Το προπιονικό οξύ (PPA), ένας αντιμυκητιασικός παράγοντας και κοινό διαιτητικό πρόσθετο, έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί ανώμαλη νευροανάπτυξη σε ποντίκια που συνοδεύεται από γαστρεντερική δυσλειτουργία, η οποία μπορεί να προκληθεί από δυσβίωση του εντέρου. Έχει προταθεί μια σύνδεση μεταξύ της έκθεσης σε PPA μέσω της διατροφής και της δυσβίωσης του εντερικού μικροβιώματος, αλλά δεν έχει διερευνηθεί άμεσα. Εδώ, διερευνήσαμε τις αλλαγές που σχετίζονται με το PPA στη σύνθεση του εντερικού μικροβιώματος, οι οποίες μπορεί να οδηγήσουν σε δυσβίωση. Τα εντερικά μικροβιώματα ποντικών που τράφηκαν με μη θεραπευμένη διατροφή (n=9) και μια διατροφή εμπλουτισμένη με PPA (n=13) αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας μεταγονιδιωματική αλληλούχιση μεγάλης εμβέλειας για να αξιολογηθούν οι διαφορές στη μικροβιακή σύνθεση και τις βακτηριακές μεταβολικές οδούς. Το διαιτητικό PPA συσχετίστηκε με αύξηση στην αφθονία σημαντικών ταξινομικών ομάδων, συμπεριλαμβανομένων αρκετών ειδών Bacteroides, Prevotella και Ruminococcus, μέλη των οποίων έχουν προηγουμένως εμπλακεί στην παραγωγή PPA. Τα μικροβιώματα των ποντικών που εκτέθηκαν σε PPA είχαν επίσης περισσότερες οδούς που σχετίζονται με τον μεταβολισμό των λιπιδίων και τη βιοσύνθεση στεροειδών ορμονών. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το PPA μπορεί να μεταβάλει το εντερικό μικροβίωμα και τις σχετικές μεταβολικές οδούς του. Αυτές οι παρατηρούμενες αλλαγές υπογραμμίζουν ότι τα συντηρητικά που ταξινομούνται ως ασφαλή για κατανάλωση μπορούν να επηρεάσουν τη σύνθεση του εντερικού μικροβιώματος και, με τη σειρά τους, την ανθρώπινη υγεία. Μεταξύ αυτών, επιλέγονται τα P, G ή S ανάλογα με το επίπεδο ταξινόμησης που αναλύεται. Για την ελαχιστοποίηση του αντίκτυπου των ψευδώς θετικών ταξινομήσεων, υιοθετήθηκε ένα ελάχιστο όριο σχετικής αφθονίας 1e-4 (1/10.000 αναγνώσεις). Πριν από τη στατιστική ανάλυση, οι σχετικές αφθονίες που αναφέρθηκαν από τον Bracken (fraction_total_reads) μετασχηματίστηκαν χρησιμοποιώντας τον μετασχηματισμό κεντραρισμένου λογαριθμικού λόγου (CLR) (Aitchison, 1982). Η μέθοδος CLR επιλέχθηκε για τον μετασχηματισμό δεδομένων επειδή είναι αμετάβλητη ως προς την κλίμακα και επαρκής για μη αραιά σύνολα δεδομένων (Gloor et al., 2017). Ο μετασχηματισμός CLR χρησιμοποιεί τον φυσικό λογάριθμο. Τα δεδομένα μέτρησης που αναφέρθηκαν από τον Bracken κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την σχετική λογαριθμική έκφραση (RLE) (Anders and Huber, 2010). Τα σχήματα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 και διαδοχικών λογαρίθμων (Gloor et al., 2017). 0,12,2 και stantanotations v. 0,5,0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Η αναλογία Bacillus/Bacteroidetes υπολογίστηκε για κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας κανονικοποιημένες βακτηριακές μετρήσεις. Οι τιμές που αναφέρονται στους πίνακες στρογγυλοποιούνται σε 4 δεκαδικά ψηφία. Ο δείκτης ποικιλομορφίας Simpson υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το σενάριο alpha_diversity.py που παρέχεται στο πακέτο KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Η αναφορά Bracken παρέχεται στο σενάριο και ο δείκτης Simpson "Si" παρέχεται για την παράμετρο -an. Σημαντικές διαφορές στην αφθονία ορίστηκαν ως μέσες διαφορές CLR ≥ 1 ή ≤ -1. Μια μέση διαφορά CLR ±1 υποδηλώνει 2,7 φορές αύξηση στην αφθονία ενός τύπου δείγματος. Το πρόσημο (+/-) υποδεικνύει εάν η ταξινομική ομάδα είναι πιο άφθονη στο δείγμα PPA και στο δείγμα ελέγχου, αντίστοιχα. Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το τεστ Mann-Whitney U (Virtanen et al., 2020). Χρησιμοποιήθηκε το Statsmodels v. 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010) και εφαρμόστηκε η διαδικασία Benjamini-Hochberg για τη διόρθωση πολλαπλών δοκιμών. Ως όριο για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημαντικότητας χρησιμοποιήθηκε μια προσαρμοσμένη τιμή p ≤ 0,05.
