά τη διάρκεια του ζευγαρώματος. Πράγματι, χρησιμοποιήσαμε in vivo σήμανση σταθερών ισοτόπων για να καλύψουμε την θηλυκή πρωτεΐνη μετά το ζευγάρωμα, ένα ένζυμο που αναγνωρίστηκε με MS στον θηλυκό κόλπο (Εικ. 2γ και Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Η παρουσία EPP σε MAG και ζευγαρωμένο (αλλά όχι παρθένο) θηλυκό LRT επιβεβαιώθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα (Εικ. 2δ).
α, Ένας ειδικά κατασκευασμένος αγωγός βιοπληροφορικής για την αναζήτηση στους αναπαραγωγικούς ιστούς κάθε φύλου για γονίδια που κωδικοποιούν EcKs, EOs και EPPs. Οι αριθμοί δίπλα στα βέλη υποδεικνύουν τον αριθμό των αρσενικών και θηλυκών υποψηφίων σε κάθε βήμα. Αυτή η ανάλυση εντόπισε ένα γονίδιο EPP (EPP) και ένα γονίδιο EcK (EcK1) που εκφράζονται σε αρσενικά, και ένα γονίδιο EcK (EcK2) που εκφράζεται και στα δύο φύλα αλλά δεν αποδίδει ένα υποψήφιο γονίδιο EO. β, Χάρτης θερμότητας που συγκρίνει την έκφραση του υποψήφιου γονιδίου σε παρθένους (V) και ζευγαρωτικούς (M) ιστούς Anopheles gambiae και Anopheles albicans. Spca, γονιμοποίηση. MAGs, βοηθητικοί αδένες σε αρσενικά. άλλα μέρη του σώματος, συμπεριλαμβανομένων των μαστών, των φτερών, των ποδιών, των λιπωδών σωμάτων και των εσωτερικών οργάνων και στα δύο φύλα, και των ωοθηκών στα θηλυκά. Η EcK2 εκφράζεται σε υψηλό βαθμό τόσο στο MAG όσο και στους κόλπους της Γκάμπια, ενώ η EPP βρίσκεται μόνο στο MAG.c, Πρωτεωμική ανάλυση της μετατόπισης της ομάδας εκσπερμάτισης αρσενικών σε κόλπους θηλυκών στα 3, 12 και 24 hpm, δείχνοντας τις 67 πιο άφθονες πρωτεΐνες. Τα θηλυκά εκτράφηκαν με μια δίαιτα που περιείχε 15N για την επισήμανση (και την κάλυψη) όλων των πρωτεϊνών. Τα μη επισημασμένα αρσενικά ζευγάρωσαν με επισημασμένα θηλυκά και τα θηλυκά LRTs ανατέμθηκαν στα 3, 12 και 24 hpm για πρωτεωμική ανάλυση (βλ. Συμπληρωματικό Πίνακα 1 για μια πλήρη λίστα πρωτεϊνών εκσπερμάτισης). Ένθετο, τα EPP, Eck1 και EcK2 ανιχνεύθηκαν στο MAG παρθένων αρσενικών με πρωτεωμική ανάλυση αυτών των ιστών.d, Η EPP ανιχνεύθηκε με Western blot σε MAG και LRT ζευγαρωμένων θηλυκών, αλλά όχι σε παρθένα θηλυκά ή αρσενικά ή στο υπόλοιπο θηλυκό. σώμα. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν ταυτόχρονα με αντισώματα κατά της ακτίνης (έλεγχος φόρτωσης) και αντισώματα κατά του EPP. Όλα τα αρσενικά είναι παρθένα. Βλέπε Συμπληρωματικό Σχήμα 1 για δεδομένα πηγής πηκτής. Τα Western blots πραγματοποιήθηκαν δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.
Η δραστικότητα της εκδυστεροειδούς φωσφοφωσφατάσης του EPP επαληθεύτηκε μετά από επώαση με HPLC-MS/MS με 3D20E22P που απομονώθηκε από το MAG (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 2α). Επιπλέον, όταν σιγήσαμε το EPP με παρεμβολή που προκαλείται από RNA (RNAi), ανιχνεύσαμε μια ισχυρή μείωση της δραστικότητας της φωσφατάσης στους αναπαραγωγικούς ιστούς αυτών των αρσενικών (Εικ. 3α) και τα θηλυκά που ζευγαρώθηκαν με αρσενικά στα οποία είχε επιβληθεί σίγαση EPP έδειξαν σημαντικά χαμηλότερη αναλογία αποφωσφορυλιωμένης 3D20E (Εικ. 3b) παρά τη μερική σίγηση γονιδίων (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 2b,c). Αντίθετα, δεν ανιχνεύσαμε σημαντικές αλλαγές στην αναλογία 20E22P/20E στα ίδια κουνούπια, γεγονός που θα μπορούσε να υποδηλώνει ότι το ένζυμο είναι ειδικό για το 3D20E22P (Εικ. 3b).
α, Μειωμένη δραστικότητα φωσφατάσης στο MAG που προκαλείται από σίγηση EPP χρησιμοποιώντας δίκλωνο EPP RNA (dsEPP) ή δίκλωνο GFP RNA (dsGFP) μάρτυρες. Είκοσι ομάδες MAG χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε αντίγραφο (P = 0,0046, ζευγαρωμένο t-test, αμφίπλευρο), που αντιπροσωπεύονται από ξεχωριστές κουκκίδες. β, Τα θηλυκά που ζευγαρώθηκαν με αρσενικά στα οποία είχε γίνει σίγαση EPP είχαν σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό αποφωσφορυλιωμένης 3D20E στα 3 hpm (P = 0,0043, μη ζευγαρωμένο t-test, αμφίπλευρο), ενώ τα επίπεδα 20E δεν επηρεάστηκαν (P = 0,063, μη ζευγαρωμένο). t-test, αμφίπλευρο). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± sem από τρεις ομάδες των 13, 16 και 19 θηλυκών η καθεμία.c, Τα θηλυκά που ζευγάρωσαν με αρσενικά στα οποία είχε γίνει σίγηση EPP είχαν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά επαναζευγαρώματος (P = 0,0002, ακριβές τεστ Fisher, αμφίπλευρο). Τα θηλυκά αναγκάστηκαν πρώτα να ζευγαρώσουν για να διασφαλιστεί η κατάσταση ζευγαρώσεώς τους. 2 ημέρες αργότερα, ήρθαν σε επαφή με άλλα αρσενικά που έφεραν διαγονιδιακό σπέρμα για να αξιολογηθούν τα ποσοστά επαναζευγαρώματος μέσω ποσοτικής ανίχνευσης PCR του διαγονιδίου.d. Τα θηλυκά που τράφηκαν με αίμα και ζευγαρώθηκαν με αρσενικά που είχαν σιωπήσει με EPP είχαν σημαντικά μειωμένη γονιμότητα (P < 0,0001; δοκιμή Mann-Whitney, αμφίπλευρη) και ελαφρώς μειωμένο αριθμό αυγών (P = 0,088, δοκιμή Mann-Whitney, αμφίπλευρη), ενώ ο ρυθμός ωοτοκίας δεν επηρεάστηκε (P = 0,94, ακριβής δοκιμή Fisher, αμφίπλευρη). Σε όλα τα πάνελ, το n αντιπροσωπεύει τον αριθμό των βιολογικά ανεξάρτητων δειγμάτων κουνουπιών.NS, μη σημαντικό.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε εάν η αποφωσφορυλίωση της εκδυσόνης είναι σημαντική για την πρόκληση αντοχής στο ζευγάρωμα στα θηλυκά. Αξιοσημείωτα, τα θηλυκά που ζευγάρωσαν με αρσενικά με μειωμένο EPP ζευγάρωσαν ξανά σε πολύ υψηλότερη συχνότητα (44,9%) από τα θηλυκά ελέγχου (10,4%) όταν εκτέθηκαν σε επιπλέον (διαγονιδιακά) αρσενικά (Εικ. 3c). Παρατηρήσαμε επίσης μια σημαντική μείωση στη γονιμότητα (Εικ. 3d, αριστερά) και μια μικρή μείωση στον αριθμό των αυγών που γεννήθηκαν από αυτά τα θηλυκά (Εικ. 3d, μέση), ενώ το ποσοστό των αυγών που γεννήθηκαν από τα θηλυκά (μια άλλη απόκριση που προκλήθηκε στα θηλυκά από το ζευγάρωμα) δεν επηρεάστηκε (Εικ. 3d, δεξιά). Δεδομένης της παρατηρούμενης εξειδίκευσης του EPP για το 3D20E22P, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση του 3D20E από το EPP που μεταφέρθηκε κατά τη διάρκεια του ζευγαρώματος μπορεί να έχει σημαντικό ρόλο στην απενεργοποίηση της δεκτικότητας των θηλυκών σε περαιτέρω ζευγάρωμα, μια συμπεριφορά που προηγουμένως αποδιδόταν στη σεξουαλική μεταφορά του 20E. Επομένως, αυτή η ανδρική ειδική ορμόνη επηρεάζει επίσης έντονα τη γυναικεία γονιμότητα.