Το ανθρώπινο μικροβίωμα αναφέρεται συχνά ως «το τελευταίο όργανο του σώματος» και παίζει ζωτικό ρόλο στην ανθρώπινη υγεία (Baquero και Nombela, 2012). Συγκεκριμένα, το μικροβίωμα του εντέρου αναγνωρίζεται για την επιρροή του σε ολόκληρο το σύστημα και τον ρόλο του σε πολλές βασικές λειτουργίες. Τα συμβιωτικά βακτήρια είναι άφθονα στο έντερο, καταλαμβάνοντας πολλαπλές οικολογικές θέσεις, χρησιμοποιώντας θρεπτικά συστατικά και ανταγωνιζόμενα πιθανά παθογόνα (Jandhyala et al., 2015). Ποικίλα βακτηριακά συστατικά του μικροβιώματος του εντέρου είναι ικανά να παράγουν απαραίτητα θρεπτικά συστατικά όπως βιταμίνες και να προάγουν την πέψη (Rowland et al., 2018). Έχει επίσης αποδειχθεί ότι οι βακτηριακοί μεταβολίτες επηρεάζουν την ανάπτυξη των ιστών και ενισχύουν τις μεταβολικές και ανοσολογικές οδούς (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Η σύνθεση του μικροβιώματος του ανθρώπινου εντέρου είναι εξαιρετικά ποικίλη και εξαρτάται από γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως η διατροφή, το φύλο, τα φάρμακα και η κατάσταση της υγείας (Kumbhare et al., 2019).
Η μητρική διατροφή αποτελεί κρίσιμο συστατικό της εμβρυϊκής και νεογνικής ανάπτυξης και πιθανή πηγή ενώσεων που μπορεί να επηρεάσουν την ανάπτυξη (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Μία τέτοια ενδιαφέρουσα ένωση είναι το προπιονικό οξύ (PPA), ένα υποπροϊόν λιπαρού οξέος βραχείας αλυσίδας που λαμβάνεται από βακτηριακή ζύμωση και ένα πρόσθετο τροφίμων (den Besten et al., 2013). Το PPA έχει αντιβακτηριακές και αντιμυκητιακές ιδιότητες και ως εκ τούτου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό τροφίμων και σε βιομηχανικές εφαρμογές για την αναστολή της ανάπτυξης μούχλας και βακτηρίων (Wemmenhove et al., 2016). Το PPA έχει διαφορετικές επιδράσεις σε διαφορετικούς ιστούς. Στο ήπαρ, το PPA έχει αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις επηρεάζοντας την έκφραση κυτοκινών στα μακροφάγα (Kawasoe et al., 2022). Αυτή η ρυθμιστική επίδραση έχει παρατηρηθεί και σε άλλα ανοσοκύτταρα, οδηγώντας σε μείωση της φλεγμονής (Haase et al., 2021). Ωστόσο, το αντίθετο αποτέλεσμα έχει παρατηρηθεί στον εγκέφαλο. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκθεση σε PPA προκαλεί συμπεριφορά που μοιάζει με αυτισμό σε ποντίκια (El-Ansary et al., 2012). Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι το PPA μπορεί να προκαλέσει γλοίωση και να ενεργοποιήσει προφλεγμονώδεις οδούς στον εγκέφαλο (Abdelli et al., 2019). Επειδή το PPA είναι ένα ασθενές οξύ, μπορεί να διαχυθεί μέσω του εντερικού επιθηλίου στην κυκλοφορία του αίματος και έτσι να διασχίσει περιοριστικά εμπόδια, συμπεριλαμβανομένου του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, καθώς και του πλακούντα (Stinson et al., 2019), υπογραμμίζοντας τη σημασία του PPA ως ρυθμιστικού μεταβολίτη που παράγεται από βακτήρια. Αν και ο πιθανός ρόλος του PPA ως παράγοντα κινδύνου για αυτισμό βρίσκεται υπό διερεύνηση, οι επιπτώσεις του σε άτομα με αυτισμό μπορεί να εκτείνονται πέρα από την πρόκληση νευρικής διαφοροποίησης.
Τα γαστρεντερικά συμπτώματα όπως η διάρροια και η δυσκοιλιότητα είναι συχνά σε ασθενείς με νευροαναπτυξιακές διαταραχές (Cao et al., 2021). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το μικροβίωμα ασθενών με διαταραχές του φάσματος του αυτισμού (ΔΑΦ) διαφέρει από αυτό των υγιών ατόμων, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία δυσβίωσης του εντερικού μικροβιώματος (Finegold et al., 2010). Ομοίως, τα χαρακτηριστικά του μικροβιώματος ασθενών με φλεγμονώδεις παθήσεις του εντέρου, παχυσαρκία, νόσο Αλτσχάιμερ κ.λπ. διαφέρουν επίσης από αυτά των υγιών ατόμων (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Ωστόσο, μέχρι σήμερα, δεν έχει τεκμηριωθεί αιτιώδης σχέση μεταξύ του εντερικού μικροβιώματος και νευρολογικών παθήσεων ή συμπτωμάτων (Yap et al., 2021), αν και πολλά βακτηριακά είδη πιστεύεται ότι παίζουν ρόλο σε ορισμένες από αυτές τις παθολογικές καταστάσεις. Για παράδειγμα, τα Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio και άλλα γένη είναι πιο άφθονα στο μικροβίωμα ασθενών με αυτισμό (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Αξίζει να σημειωθεί ότι είδη-μέλη ορισμένων από αυτά τα γένη είναι γνωστό ότι διαθέτουν γονίδια που σχετίζονται με την παραγωγή PPA (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). Δεδομένων των αντιμικροβιακών ιδιοτήτων του PPA, η αύξηση της αφθονίας του μπορεί να είναι ευεργετική για την ανάπτυξη βακτηρίων που παράγουν PPA (Jacobson et al., 2018). Έτσι, ένα περιβάλλον πλούσιο σε PFA μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγές στο μικροβίωμα του εντέρου, συμπεριλαμβανομένων των γαστρεντερικών παθογόνων, τα οποία μπορεί να είναι πιθανοί παράγοντες που οδηγούν σε γαστρεντερικά συμπτώματα.
Ένα κεντρικό ερώτημα στην έρευνα του μικροβιώματος είναι εάν οι διαφορές στη μικροβιακή σύνθεση αποτελούν αιτία ή σύμπτωμα υποκείμενων ασθενειών. Το πρώτο βήμα για την αποσαφήνιση της πολύπλοκης σχέσης μεταξύ της διατροφής, του μικροβιώματος του εντέρου και των νευρολογικών ασθενειών είναι η αξιολόγηση των επιδράσεων της διατροφής στη μικροβιακή σύνθεση. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε μεταγονιδιωματική αλληλούχιση μακράς ανάγνωσης για να συγκρίνουμε τα μικροβιώματα του εντέρου των απογόνων ποντικών που τράφηκαν με δίαιτα πλούσια σε PPA ή χωρίς PPA. Οι απόγονοι τράφηκαν με την ίδια δίαιτα με τις μητέρες τους. Υποθέσαμε ότι μια δίαιτα πλούσια σε PPA θα είχε ως αποτέλεσμα αλλαγές στη μικροβιακή σύνθεση του εντέρου και στις μικροβιακές λειτουργικές οδούς, ιδιαίτερα εκείνες που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του PPA ή/και την παραγωγή PPA.
Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε διαγονιδιακά ποντίκια FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) που υπερεκφράζουν την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) υπό τον έλεγχο του ειδικού για τη γλοία υποκινητή GFAP, ακολουθώντας τις οδηγίες της Επιτροπής Φροντίδας και Χρήσης Θεσμικών Ζώων του Πανεπιστημίου της Κεντρικής Φλόριντα (UCF-IACUC) (Αριθμός Άδειας Χρήσης Ζώων: PROTO202000002). Μετά τον απογαλακτισμό, τα ποντίκια στεγάστηκαν ξεχωριστά σε κλουβιά με 1-5 ποντίκια από κάθε φύλο ανά κλουβί. Τα ποντίκια τρέφονταν ad libitum είτε με καθαρισμένη δίαιτα ελέγχου (τροποποιημένη ανοιχτή τυπική δίαιτα, 16 kcal% λίπος) είτε με δίαιτα συμπληρωμένη με προπιονικό νάτριο (τροποποιημένη ανοιχτή τυπική δίαιτα, 16 kcal% λίπος, που περιείχε 5.000 ppm προπιονικό νάτριο). Η ποσότητα προπιονικού νατρίου που χρησιμοποιήθηκε ήταν ισοδύναμη με 5.000 mg PFA/kg συνολικού βάρους τροφής. Αυτή είναι η υψηλότερη συγκέντρωση PPA που έχει εγκριθεί για χρήση ως συντηρητικό τροφίμων. Για την προετοιμασία αυτής της μελέτης, τα ποντίκια-γονείς τράφηκαν και με τις δύο δίαιτες για 4 εβδομάδες πριν από το ζευγάρωμα και συνέχισαν καθ' όλη τη διάρκεια της εγκυμοσύνης της μητέρας. Τα ποντίκια-απόγονοι [22 ποντίκια, 9 μάρτυρες (6 αρσενικά, 3 θηλυκά) και 13 PPA (4 αρσενικά, 9 θηλυκά)] απογαλακτίστηκαν και στη συνέχεια συνέχισαν την ίδια δίαιτα με τις μητέρας για 5 μήνες. Τα ποντίκια-απόγονοι θυσιάστηκαν σε ηλικία 5 μηνών και το εντερικό τους περιεχόμενο των κοπράνων συλλέχθηκε και αρχικά αποθηκεύτηκε σε μικροφυγοκεντρικούς σωλήνες 1,5 ml στους -20°C και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε καταψύκτη -80°C μέχρι να εξαντληθεί το DNA του ξενιστή και να εξαχθούν τα μικροβιακά νουκλεϊκά οξέα.