Στη συνέχεια, συγκρίναμε τις δραστικότητες των 20E και 3D20E σε πειράματα ένεσης σε σεξουαλικά ώριμα παρθένα ζώα χρησιμοποιώντας χημικά συντιθέμενο 3D20E (Εικόνα 4a-c) και εμπορικά διαθέσιμο 20E. Παρατηρήσαμε ότι το 3D20E ήταν σημαντικά πιο αποτελεσματικό από το 20E στην απενεργοποίηση της ευαισθησίας των θηλυκών στο ζευγάρωμα και στις δύο συγκεντρώσεις (Εικόνα 4d). Αξιοσημείωτο είναι ότι το ήμισυ του φυσιολογικού επιπέδου του 3D20E στο LRT (1.066 pg μετά την ένεση έναντι 2.022 pg μετά το ζευγάρωμα) προκάλεσε ένα ποσοστό ανθεκτικών θηλυκών που ήταν 20 φορές υψηλότερο από το φυσιολογικό επίπεδο του 20E (361 pg μετά την ένεση) 24 ώρες μετά την ένεση στην υψηλότερη συγκέντρωση 18 pg μετά το ζευγάρωμα. Εκτεταμένος Πίνακας Δεδομένων 1). Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με την άποψη ότι η σεξουαλική μεταφορά του 20E δεν προκαλεί ανερέθιστες περιόδους ζευγαρώματος και περαιτέρω υποδεικνύει το 3D20E ως σημαντικό παράγοντα για τη διασφάλιση της σχέσης γονέα-παιδιού. Το 3D20E ήταν επίσης σημαντικά πιο δραστικό από το 20E σε δοκιμασίες ωοτοκίας σε παρθένα θηλυκά (Εικ. 4ε), υποδηλώνοντας ότι ο φυσιολογικός ρυθμός ωοτοκίας που παρατηρήσαμε μετά από μερική σίγηση του EPP οφειλόταν στην παρουσία υπολειμματικής δραστηριότητας 3D20E που παράγεται ακόμα από θηλυκούς παράγοντες που προκαλούνται από το ζευγάρωμα.
(α,β) 3D20E που συντέθηκε χημικά από το 20Ε (α) με πολύ υψηλή μετατροπή/απόδοση (δεδομένα που παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± sem από τρεις ανεξάρτητες αντιδράσεις σύνθεσης) (β).γ, Το φάσμα μάζας (κάτω μισό) ταιριάζει ακριβώς με την εκδυσόνη που βρέθηκε σε ζευγαρωμένο θηλυκό LRT (άνω μισό).δ, Σε σύγκριση με το 20Ε (0,63 μg, P = 0,02; 0,21 μg, P < 0,0001; ακριβής δοκιμή Fisher, αμφίπλευρη) και 10% αιθανόλη (0,63 μg, P < 0,0001; 0,21 μg, P < 0,0001; ακριβής δοκιμή Fisher, αμφίπλευρη), ενώ το 20Ε ήταν σημαντικά υψηλότερο από τον έλεγχο μόνο σε υψηλότερες δόσεις (0,63 μg, P = 0,0002; 0,21 μg, P = 0,54; ακριβής δοκιμή Fisher, αμφίπλευρη).ε, επαγόμενη από έγχυση 3D20E σημαντικά υψηλότερους ρυθμούς ωοτοκίας σε παρθένα θηλυκά από τους ελέγχους 10% αιθανόλης (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; ακριβής δοκιμή Fisher, αμφίπλευρη), ενώ το 20E συγκρίθηκε με τους ελέγχους Μόνο σε υψηλότερες δόσεις (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; ακριβής δοκιμή Fisher, αμφίπλευρη). Το 3D20E προκάλεσε σημαντικά υψηλότερους ρυθμούς ωοτοκίας από το 20E σε υψηλότερες δόσεις (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; ακριβής δοκιμή Fisher, αμφίπλευρη). Σε όλα τα πάνελ, το n αντιπροσωπεύει τον αριθμό των βιολογικά ανεξάρτητων δειγμάτων κουνουπιών. NS, μη σημαντικό.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Τα δεδομένα προέρχονται από τρία αντιγράφει.
Σε προηγούμενες μελέτες, διαπιστώσαμε ότι η σεξουαλική μεταφορά στεροειδών ορμονών προκαλεί την έκφραση του MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), ενός θηλυκού αναπαραγωγικού γονιδίου που προστατεύει τα θηλυκά A. gambiae από τη μόλυνση από P. falciparum. Το κόστος υγείας που προκαλείται από το 13, το πιο θανατηφόρο παράσιτο της ελονοσίας στον άνθρωπο. Δεδομένης της σημασίας του MISO για την αναπαραγωγική ικανότητα του Anopheles σε περιοχές ενδημικές για την ελονοσία, αποφασίσαμε να προσδιορίσουμε ποια ορμόνη, η 3D20E ή η 20E, ενεργοποιεί την έκφραση αυτού του γονιδίου. Διαπιστώσαμε ότι ενώ η ένεση 20E προκάλεσε συγκεκριμένα ή πιο ισχυρά ορισμένους πυρηνικούς υποδοχείς ορμονών (HR), όπως οι HR3 και HR4, και τυπικούς κατάντη στεροειδείς στόχους, όπως τα κυτογόνα γονίδια Vg14, 15, 16, το MISO προκλήθηκε πιο έντονα από το 3D20E (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 3). Έτσι, η σεξουαλική μεταφορά αυτής της ανδρογόνου στεροειδούς ορμόνης φαίνεται να προκαλεί μηχανισμούς που προστατεύουν τα θηλυκά από το κόστος που προκαλεί η παρασιτική μόλυνση. Επιπλέον, το 3D20E επηρεάζει διαφορικά και τις δύο ισομορφές. του υποδοχέα EcR, επάγοντας τον EcR-A και καταστέλλοντας τον EcR-B, και ενεργοποιώντας πιο έντονα άλλα γονίδια που προκαλούν ζευγάρωμα, συμπεριλαμβανομένου του HPX15, το οποίο επηρεάζει τη γονιμότητα των θηλυκών. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει τη σημαντική στειρότητα που παρατηρείται σε θηλυκά που ζευγαρώνουν με αρσενικά που έχουν σιωπήσει με EPP (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 3). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν την ύπαρξη κατάντη οδών που ενεργοποιούνται κατά προτίμηση από δύο ορμόνες εκδυζόνης που μπορεί να αποτελούν τη βάση της ειδικής για το φύλο λειτουργίας.