Το DNA του ξενιστή αφαιρέθηκε σύμφωνα με ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο (Charalampous et al., 2019). Εν συντομία, τα περιεχόμενα των κοπράνων μεταφέρθηκαν σε 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) και αποθηκεύτηκαν κατεψυγμένα. Επεξεργαστείτε το πολύ 1-2 σφαιρίδια κοπράνων ανά εκχύλιση. Τα περιεχόμενα των κοπράνων στη συνέχεια ομογενοποιήθηκαν μηχανικά χρησιμοποιώντας ένα πλαστικό γουδοχέρι μέσα στο σωλήνα για να σχηματιστεί ένας πολτός. Φυγοκεντρήστε τα δείγματα στις 10.000 RCF για 5 λεπτά ή μέχρι να σφαιροποιηθούν τα δείγματα, στη συνέχεια αναρροφήστε το υπερκείμενο και επαναιωρήστε το σφαιρίδιο σε 250 µl 1× PBS. Προσθέστε 250 µl διαλύματος σαπωνίνης 4,4% (TCI, αριθμός προϊόντος S0019) στο δείγμα ως απορρυπαντικό για την χαλάρωση των μεμβρανών των ευκαρυωτικών κυττάρων. Τα δείγματα αναμίχθηκαν απαλά μέχρι να γίνουν λεία και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, για τη διάσπαση των ευκαρυωτικών κυττάρων, προστέθηκαν στο δείγμα 350 μl νερού χωρίς νουκλεάσες, το οποίο επωάστηκε για 30 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια προστέθηκαν 12 μl 5 M NaCl. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 6000 RCF για 5 λεπτά. Αναρροφήθηκε το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 100 μl 1X PBS. Για την αφαίρεση του DNA του ξενιστή, προστέθηκαν 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος HL-SAN (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml νερού χωρίς νουκλεάσες) και 10 μl ενζύμου HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Τα δείγματα αναμίχθηκαν καλά με πιπέτα και επωάστηκαν στους 37 °C για 30 λεπτά στις 800 rpm σε ένα Eppendorf™ ThermoMixer C. Μετά την επώαση, φυγοκεντρήθηκαν στις 6000 RCF για 3 λεπτά και πλύθηκαν δύο φορές με 800 µl και 1000 µl 1X PBS. Τέλος, επαναιωρήθηκε το ίζημα σε 100 µl 1X PBS.
Το συνολικό βακτηριακό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού γονιδιωματικού DNA Monarch της New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Η τυπική διαδικασία λειτουργίας που παρέχεται με το κιτ είναι ελαφρώς τροποποιημένη. Επωάστε και διατηρήστε νερό χωρίς νουκλεάσες στους 60°C πριν από τη λειτουργία για την τελική έκλουση. Προσθέστε 10 µl Πρωτεϊνάση Κ και 3 µl RNάση Α σε κάθε δείγμα. Στη συνέχεια, προσθέστε 100 µl ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρων και αναμείξτε απαλά. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν σε Eppendorf™ ThermoMixer C στους 56°C και στις 1400 rpm για τουλάχιστον 1 ώρα και έως 3 ώρες. Τα επωασμένα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 12.000 RCF για 3 λεπτά και το υπερκείμενο από κάθε δείγμα μεταφέρθηκε σε ξεχωριστό μικροφυγοκεντρικό σωλήνα 1,5 mL που περιείχε 400 µL διαλύματος σύνδεσης. Οι σωλήνες στη συνέχεια αναδεύτηκαν με παλμικό στροβιλισμό για 5-10 δευτερόλεπτα σε διαστήματα 1 δευτερολέπτου. Μεταφέρετε ολόκληρο το υγρό περιεχόμενο κάθε δείγματος (περίπου 600–700 µL) σε ένα φίλτρο τοποθετημένο σε έναν σωλήνα συλλογής ροής. Οι σωλήνες φυγοκεντρήθηκαν στα 1.000 RCF για 3 λεπτά για να επιτραπεί η αρχική δέσμευση του DNA και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 RCF για 1 λεπτό για να απομακρυνθεί το υπολειμματικό υγρό. Η στήλη δείγματος μεταφέρθηκε σε έναν νέο σωλήνα συλλογής και στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές. Για την πρώτη πλύση, προσθέστε 500 µL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης σε κάθε σωλήνα. Αναστρέψτε τον σωλήνα 3–5 φορές και στη συνέχεια φυγοκεντρήστε στα 12.000 RCF για 1 λεπτό. Απορρίψτε το υγρό από τον σωλήνα συλλογής και τοποθετήστε το φίλτρο πίσω στον ίδιο σωλήνα συλλογής. Για τη δεύτερη πλύση, προσθέστε 500 µL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης στο φίλτρο χωρίς αναστροφή. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 RCF για 1 λεπτό. Μεταφέρετε το φίλτρο σε έναν σωλήνα LoBind® 1,5 mL και προσθέστε 100 µL προθερμασμένου νερού χωρίς νουκλεάσες. Τα φίλτρα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις 12.000 RCF για 1 λεπτό. Το εκλουσμένο DNA αποθηκεύτηκε στους -80°C.
Η συγκέντρωση DNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Φθορόμετρο Qubit™ 4.0. Το DNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (Αρ. Κατ. Q33231) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η κατανομή μήκους των θραυσμάτων DNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Aglient™ 4150 ή 4200 TapeStation. Το DNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τα Agilent™ Genomic DNA Reagents (Αρ. Κατ. 5067-5366) και Genomic DNA ScreenTape (Αρ. Κατ. 5067-5365). Η προετοιμασία της βιβλιοθήκης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το DNA αλληλουχήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αλληλουχητή ONT GridION™ Mk1 με κυψελίδα ροής Min106D (R 9.4.1). Οι ρυθμίσεις αλληλούχισης ήταν: κλήση βάσης υψηλής ακρίβειας, ελάχιστη τιμή q 9, ρύθμιση γραμμωτού κώδικα και περικοπή γραμμωτού κώδικα. Τα δείγματα αλληλουχήθηκαν για 72 ώρες, μετά τις οποίες τα δεδομένα βασικής κλήσης υποβλήθηκαν για περαιτέρω επεξεργασία και ανάλυση.
Η βιοπληροφορική επεξεργασία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας προηγουμένως περιγραφόμενες μεθόδους (Greenman et al., 2024). Τα αρχεία FASTQ που ελήφθησαν από την αλληλούχιση χωρίστηκαν σε καταλόγους για κάθε δείγμα. Πριν από την βιοπληροφορική ανάλυση, τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας την ακόλουθη διαδικασία: πρώτα, τα αρχεία FASTQ των δειγμάτων συγχωνεύθηκαν σε ένα ενιαίο αρχείο FASTQ. Στη συνέχεια, οι αναγνώσεις μικρότερες από 1000 bp φιλτραρίστηκαν χρησιμοποιώντας το Filtlong v. 0.2.1, με τη μόνη παράμετρο που άλλαξε να είναι –min_length 1000 (Wick, 2024). Πριν από περαιτέρω φιλτράρισμα, η ποιότητα ανάγνωσης ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας το NanoPlot v. 1.41.3 με τις ακόλουθες παραμέτρους: –fastq –plots dot –N50 -o
Για την ταξινομική ταξινόμηση, οι αναγνώσεις και οι συναρμολογημένες συνεχόμενες γραμμές ταξινομήθηκαν χρησιμοποιώντας το Kraken2 έκδοση 2.1.2 (Wood et al., 2019). Δημιουργήστε αναφορές και αρχεία εξόδου για αναγνώσεις και συναρμολογήσεις, αντίστοιχα. Χρησιμοποιήστε την επιλογή –use-names για να αναλύσετε αναγνώσεις και συναρμολογήσεις. Οι επιλογές –gzip-compressed και –paired καθορίζονται για τα τμήματα ανάγνωσης. Η σχετική αφθονία των taxa στα μεταγονιδιώματα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας το Bracken έκδοση 2.8 (Lu et al., 2017). Αρχικά δημιουργήσαμε μια βάση δεδομένων kmer που περιείχε 1000 βάσεις χρησιμοποιώντας το bracken-build με τις ακόλουθες παραμέτρους: -d
Η σχολιασμός γονιδίων και η εκτίμηση της σχετικής αφθονίας πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη έκδοση του πρωτοκόλλου που περιγράφεται από τους Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Αρχικά, οι συνεχόμενες περιοχές (contigs) μικρότερες από 500 bp αφαιρέθηκαν από όλες τις συναρμολογήσεις χρησιμοποιώντας το SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Οι επιλεγμένες συναρμολογήσεις στη συνέχεια συνδυάστηκαν σε ένα παν-μεταγονιδίωμα. Τα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs) ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Prodigal v. 1.0.1 (μια παράλληλη έκδοση του Prodigal v. 2.6.3) με τις ακόλουθες παραμέτρους: -d