Στη συνέχεια, εξετάσαμε τη λειτουργία των δύο γονιδίων EcK που εντοπίστηκαν στον βιοπληροφορικό μας αγωγό. Η σίγηση της EcK1 ή της EcK2 οδήγησε σε σημαντική θνησιμότητα στους άνδρες (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 4α), υποδηλώνοντας ότι η φωσφορυλίωση της εκδυζόνης, και επομένως η απενεργοποίηση, είναι σημαντική για την επιβίωση. Επειδή η EcK2 εκφράστηκε σε υψηλότερα επίπεδα από την EcK1 και ανιχνεύθηκε σε MAGs με πρωτεωμική (Σχήμα 2b, c και Συμπληρωματικός Πίνακας 2), επικυρώσαμε τη δράση της στην εκδυστεροειδή κινάση επωάζοντάς την με 20E, η οποία οδήγησε σε φωσφορυλίωση 20E22P (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 2).4b). Όταν χρησιμοποιήσαμε 3D20E ως υπόστρωμα, δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσουμε το φωσφορυλιωμένο προϊόν 3D20E22P (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 4c), υποδηλώνοντας ότι η 20E αντί για την 3D20E μπορεί να είναι ο προτιμώμενος στόχος της EcK2.
Σύμφωνα με την ανάλυση RNA-seq μας, η EcK2 εκφράστηκε επίσης σε υψηλό βαθμό στην LRT των παρθένων θηλυκών, όπου απενεργοποιήθηκε μετά το ζευγάρωμα (Εικ. 2b). Επιβεβαιώσαμε αυτά τα δεδομένα και διαπιστώσαμε ότι η έκφραση της EcK2 δεν επηρεάστηκε από την παροχή αίματος (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 5a). Επεκτείνοντας τα αρχικά μας πειράματα MS, διαπιστώσαμε ότι η κορυφή του 20E22P σχετιζόταν στενά με την κορυφή του 20E (22-26 ώρες μετά το γεύμα αίματος· Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 5b). Η σίγηση της EcK2 σε παρθένες θηλυκές είχε ως αποτέλεσμα τριπλάσια αύξηση της σχετικής αναλογίας 20E προς 20E22P στις 26 ώρες μετά το γεύμα αίματος (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήματα 2c και 5c), επιβεβαιώνοντας ότι η EcK2 φωσφορυλιώνει επίσης την 20E σε θηλυκές. Αξιοσημείωτα, οι παρθένες με έλλειψη EcK2 διατήρησαν πλήρη σεξουαλική δεκτικότητα (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 5d,e), υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι η παραγωγή 20E από τα θηλυκά δεν προκαλεί περιόδους ζευγαρώματος που είναι ανερέθιστες. Ωστόσο, αυτά τα θηλυκά είχαν σημαντικά αυξημένα ποσοστά ωοτοκίας σε σύγκριση με τους μάρτυρες, με περισσότερο από το 30% των παρθένων να γεννούν αυγά (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 5f). Εάν πραγματοποιήθηκαν ενέσεις δίκλωνου RNA Eck2 (dsEcK2) μετά την αιματοχυσία, δεν σημειώθηκε ωοτοκία, οπότε η κορυφή του 20E λόγω της κατάποσης αίματος είχε μειωθεί. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ένα μοντέλο ότι το 20E που παράγεται μετά την αιμορραγία μπορεί να προκαλέσει ωοτοκία, αλλά μόνο όταν το μπλοκάρισμα ωοτοκίας (EcK2 και πιθανώς άλλοι παράγοντες) απενεργοποιηθεί με το ζευγάρωμα. Ούτε οι ενέσεις 20E ούτε του 3D20E ανέστειλαν την έκφραση της EcK2 σε παρθένες (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 5g), υποδηλώνοντας ότι άλλοι παράγοντες μεσολαβούν στην αναστολή αυτής της κινάσης. Ωστόσο, τα επίπεδα 20E μετά την αιματοχυσία δεν ήταν επαρκή για να προκαλέσουν δυσφορία ζευγαρώματος, αλλά ενεργοποιήθηκαν αποτελεσματικά από υψηλούς τίτλους σεξουαλικά μεταφερόμενης 3D20E.
Τα αποτελέσματά μας παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την αναπαραγωγική επιτυχία του A. gambiae. Έχει αναδυθεί ένα μοντέλο όπου τα αρσενικά έχουν εξελιχθεί ώστε να συνθέτουν υψηλούς τίτλους 3D20E, μιας ειδικής για τα αρσενικά τροποποιημένης εκδυσόνης που διασφαλίζει την καταγωγή απευαισθητοποιώντας τα θηλυκά σε περαιτέρω ζευγάρωμα. Ταυτόχρονα, αυτοί οι φορείς ελονοσίας έχουν επίσης αναπτύξει ένα αποτελεσματικό σύστημα για την ενεργοποίηση του 3D20E στα θηλυκά σε απόκριση στη σεξουαλική μεταφορά της ειδικής για τα αρσενικά EPP. Από όσο γνωρίζουμε, αυτό είναι το πρώτο παράδειγμα ενός συστήματος στεροειδών ορμονών που κυριαρχείται από αρσενικά και θηλυκά και εκτελεί μια μοναδική και κρίσιμη λειτουργία στα έντομα. Η λειτουργία της ειδικής για τα αρσενικά εκδυσόνης έχει διατυπωθεί αλλά δεν έχει αποδειχθεί οριστικά. Για παράδειγμα, μια σε μεγάλο βαθμό διαψευσμένη υπόθεση 18 είναι ότι αυτές οι λειτουργίες μπορεί να εκτελούνται από τον πρόδρομο 20E E1. Είναι γνωστό ότι στη Δροσόφιλα, η μονανδρία ενεργοποιείται από τη σεξουαλική μεταφορά μικρών πεπτιδίων φύλου19,20 που αλληλεπιδρούν με νευρώνες που νευρώνουν την θηλυκή αναπαραγωγική οδό μέσω ειδικών υποδοχέων πεπτιδίων φύλου21,22. Απαιτείται περαιτέρω εργασία για τον προσδιορισμό της κατάντη καταρράκτες σηματοδότησης που ελέγχονται από το 3D20E σε θηλυκά A. gambiae και για να προσδιοριστεί εάν αυτές οι καταρράκτες μπορούν να διατηρηθούν μεταξύ κουνουπιών και Drosophila.