Τα γονίδια ομαδοποιήθηκαν αρχικά σύμφωνα με τους ορθολογικούς (KO) αναγνωριστικούς κωδικούς της Εγκυκλοπαίδειας Γονιδίων και Γονιδιωμάτων του Κιότο (KEGG) που έχουν εκχωρηθεί από το eggNOG για τη σύγκριση των αφθονιών των γονιδιακών μονοπατιών. Τα γονίδια χωρίς knockout ή τα γονίδια με πολλαπλά knockout αφαιρέθηκαν πριν από την ανάλυση. Στη συνέχεια υπολογίστηκε η μέση αφθονία κάθε KO ανά δείγμα και πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση. Τα γονίδια μεταβολισμού PPA ορίστηκαν ως οποιοδήποτε γονίδιο στο οποίο εκχωρήθηκε η σειρά ko00640 στη στήλη KEGG_Pathway, υποδεικνύοντας έναν ρόλο στον μεταβολισμό του προπιονικού σύμφωνα με το KEGG. Τα γονίδια που αναγνωρίστηκαν ως σχετιζόμενα με την παραγωγή PPA παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές μετάθεσης για τον εντοπισμό γονιδίων μεταβολισμού και παραγωγής PPA που ήταν σημαντικά πιο άφθονα σε κάθε τύπο δείγματος. Πραγματοποιήθηκαν χίλιες μετάθεσης για κάθε γονίδιο που αναλύθηκε. Μια τιμή p 0,05 χρησιμοποιήθηκε ως όριο για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημαντικότητας. Λειτουργικές σχολιασμοί εκχωρήθηκαν σε μεμονωμένα γονίδια εντός μιας συστάδας με βάση τις σχολιασμοί αντιπροσωπευτικών γονιδίων εντός της συστάδας. Τα taxa που σχετίζονται με τον μεταβολισμό ή/και την παραγωγή PPA μπορούσαν να αναγνωριστούν με την αντιστοίχιση των contig IDs στα αρχεία εξόδου Kraken2 με τα ίδια contig IDs που διατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της λειτουργικής σχολίασης χρησιμοποιώντας το eggNOG. Ο έλεγχος σημαντικότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Mann-Whitney U που περιγράφηκε προηγουμένως. Η διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη διαδικασία Benjamini-Hochberg. Μια τιμή p ≤ 0,05 χρησιμοποιήθηκε ως όριο για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημαντικότητας.
Η ποικιλομορφία του εντερικού μικροβιώματος των ποντικών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τον δείκτη ποικιλομορφίας Simpson. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και PPA όσον αφορά την ποικιλομορφία γένους και είδους (τιμή p για το γένος: 0,18, τιμή p για το είδος: 0,16) (Σχήμα 1). Η μικροβιακή σύνθεση συγκρίθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ανάλυση κύριων συστατικών (PCA). Το Σχήμα 2 δείχνει την ομαδοποίηση των δειγμάτων ανά φύλο, υποδεικνύοντας ότι υπήρχαν διαφορές στη σύνθεση ειδών των μικροβιωμάτων μεταξύ των δειγμάτων PPA και των δειγμάτων ελέγχου. Αυτή η ομαδοποίηση ήταν λιγότερο έντονη σε επίπεδο γένους, υποδηλώνοντας ότι το PPA επηρεάζει ορισμένα βακτήρια (Συμπληρωματικό Σχήμα 1).
Σχήμα 1. Άλφα ποικιλομορφία γενών και σύνθεση ειδών του μικροβιώματος του εντέρου ποντικού. Διαγράμματα κουτιών που δείχνουν δείκτες ποικιλομορφίας Simpson των γενών (Α) και των ειδών (Β) σε δείγματα PPA και ελέγχου. Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Mann-Whitney U και πραγματοποιήθηκε πολλαπλή διόρθωση χρησιμοποιώντας τη διαδικασία Benjamini-Hochberg. ns, η τιμή p δεν ήταν σημαντική (p>0,05).
Σχήμα 2. Αποτελέσματα ανάλυσης κύριων συστατικών της σύνθεσης του μικροβιώματος του εντέρου ποντικού σε επίπεδο είδους. Το διάγραμμα ανάλυσης κύριων συστατικών εμφανίζει την κατανομή των δειγμάτων στα δύο πρώτα κύρια συστατικά τους. Τα χρώματα υποδεικνύουν τον τύπο του δείγματος: Τα ποντίκια που εκτέθηκαν σε PPA είναι μοβ και τα ποντίκια ελέγχου είναι κίτρινα. Τα κύρια συστατικά 1 και 2 απεικονίζονται γραφικά στον άξονα x και στον άξονα y, αντίστοιχα, και εκφράζονται ως ο εξηγημένος λόγος διακύμανσής τους.
Χρησιμοποιώντας δεδομένα μέτρησης μετασχηματισμένα με RLE, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στη διάμεση αναλογία Bacteroidetes/Bacilli σε ποντίκια ελέγχου και PPA (έλεγχος: 9,66, PPA: 3,02; τιμή p = 0,0011). Αυτή η διαφορά οφειλόταν στην υψηλότερη αφθονία Bacteroidetes σε ποντίκια PPA σε σύγκριση με τους μάρτυρες, αν και η διαφορά δεν ήταν σημαντική (μέση τιμή CLR ελέγχου: 5,51, μέση τιμή CLR PPA: 6,62; τιμή p = 0,054), ενώ η αφθονία Bacteroidetes ήταν παρόμοια (μέση τιμή CLR ελέγχου: 7,76, μέση τιμή CLR PPA: 7,60; τιμή p = 0,18).
Η ανάλυση της αφθονίας των ταξινομικών μελών του μικροβιώματος του εντέρου αποκάλυψε ότι 1 φύλο και 77 είδη διέφεραν σημαντικά μεταξύ των δειγμάτων PPA και των δειγμάτων ελέγχου (Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Η αφθονία 59 ειδών σε δείγματα PPA ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή στα δείγματα ελέγχου, ενώ η αφθονία μόνο 16 ειδών σε δείγματα ελέγχου ήταν υψηλότερη από αυτή στα δείγματα PPA (Σχήμα 3).
Σχήμα 3. Διαφορική αφθονία των taxa στο μικροβίωμα του εντέρου ποντικών PPA και ποντικών ελέγχου. Τα διαγράμματα ηφαιστείου εμφανίζουν διαφορές στην αφθονία των γενών (A) ή των ειδών (B) μεταξύ των δειγμάτων PPA και ελέγχου. Οι γκρίζες κουκκίδες δεν υποδεικνύουν σημαντική διαφορά στην αφθονία των taxa. Οι έγχρωμες κουκκίδες υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές στην αφθονία (τιμή p ≤ 0,05). Τα 20 κορυφαία taxa με τις μεγαλύτερες διαφορές στην αφθονία μεταξύ των τύπων δειγμάτων εμφανίζονται με κόκκινο και ανοιχτό μπλε (δείγματα ελέγχου και PPA), αντίστοιχα. Οι κίτρινες και μοβ κουκκίδες ήταν τουλάχιστον 2,7 φορές πιο άφθονες στα δείγματα ελέγχου ή PPA από ό,τι στους μάρτυρες. Οι μαύρες κουκκίδες αντιπροσωπεύουν taxa με σημαντικά διαφορετικές αφθονίες, με μέσες διαφορές CLR μεταξύ -1 και 1. Οι τιμές P υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Mann-Whitney U και διορθώθηκαν για πολλαπλές δοκιμές χρησιμοποιώντας τη διαδικασία Benjamini-Hochberg. Οι έντονες μέσες διαφορές CLR υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές στην αφθονία.
Αφού αναλύσαμε τη μικροβιακή σύνθεση του εντέρου, πραγματοποιήσαμε μια λειτουργική σχολιασμό του μικροβιώματος. Αφού φιλτράραμε τα γονίδια χαμηλής ποιότητας, εντοπίσαμε συνολικά 378.355 μοναδικά γονίδια σε όλα τα δείγματα. Η μετασχηματισμένη αφθονία αυτών των γονιδίων χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση κύριων συστατικών (PCA) και τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλό βαθμό ομαδοποίησης των τύπων δειγμάτων με βάση τα λειτουργικά τους προφίλ (Σχήμα 4).
Σχήμα 4. Αποτελέσματα PCA χρησιμοποιώντας το λειτουργικό προφίλ του μικροβιώματος του εντέρου ποντικού. Το διάγραμμα PCA εμφανίζει την κατανομή των δειγμάτων στα δύο πρώτα κύρια συστατικά τους. Τα χρώματα υποδεικνύουν τον τύπο του δείγματος: Τα ποντίκια που εκτέθηκαν σε PPA είναι μοβ και τα ποντίκια ελέγχου είναι κίτρινα. Τα κύρια συστατικά 1 και 2 απεικονίζονται γραφικά στον άξονα x και στον άξονα y, αντίστοιχα, και εκφράζονται ως ο εξηγημένος λόγος διακύμανσής τους.
Στη συνέχεια εξετάσαμε την αφθονία των απομονώσεων KEGG σε διαφορετικούς τύπους δειγμάτων. Συνολικά εντοπίστηκαν 3648 μοναδικά απομονώσεις, εκ των οποίων οι 196 ήταν σημαντικά πιο άφθονες στα δείγματα ελέγχου και οι 106 ήταν πιο άφθονες σε δείγματα PPA (Σχήμα 5). Συνολικά ανιχνεύθηκαν 145 γονίδια σε δείγματα ελέγχου και 61 γονίδια σε δείγματα PPA, με σημαντικά διαφορετικές αφθονίες. Οι οδοί που σχετίζονται με τον μεταβολισμό των λιπιδίων και των αμινοσακχάρων ήταν σημαντικά πιο εμπλουτισμένες στα δείγματα PPA (Συμπληρωματικός Πίνακας 3). Οι οδοί που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του αζώτου και τα συστήματα αναμετάδοσης θείου ήταν σημαντικά πιο εμπλουτισμένες στα δείγματα ελέγχου (Συμπληρωματικός Πίνακας 3). Η αφθονία των γονιδίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό των αμινοσακχάρων/νουκλεοτιδίων (ko:K21279) και τον μεταβολισμό της φωσφορικής ινοσιτόλης (ko:K07291) ήταν σημαντικά υψηλότερη στα δείγματα PPA (Σχήμα 5). Τα δείγματα ελέγχου είχαν σημαντικά περισσότερα γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό των βενζοϊκών (ko:K22270), τον μεταβολισμό του αζώτου (ko:K00368) και τη γλυκόλυση/γλυκονεογένεση (ko:K00131) (Σχήμα 5).