Δεδομένου του σημαντικού ρόλου του 3D20E στη γονιμότητα και τη συμπεριφορά των θηλυκών που εντοπίστηκαν στη μελέτη μας, οι οδοί που οδηγούν στη σύνθεση και ενεργοποίηση του 3D20E προσφέρουν νέες ευκαιρίες για μελλοντικές στρατηγικές ελέγχου των κουνουπιών, όπως η δημιουργία ανταγωνιστικών στείρων αρσενικών σε στρατηγικές τεχνολογίας στείρων εντόμων. Χρήση για απελευθέρωση στην άγρια ​​φύση ή για μίμηση του 3D20E σε παρθένο παιχνίδι. Η ειδική για τα αρσενικά λειτουργία του 3D20E μπορεί να εξελίχθηκε όταν το A. gambiae και άλλα είδη Cellia απέκτησαν την ικανότητα να πήζουν το σπέρμα τους σε βύσματα ζευγαρώματος, καθώς αυτό επιτρέπει την αποτελεσματική μεταφορά μεγάλου αριθμού ορμονών και ενζύμων που ενεργοποιούν τις ορμόνες. Με τη σειρά του, η εξέλιξη του 3D20E που εφαρμόζει τη μονανδρία παρέχει έναν μηχανισμό για τα θηλυκά (μέσω υψηλής έκφρασης του MISO) για να ευνοήσουν την αναπαραγωγική τους ικανότητα σε περιοχές με υψηλή επικράτηση της ελονοσίας, γεγονός που συμβάλλει έμμεσα στη μετάδοση του Plasmodium. Δεδομένου ότι το θηλυκό 20E έχει αποδειχθεί ότι έχει βαθιές επιπτώσεις στην επιβίωση και την ανάπτυξη του P. falciparum σε θηλυκά κουνούπια Anopheles,24 τόσο οι αρσενικές όσο και οι θηλυκές οδοί στεροειδών ορμονών αποτελούν πλέον βασικές πτυχές των αλληλεπιδράσεων κουνουπιών-παρασίτων.
Τα στελέχη A. gambiae G3 εκτράφηκαν υπό τυπικές συνθήκες εντόμων (26-28 °C, σχετική υγρασία 65-80%, φωτοπερίοδος φωτός/σκότους 12:12 ώρες). Οι προνύμφες τρέφονταν με τροφή για ψάρια σε σκόνη (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets και Tetra Pond Sticks σε αναλογία 7:7:2). Τα ενήλικα κουνούπια τρέφονταν ad libitum με διάλυμα δεξτρόζης 10% και εβδομαδιαίο ανθρώπινο αίμα (συστατικά αίματος μελέτης). Τα παρθένα κουνούπια ελήφθησαν με διαχωρισμό των φύλων στο στάδιο της νύμφης μετά από εξέταση των άκρων με μικροσκοπία. Αρσενικά που φέρουν το τρανςγονίδιο DsRed έχουν περιγραφεί προηγουμένως.
Τα πειράματα αναγκαστικής ζευγαρώματος πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που περιγράφηκαν προηγουμένως. Για φυσικό ζευγάρωμα, παρθένα θηλυκά 4 ημερών διατηρήθηκαν σε αναλογία 1:3 με σεξουαλικά ώριμα παρθένα αρσενικά για δύο νύχτες. Για πειράματα στα οποία τα αρσενικά έλαβαν ένεση dsEPP, ο συν-κλωβισμός συνέπεσε με τις ημέρες 3-4 μετά την ένεση, όταν η δραστηριότητα της φωσφατάσης είχε κατασταλεί στο μέγιστο (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 2b).
Οι ιστοί κουνουπιών, τα υπόλοιπα πτώματα (το υπόλοιπο σώμα) ή ολόκληρο το σώμα ανατέθηκαν σε διάλυμα μεθανόλης 100% και ομογενοποιήθηκαν με ένα εργαλείο κοπής σφαιριδίων (γυάλινα σφαιρίδια 2 mm, 2.400 rpm, 90 sec). Οι ποσότητες των ιστών και οι όγκοι μεθανόλης ήταν οι εξής: υπόλοιπο σώμα, 50 σε 1.000 µl· MAG, 50–100 80 µl· θηλυκό LRT, 25–50 80 µl. Το ίζημα υποβλήθηκε σε δεύτερη εκχύλιση με μεθανόλη με τον ίδιο όγκο μεθανόλης. Τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση. Η μεθανόλη και από τις δύο εκχυλίσεις συνδυάστηκε και ξηράνθηκε υπό ροή αζώτου και στη συνέχεια επαναιωρήθηκε στους ακόλουθους όγκους μεθανόλης 80% σε νερό: υπόλοιπο σώμα, 50 µl· MAG και θηλυκό LRT, 30 µl.
Τα δείγματα αναλύθηκαν σε φασματόμετρο μάζας (ID-X, Thermo Fisher) συνδεδεμένο με όργανο LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl δείγματος εγχύθηκαν σε στήλη 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) διατηρούμενη στους 25 °C. Οι κινητές φάσεις για την LC ήταν A (νερό, 0,1% μυρμηκικό οξύ) και B (ακετονιτρίλιο, 0,1% μυρμηκικό οξύ). Η κλίση LC ήταν η εξής: 5% B για 1 λεπτό, στη συνέχεια αυξήθηκε σε 100% B σε διάστημα 11 λεπτών. Μετά από 8 λεπτά στο 100%, επαναφέρετε τη στήλη σε ισορροπία στο 5% B για 4 λεπτά. Ο ρυθμός ροής ήταν 0,3 ml min-1. Ο ιονισμός στην πηγή MS επιτυγχάνεται με ιονισμό θερμαινόμενου ηλεκτροψεκασμού σε θετική και αρνητική λειτουργία.
Το φασματόμετρο μάζας μετρά δεδομένα στην περιοχή m/z από 350 έως 680 σε ανάλυση 60.000 σε πλήρη λειτουργία MS. Τα δεδομένα MS/MS ελήφθησαν σε [M + H]+ (όλοι οι στόχοι), [M - H2O + H]+ (όλοι οι στόχοι) και [M - H]- (φωσφορυλιωμένοι στόχοι). Τα δεδομένα MS/MS χρησιμοποιήθηκαν για την επιβεβαίωση των ιδιοτήτων εκδυζόνης στόχων για τους οποίους δεν υπήρχε διαθέσιμο πρότυπο. Για την αναγνώριση μη στοχευμένων εκδυστεροειδών, αναλύθηκαν δεδομένα MS/MS για όλες τις κορυφές HPLC με σχετική αφθονία >15%. Ποσοτικοποιήστε χρησιμοποιώντας πρότυπες καμπύλες που δημιουργήθηκαν από καθαρά πρότυπα (20E, 3D20E) για να υπολογίσετε απόλυτες ποσότητες ή αραιώσεις ενός συγκεκριμένου δείγματος (όλοι οι άλλοι στόχοι) για να υπολογίσετε την ισοδυναμία τους με τις ποσότητες που βρέθηκαν σε ένα αρσενικό. Για το 3D20E, η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το άθροισμα των ακόλουθων προϊόντων προσθήκης: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Τα δεδομένα εξήχθησαν και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Tracefinder (έκδοση 4.1). Τα δεδομένα MS/MS αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Xcalibur (έκδοση 4.4). Τα φάσματα MS των E, 20E και 3D20E συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα πρότυπα. Το 3D20E22P αναλύθηκε με παραγώγιση με το αντιδραστήριο Girard. Το 20E22P αναλύθηκε με αναλογία m/z.
Το 3D20E22P καθαρίστηκε από MAG. Ο καθαρισμός πραγματοποιήθηκε σε αναλυτική κλίμακα χρησιμοποιώντας έναν υγροχρωματογράφο εξαιρετικά υψηλής απόδοσης (Acquity, Waters) με έναν τετραπολικό ανιχνευτή μάζας (QDa, Acquity, Waters) υπό τις ίδιες συνθήκες LC με την ανάλυση HPLC-MS/MS. Η συλλογή κλασμάτων ενεργοποιήθηκε όταν ανιχνεύθηκε το m/z που αντιστοιχεί στο 3D20E22P στον ίδιο χρόνο κατακράτησης όπως προσδιορίστηκε προηγουμένως. Η καθαρότητα των εκχυλισμένων ενώσεων στη συνέχεια ελέγχθηκε με HPLC-MS/MS όπως περιγράφεται παραπάνω.
Το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από 10-12 αναπαραγωγικούς ιστούς ή άλλα μέρη του σώματος (χωρίς κεφαλή) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRI (Thermo Fisher) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με TURBO DNase (Thermo Fisher). Το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση του ιού λευχαιμίας ποντικού Moloney (M-MLV RT, Thermo Fisher) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές για την ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT-qPCR, Εκτεταμένος Πίνακας Δεδομένων 2) είχαν δημοσιευτεί προηγουμένως24 ή είχαν σχεδιαστεί χρησιμοποιώντας το Primer-BLAST26, με προτίμηση σε προϊόντα μεγέθους 70-150 bp και που εκτείνονται σε συνδέσεις εξονίου-εξονίου ή εκκινητές ζεύγους εκκινητών που διαχωρίζουν εξόνια. Δείγματα cDNA από τρία έως τέσσερα βιολογικά αντίγραφα αραιώθηκαν τέσσερις φορές σε νερό για RT-qPCR. Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε σε αντιδράσεις αντιγράφων των 15 µl που περιείχαν 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), εκκινητές και 5 µl αραιωμένου cDNA. Οι αντιδράσεις εκτελέστηκαν σε ένα QuantStudio. 6 Σύστημα PCR πραγματικού χρόνου Pro (Thermo Fisher) και τα δεδομένα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Design and Analysis (έκδοση 2.4.3). Όπως αποδείχθηκε σε αυτή τη μελέτη, οι σχετικές ποσότητες ομαλοποιήθηκαν ως προς το ριβοσωμικό γονίδιο RpL19 (AGAP004422), του οποίου η έκφραση δεν άλλαξε σημαντικά με την παροχή αίματος 27 ή το ζευγάρωμα 3.
Η ποιότητα του RNA ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Οι βιβλιοθήκες ζευγαρωμένων άκρων Illumina παρασκευάστηκαν και εκτελέστηκαν στο Broad Institute του MIT και του Harvard. Οι αναγνώσεις αλληλούχισης ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα του A. gambiae (στέλεχος PEST, έκδοση 4.12) χρησιμοποιώντας HISAT2 (έκδοση 2.0.5) με προεπιλεγμένες παραμέτρους. Οι αναγνώσεις με βαθμολογίες ποιότητας χαρτογράφησης (MAPQ) <30 αφαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας Samtools (έκδοση 1.3.1). Ο αριθμός των αναγνώσεων που αντιστοιχίστηκαν σε γονίδια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας htseq-count (έκδοση 0.9.1) με προεπιλεγμένες παραμέτρους. Οι κανονικοποιημένες μετρήσεις αναγνώσεων υπολογίστηκαν και η διαφορική γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο DESeq2 (έκδοση 1.28.1) σε R (έκδοση 4.0.3).
Τα υποψήφια γονίδια τροποποίησης της εκδυσόνης ταυτοποιήθηκαν αναζητώντας πρώτα το γονιδίωμα του A. gambiae χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), χρησιμοποιώντας προεπιλεγμένες τιμές παραμέτρων με τις ακόλουθες αλληλουχίες πρωτεϊνών ερωτήματος: από Bombyx mori (Αριθμός πρόσβασης NP_001038956.1), Musca domestica (Αριθμός πρόσβασης XP_005182020.1, XP_005175332.1 και XP_011294434.1) και Microplitis demolitor (Αριθμός πρόσβασης XP_008552646.1 και XP_008552645.1) EcK από B. mori (Αριθμός πρόσβασης NP_001036900), Drosophila melanogaster (Αριθμός πρόσβασης NP_651202), Apis mellifera (Αριθμός Πρόσβασης XP_394838) και Acyrthosiphon pisum (Αριθμός Πρόσβασης XP_001947166)· και EPP από B. mori (Αριθμός Πρόσβασης XP_001947166) NP_001177919.1 και NP_001243996.1) και EP του D. melanogaster (Αριθμός Πρόσβασης NP_572986.1) (βήμα 1). Στη συνέχεια, φιλτράρονται επιτυχίες με βάση την υψηλή έκφραση mRNA (>100 εξόνια θραυσμάτων/κιλοβάσεων ανά εκατομμύριο χαρτογραφημένων αναγνώσεων (FPKM) ή >85%) σε αναπαραγωγικό ιστό (θηλυκό LRT ή MAG) στην Γκάμπια (βήμα 2). Για να βελτιώσουμε την εξειδίκευση, επιλέξαμε υποψήφια ένζυμα που εκφράζονται επίσης στον αναπαραγωγικό ιστό του A. albimanus, ενός είδους ανωφελούς που δεν συνθέτει ούτε μεταφέρει εκδυσόνη κατά τη διάρκεια του ζευγαρώματος. Τα υποψήφια γονίδια φιλτραρίστηκαν με βάση τη χαμηλή έκφραση (<100 FPKM ή <85ο εκατοστημόριο) στον αναπαραγωγικό ιστό του A. albimanus (βήμα 3). Ως τελικό φίλτρο (βήμα 4), τα υποψήφια γονίδια πρέπει να ικανοποιούν τουλάχιστον ένα από τα ακόλουθα: (1) να έχουν σημαντικά ανοδική ρύθμιση μετά το ζευγάρωμα (P < 0,05) σύμφωνα με την ανάλυση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και (2) σε μη αναπαραγωγικούς ιστούς (< 85% ή <100 FPKM).
Τροποποιήσαμε προηγουμένως περιγραφόμενες μεθόδους 28,29,30 για να επιτύχουμε ισοτοπική σήμανση ολόκληρου του οργανισμού. Εν συντομία, ο άγριος τύπος Saccharomyces cerevisiae τύπου II (YSC2, Sigma) δοκιμάστηκε σε βάση αζώτου ζύμης (BD Difco, DF0335) που περιείχε (β/ό) 2% γλυκόζη (G7528, Sigma), 1,7% αμινοξέα χωρίς θειικό αμμώνιο (μέσο καλλιέργειας) και 5% θειικό αμμώνιο 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) ως μοναδική πηγή αζώτου. Η ζύμη ανακτήθηκε με φυγοκέντρηση και οι προνύμφες κουνουπιών τρέφονταν ad libitum μέχρι την νύμφη. Συμπληρώθηκε με ιχθυάλευρο (0,5 mg ανά 300 προνύμφες) για την πρόληψη της θνησιμότητας στο τέταρτο στάδιο. Μόνο τα θηλυκά χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια σε πειράματα ζευγαρώματος με μη επισημασμένα αρσενικά για την ανάλυση του αρσενικού πρωτεώματος που μεταφέρθηκε κατά τη διάρκεια του ζευγαρώματος.
Παρθένα θηλυκά ηλικίας 4-6 ημερών, με σήμανση 15N, αναγκάστηκαν να ζευγαρώσουν με παρθένα αρσενικά, αντίστοιχης ηλικίας, χωρίς σήμανση. Η επιτυχής σύζευξη επαληθεύτηκε με ανίχνευση βυσμάτων ζευγαρώματος με μικροσκοπία επιφθορισμού. Στα 3, 12 και 24 hpm, οι κόλποι 45-55 ζευγαρωμένων θηλυκών ανατέμθηκαν σε 50 µl ρυθμιστικού διαλύματος όξινου ανθρακικού αμμωνίου (pH 7,8) και ομογενοποιήθηκαν με γουδοχέρι. Το ομογενοποιημένο υλικό φυγοκεντρήθηκε και το υπερκείμενο αναμίχθηκε με 50 µl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) σε 50 mM όξινο ανθρακικό αμμώνιο. Το υπερκείμενο και το ίζημα από κάθε δείγμα καταψύχθηκαν ταχέως σε ξηρό πάγο και στάλθηκαν όλη τη νύχτα στο εργαστήριο MacCoss στο Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον, όπου ολοκληρώθηκε η προετοιμασία του δείγματος για LC-MS/MS. Επαναιωρήστε το ίζημα σε 50 µl 0,1% RapiGest σε 50 mM όξινο ανθρακικό αμμώνιο και υποβάλετε σε υπερήχους σε υδατόλουτρο. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του ιζήματος και του υπερκείμενου μετρήθηκε με τη δοκιμασία BCA, τα δείγματα ανάχθηκαν με 5 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT; Sigma), αλκυλιώθηκαν με 15 mM ιωδοακεταμίδιο (Sigma) και επωάστηκαν στους 37 °C (1:0 50) για 1 ώρα με θρυψινοποίηση: αναλογία θρυψίνης:υποστρώματος). Το RapiGest λύθηκε με την προσθήκη 200 mM HCl, ακολουθούμενη από επώαση στους 37 °C για 45 λεπτά και φυγοκέντρηση στις 14.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 °C για την απομάκρυνση των υπολειμμάτων. Τα δείγματα πλύθηκαν με διπλή εκχύλιση στερεάς φάσης (Oasis MCX cartridges, Waters) και επαναιωρήθηκαν σε 0,1% μυρμηκικό οξύ για τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης 0,33 µg µl-1. Τα μη επισημασμένα πρωτεώματα MAG αναλύθηκαν με παρόμοιο τρόπο από παρθένα αρσενικά. Αναλύθηκαν δύο αναλυτικά αντίγραφα για κάθε δείγμα. Στη συνέχεια, αναλύθηκε 1 µg από το καθένα. χρησιμοποιώντας στήλη 25 cm συντηγμένου πυριτίου 75 μm με παγίδα υαλοκαθαριστήρα Kasil1 (PQ) συντηγμένου πυριτίου 4 cm γεμισμένη με ρητίνη αντίστροφης φάσης Jupiter C12 (Phenomenex) και υγρή χρωματογραφία 180 λεπτών. Πεφτικά δείγματα – Η MS/MS εκτελέστηκε σε φασματόμετρο μάζας Q-Exactive HF (Thermo Fisher) με σύστημα nanoACQUITY UPLC (Waters). Τα δεδομένα συλλογής δεδομένων που δημιουργήθηκαν για κάθε εκτέλεση μετατράπηκαν σε μορφή mzML χρησιμοποιώντας Proteowizard (έκδοση 3.0.20287) και Comet31 (έκδοση 3.2) σε σχέση με τη βάση δεδομένων FASTA που περιείχε πρωτεϊνικές αλληλουχίες από Anopheles gambiae (έκδοση VectorBase 54), Anopheles coluzzi. Πραγματοποιήθηκε αναζήτηση σε Mali-NIH (έκδοση VectorBase 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Μάρτιος 2021), RNA-seq A. gambiae και μεταφράσεις τριών πλαισίων γνωστών ανθρώπινων μολυσματικών ουσιών. Οι FDR που αντιστοιχούν σε χάρτη πεπτιδίων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Percolator32 (έκδοση 3.05) με όριο 0,01 και τα πεπτίδια συναρμολογήθηκαν σε αναγνωριστικά πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας πρωτεϊνική φειδώ στο Limelight33 (έκδοση 2.2.0). Η σχετική αφθονία πρωτεΐνης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τον κανονικοποιημένο φασματικό παράγοντα αφθονίας (NSAF) που υπολογίστηκε για κάθε πρωτεΐνη σε κάθε εκτέλεση όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Η NSAF σε σχέση με κάθε πρωτεΐνη υπολογίστηκε κατά μέσο όρο σε δείγματα από δύο διαφορετικά βιολογικά αντίγραφα. Η σήμανση 15N κάλυψε με επιτυχία το θηλυκό πρωτέωμα, αν και μια μικρή ποσότητα μη σημασμένης πρωτεΐνης μπορούσε να ανιχνευθεί από τα σημασμένα παρθένα. Καταγράψαμε την ανίχνευση μείωσης αρσενικής πρωτεΐνης (1-5 φάσματα) σε θηλυκά ακατέργαστα δείγματα μόνο σε τεχνικές εκτελέσεις, όπου τα ακατέργαστα δείγματα εκτελέστηκαν μετά από αρσενικά/ζευγαρωτικά δείγματα, ως αποτέλεσμα της "μεταφοράς" HPLC. Περιστασιακές πρωτεΐνες που βρέθηκαν ως "μολυσματικές ουσίες" από σημασμένα παρθένα παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1.
Δύο αντιγονικά πεπτίδια, QTTDRVAPAPDQQQ (εντός ισοτύπου PA) και MESDGTTPSGDSEQ (εντός ισοτύπου PA και PB) στο Genscript. Τα δύο πεπτίδια συνδυάστηκαν, στη συνέχεια συζεύχθηκαν με την πρωτεΐνη φορέα KLH και εγχύθηκαν σε κουνέλια Νέας Ζηλανδίας. Τα κουνέλια θυσιάστηκαν μετά την τέταρτη ένεση και η ολική IgG απομονώθηκε με καθαρισμό συγγένειας. Η IgG από το κουνέλι με την μεγαλύτερη εξειδίκευση στο EPP χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω Western blotting.
Για τα Western blots, προστέθηκε ξεχωριστά MAG (n = 10, όπου n αντιπροσωπεύει τον αριθμό των βιολογικά ανεξάρτητων δειγμάτων κουνουπιών) και θηλυκό LRT (n = 30) από παρθένα αρσενικά κουνούπια ηλικίας 4 ημερών και παρθένα ή ζευγαρωμένα θηλυκά (<10 μετά το ζευγάρωμα). Προστέθηκε ξεχωριστά ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης πρωτεΐνης (50 mM Tris, pH 8,0· 1% NP-40· 0,25% δεοξυχολικό νάτριο· 150 mM NaCl· 1 mM EDTA· 1× κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche)). Τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν αμέσως μετά την ανατομή με ένα beader (γυάλινα σφαιρίδια 2 mm, 2.400 rpm, 90 sec). Τα αδιάλυτα υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στις 20.000 g στους 4 °C. Οι πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν με δοκιμασία Bradford (Bio-Rad). Στη συνέχεια, προστέθηκαν 20 μg πρωτεΐνης MAG, 40 μg πρωτεΐνης LRT και 20 μg υπολειμματικής πρωτεΐνης χύδην. μετουσιώθηκαν και διαχωρίστηκαν με 10% Bis-Tris NuPAGE χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα MOPS. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες φθοριούχου πολυβινυλιδενίου χρησιμοποιώντας το σύστημα μεταφοράς iBlot2 (Thermo Fisher). Οι μεμβράνες πλύθηκαν δύο φορές σε 1× PBS-T (0,1% Tween-20 σε PBS) και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού Odyssey (Li-Cor) για 1 ώρα στους 22°C. Οι μεμβράνες ανακινήθηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C με προσαρμοσμένο πολυκλωνικό πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού αντι-EPP (1:700 σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού) και μονοκλωνικό πρωτογενές αντίσωμα αρουραίου αντι-ακτίνης MAC237 (Abeam; 1:4.000). Οι μεμβράνες πλύθηκαν με PBS-T και στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενή αντισώματα (γαϊδουριού αντι-κουνελιού 800CW και αίγας αντι-αρουραίου 680LT (Li-Cor), και τα δύο 1:20.000) σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού που περιείχε 0,01% SDS και 0,2% Tween-20 για 1 ώρα στους 22 °C. Οι μεμβράνες πλύθηκαν με PBS-T και απεικονίστηκαν με σαρωτή Odyssey CLx. Οι εικόνες συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία στο Image Studio (έκδοση 5.2). Δεν ανιχνεύθηκε συγκεκριμένη ζώνη που να αντιστοιχεί στην ισομορφή EPP-RA (82 kDa).
Οι κωδικοποιητικές περιοχές του EPP (ως ισομορφή AGAP002463-RB που περιέχει τομέα ιστιδίνης φωσφατάσης, αναζήτηση διατηρημένου τομέα NCBI 34) και EcK2 (AGAP002181) κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma). Οι εκκινητές παρατίθενται στον Εκτεταμένο Πίνακα Δεδομένων 2. Οκτώ συνδετήρες GS4 (σε σειρά) εισήχθησαν πριν από την ετικέτα 6xHis στο C-τελικό άκρο του κατασκευάσματος pET-21a(+)-EcK2. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παρήχθησαν χρησιμοποιώντας την αντίδραση σύνθεσης πρωτεΐνης E. coli χωρίς κύτταρα NEBExpress (New England BioLabs). Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας στήλες spin Ni NEBExpress (New England BioLabs). Η πρωτεΐνη ελέγχου διυδροφυλλικής αναγωγάσης (DHFR) παρήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπο DNA από το κιτ σύνθεσης πρωτεϊνών E. coli χωρίς κύτταρα NEBExpress. Οι πρωτεΐνες αποθηκεύτηκαν σε 50% γλυκερόλη σε PBS στους -20 °C για έως και 3 μήνες.
Η δραστικότητα φωσφατάσης του EPP και των εκχυλισμάτων ιστών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας 4-νιτροφαινυλοφωσφορικό (pNPP· Sigma-Aldrich). Το ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης περιείχε 25 mM Tris, 50 mM οξικό οξύ, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA και 1 mM DTT. Ο ιστός ομογενοποιήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης και τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση. Ξεκινήστε την αντίδραση προσθέτοντας ένζυμο ή εκχύλισμα ιστού σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης που περιείχε 2,5 mg ml-1 pNPP. Το μείγμα αντίδρασης επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και η ποσότητα του pNP που μετατράπηκε από το pNPP ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας την απορρόφηση στα 405 nm σε διάφορους χρόνους.
Για in vitro δραστικότητα EcK, η πρωτεΐνη επωάστηκε με 0,2 mg 20E ή 3D20E σε 200 µl ρυθμιστικού διαλύματος (pH 7,5) που περιείχε 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP και 10 mM MgCl2 για 2 ώρες στους 27 °C. Η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη 800 µl μεθανόλης, στη συνέχεια ψύχθηκε στους -20 °C για 1 ώρα και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 20.000 g για 10 λεπτά στους 4 °C. Το υπερκείμενο αναλύθηκε στη συνέχεια με HPLC-MS/MS. Για την απενεργοποίηση με θερμότητα των πρωτεϊνών που χρησιμοποιήθηκαν στην ομάδα ελέγχου, οι πρωτεΐνες επωάστηκαν σε 50% γλυκερόλη σε PBS για 20 λεπτά στους 95 °C.
Για in vitro δραστικότητα EPP, η πρωτεΐνη επωάστηκε με 3D20E22P (ισοδύναμη με την ποσότητα που βρέθηκε σε 18 ζεύγη MAG, καθαρισμένα με HPLC-MS/MS) σε 100 µl ρυθμιστικού διαλύματος (pH 7,5) που περιείχε 25 mM Tris, 50 mM οξικό οξύ, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA και 1 mM DTT για 3 ώρες στους 27 °C. Η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη 400 µl μεθανόλης και ψύχθηκε στους -20 °C για 1 ώρα, στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 20.000 g για 10 λεπτά στους 4 °C. Το υπερκείμενο αναλύθηκε με HPLC-MS/MS.
Τα θραύσματα PCR για EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) και EcK2 (556 bp) ενισχύθηκαν από cDNA που παρασκευάστηκε από πτώματα κουνουπιών χωρίς κεφάλι μικτού φύλου. Το θραύσμα PCR του μάρτυρα eGFP (495 bp) ενισχύθηκε από το προηγουμένως περιγραφέν pCR2.1-eGFP. Οι εκκινητές PCR παρατίθενται στον Εκτεταμένο Πίνακα Δεδομένων 2. Το θραύσμα PCR εισήχθη μεταξύ των ανεστραμμένων υποκινητών Τ7 στο πλασμίδιο pL4440. Τα κατασκευάσματα πλασμιδίου ανακτήθηκαν από το NEB 5-α ικανό E. coli (New England Biolabs) και επαληθεύτηκαν με αλληλούχιση DNA πριν από τη χρήση (βλ. Συμπληρωματικά Δεδομένα 1 για την αλληλουχία εισαγωγής). Χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές που αντιστοιχούσαν στον υποκινητή Τ7 (Εκτεταμένος Πίνακας Δεδομένων 2) για την ενίσχυση του ενθέματος από το πλασμίδιο που βασίζεται στο pL4440. Το μέγεθος του προϊόντος PCR επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Το dsRNA μεταγράφηκε από πρότυπα PCR χρησιμοποιώντας το Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) και καθαρίστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με τις τροποποιήσεις που περιγράφηκαν προηγουμένως.
Για την έγχυση dsRNA, εγχύθηκαν 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) σε συγκέντρωση 10 ng nl-1 στον θώρακα ενήλικων αρσενικών ή θηλυκών (Nanoject III, Drummond) εντός 1 ημέρας μετά την έκλυση. Τα επίπεδα καταστολής γονιδίων προσδιορίστηκαν σε τουλάχιστον τρία βιολογικά αντίγραφα με εκχύλιση RNA, σύνθεση cDNA και RT-qPCR. Για την έγχυση εκδυσόνης, σε θηλυκά παρθένα 4 ημερών ή 6 ημερών που τρέφονταν με αίμα, εγχύθηκαν 0,13, 0,21 ή 0,63 µg 20E ή 3D20E (Nanoject III, Drummond) σε συγκεντρώσεις 1,3, 2,1, αντίστοιχα, ανάλογα με τον πειραματικό σχεδιασμό ή 6,3 ng nl-1. Εγχύστε 100 nl αιθανόλης 10% (vol/vol) σε νερό. 100 nl 3D20E22P σε 10% αιθανόλη (ισοδύναμο με το 75% της ποσότητας που βρίσκεται σε ένα ζεύγος MAG). Τα κουνούπια κατανεμήθηκαν τυχαία στην ομάδα ένεσης.
Για τις δοκιμασίες ωοτοκίας, θηλυκά 3 ημερών τράφηκαν ad libitum με ανθρώπινο αίμα. Αφαιρέστε τα μερικώς τρεφόμενα ή μη τρεφόμενα κουνούπια. Ανάλογα με την επεξεργασία, τα θηλυκά τοποθετήθηκαν σε ξεχωριστά κύπελλα ωοτοκίας για τέσσερις νύχτες, τουλάχιστον 48 ώρες μετά το αιματογεύμα. Τα αυγά καταμετρήθηκαν με στερεοσκόπιο (Stemi 508, Zeiss). Για τα ζευγαρωμένα θηλυκά, τα αυγά που εκκολάφθηκαν και έγιναν προνύμφες θεωρήθηκαν γόνιμα.
Για τις δοκιμές ζευγαρώματος, τα θηλυκά αφέθηκαν να αναπτυχθούν αντιστάσεις στο ζευγάρωμα για τουλάχιστον 2 ημέρες, ανάλογα με την αγωγή, και αρσενικά άγριου τύπου αντίστοιχης ηλικίας εισήχθησαν στη συνέχεια στο ίδιο κλουβί. Δύο νύχτες αργότερα, τα θηλυκά γονιμοποιημένα κυστίδια ανατομήθηκαν και το γονιδιωματικό DNA απελευθερώθηκε με κατάψυξη-απόψυξη και υπερήχους σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA και 25 mM NaCl (pH 8,2). Τα δείγματα επωάστηκαν με Πρωτεϊνάση Κ (0,86 µg µl-1) για 15 λεπτά στους 55 °C, ακολουθούμενα από 10 λεπτά στους 95 °C. Τα παρασκευάσματα ακατέργαστου γονιδιωματικού DNA αραιώθηκαν 10 φορές και υποβλήθηκαν σε ανίχνευση qPCR των αλληλουχιών του χρωμοσώματος Υ. Οι εκκινητές παρατίθενται στον Εκτεταμένο Πίνακα Δεδομένων 2. Η απουσία αλληλουχίας χρωμοσώματος Υ υποδηλώνει έλλειψη ζευγαρώματος.
Για τις δοκιμασίες επαναζευγαρώματος, τα θηλυκά που είχαν αναγκαστεί να ζευγαρώσουν εξετάστηκαν για την παρουσία βυσμάτων ζευγαρώματος για να επιβεβαιωθεί η κατάσταση ζευγαρώματος και αφέθηκαν 2 ημέρες για να αναπτύξουν ανθεκτικότητα στο ζευγάρωμα απουσία αρσενικών, όπως περιγράφηκε προηγουμένως 36. Τα αρσενικά που έφεραν διαγονιδιακό σπέρμα DsRed εισήχθησαν στη συνέχεια σε θηλυκά κλουβιά. Δύο νύχτες αργότερα, τα γονιμοποιητικά κυστίδια ανατομήθηκαν από τα θηλυκά και το γονιδιωματικό DNA παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω και υποβλήθηκε σε ανίχνευση qPCR του διαγονιδίου DsRed. Οι εκκινητές παρατίθενται στον Εκτεταμένο Πίνακα Δεδομένων 2. Η απουσία του διαγονιδίου DsRed έδειξε ότι δεν έλαβε χώρα επαναζευγαρώματα.
Το 3D20E συντέθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως 37. Εν συντομία, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) διαλύθηκαν σε 10 ml νερού, ακολουθούμενα από την προσθήκη 30 mg μαύρου πλατίνας (σε μορφή σκόνης, Sigma-Aldrich). Ένα απαλό ρεύμα O2 διοχετεύτηκε συνεχώς στο μείγμα αντίδρασης, το οποίο αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από 6 ώρες, προστέθηκαν 30 mL μεθανόλης για να σταματήσει η αντίδραση. Το μείγμα φυγοκεντρήθηκε για την απομάκρυνση των σωματιδίων του καταλύτη. Το υπερκείμενο εξατμίστηκε μέχρι ξηρού υπό κενό σε θερμοκρασία δωματίου. Το ξηρό προϊόν αντίδρασης διαλύθηκε σε 10% αιθανόλη και μεθανόλη για ένεση για ανάλυση HPLC-MS/MS. Ο ρυθμός μετατροπής (από 20E σε 3D20E) ήταν περίπου 97% (Σχήμα 4b) και το φάσμα MS του συντεθειμένου 3D20E ταίριαζε με αυτό που βρέθηκε σε ζευγαρωμένα θηλυκά (Σχήμα 4c).
Ο υπόμνημα περιέχει συγκεκριμένες λεπτομέρειες των στατιστικών δοκιμών που πραγματοποιήθηκαν. Το GraphPad (έκδοση 9.0) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση του Fisher's exact test, του Mantel-Cox test και του Student's t-test. Οι δοκιμές Cochran-Mantel-Haenszel πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο σενάριο R (διαθέσιμο στη διεύθυνση https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Η κατανομή των δεδομένων ελέγχθηκε για κανονικότητα χρησιμοποιώντας το Shapiro-Wilk test με όριο σημαντικότητας 0,05. Όταν τα δεδομένα απέτυχαν στο test κανονικότητας, εκτελέστηκε το Mann-Whitney test. Τα δεδομένα επιβίωσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Mantel-Cox test. Το πακέτο DESeq2 (έκδοση 1.28.1) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση ανάλυσης διαφορικής έκφρασης σε επίπεδο γονιδίου RNA-seq. Η οριζόντια γραμμή στο γράφημα αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή. Μια τιμή σημαντικότητας P = 0,05 χρησιμοποιήθηκε ως όριο για όλες τις δοκιμές.
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τον σχεδιασμό της μελέτης, ανατρέξτε στην περίληψη της Έκθεσης Έρευνας Φύσης που συνδέεται με αυτό το άρθρο.
Τα πρωτεωμικά δεδομένα MS κατατέθηκαν στην Κοινοπραξία ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) μέσω του Αποθετηρίου Συνεργατών PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) με το αναγνωριστικό συνόλου δεδομένων PXD032157.
Το σύνολο δεδομένων RNA-seq έχει κατατεθεί στη Βιβλιοθήκη Ολοκληρωμένης Έκφρασης Γονιδίων (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) με τον σειριακό αριθμό εγγραφής GSE198665.
Πρόσθετα σύνολα δεδομένων που δημιουργήθηκαν ή/και αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια της τρέχουσας μελέτης μπορούν να ληφθούν από τους αντίστοιχους συγγραφείς κατόπιν εύλογου αιτήματος. Αυτό το άρθρο παρέχει τα δεδομένα πηγής.
De Loof, A. Εκδυστεροειδή: Παραμελημένα στεροειδή φύλου εντόμων; Άνδρας: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-υδροξυεκδυσόνη και ανάπτυξη ωοθηκών στο Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).