Σχήμα 5. Διαφορική αφθονία KOs στο μικροβίωμα του εντέρου ποντικών PPA και ποντικών ελέγχου. Το διάγραμμα ηφαιστείου απεικονίζει τις διαφορές στην αφθονία των λειτουργικών ομάδων (KOs). Οι γκρίζες κουκκίδες υποδεικνύουν KOs των οποίων η αφθονία δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των τύπων δειγμάτων (τιμή p > 0,05). Οι έγχρωμες κουκκίδες υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές στην αφθονία (τιμή p ≤ 0,05). Τα 20 KOs με τις μεγαλύτερες διαφορές στην αφθονία μεταξύ των τύπων δειγμάτων εμφανίζονται με κόκκινο και ανοιχτό μπλε, που αντιστοιχούν σε δείγματα ελέγχου και PPA, αντίστοιχα. Οι κίτρινες και μοβ κουκκίδες υποδεικνύουν KOs που ήταν τουλάχιστον 2,7 φορές πιο άφθονα σε δείγματα ελέγχου και PPA, αντίστοιχα. Οι μαύρες κουκκίδες υποδεικνύουν KOs με σημαντικά διαφορετικές αφθονίες, με μέσες διαφορές CLR μεταξύ -1 και 1. Οι τιμές P υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Mann-Whitney U και προσαρμόστηκαν για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας τη διαδικασία Benjamini-Hochberg. Το NaN υποδεικνύει ότι το KO δεν ανήκει σε κάποια οδό στο KEGG. Οι έντονες μέσες τιμές διαφοράς CLR υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές στην αφθονία. Για λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τις οδούς στις οποίες ανήκουν οι αναφερόμενες KO, βλ. Συμπληρωματικό Πίνακα 3.
Μεταξύ των σχολιασμένων γονιδίων, 1601 γονίδια είχαν σημαντικά διαφορετικές αφθονίες μεταξύ των τύπων δειγμάτων (p ≤ 0,05), με κάθε γονίδιο να είναι τουλάχιστον 2,7 φορές πιο άφθονο. Από αυτά τα γονίδια, 4 γονίδια ήταν πιο άφθονα στα δείγματα ελέγχου και 1597 γονίδια ήταν πιο άφθονα σε δείγματα PPA. Επειδή το PPA έχει αντιμικροβιακές ιδιότητες, εξετάσαμε τις αφθονίες των γονιδίων μεταβολισμού και παραγωγής PPA μεταξύ των τύπων δειγμάτων. Μεταξύ των 1332 γονιδίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του PPA, 27 γονίδια ήταν σημαντικά πιο άφθονα στα δείγματα ελέγχου και 12 γονίδια ήταν πιο άφθονα σε δείγματα PPA. Μεταξύ των 223 γονιδίων που σχετίζονται με την παραγωγή PPA, 1 γονίδιο ήταν σημαντικά πιο άφθονο στα δείγματα PPA. Το Σχήμα 6Α καταδεικνύει περαιτέρω την υψηλότερη αφθονία γονιδίων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του PPA, με σημαντικά υψηλότερη αφθονία στα δείγματα ελέγχου και μεγάλα μεγέθη φαινομένων, ενώ το Σχήμα 6Β επισημαίνει μεμονωμένα γονίδια με σημαντικά υψηλότερη αφθονία που παρατηρήθηκε σε δείγματα PPA.
Σχήμα 6. Διαφορική αφθονία γονιδίων που σχετίζονται με την PPA στο μικροβίωμα του εντέρου ποντικού. Τα διαγράμματα Volcano απεικονίζουν τις διαφορές στην αφθονία των γονιδίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό της PPA (A) και την παραγωγή PPA (B). Οι γκρίζες κουκκίδες υποδεικνύουν γονίδια των οποίων η αφθονία δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των τύπων δειγμάτων (τιμή p > 0,05). Οι έγχρωμες κουκκίδες υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές στην αφθονία (τιμή p ≤ 0,05). Τα 20 γονίδια με τις μεγαλύτερες διαφορές στην αφθονία εμφανίζονται με κόκκινο και ανοιχτό μπλε χρώμα (δείγματα ελέγχου και PPA), αντίστοιχα. Η αφθονία των κίτρινων και μοβ κουκκίδων ήταν τουλάχιστον 2,7 φορές μεγαλύτερη στα δείγματα ελέγχου και PPA από ό,τι στα δείγματα ελέγχου. Οι μαύρες κουκκίδες αντιπροσωπεύουν γονίδια με σημαντικά διαφορετικές αφθονίες, με μέσες διαφορές CLR μεταξύ -1 και 1. Οι τιμές P υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Mann-Whitney U και διορθώθηκαν για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας τη διαδικασία Benjamini-Hochberg. Τα γονίδια αντιστοιχούν σε αντιπροσωπευτικά γονίδια στον μη πλεονάζοντα κατάλογο γονιδίων. Τα ονόματα γονιδίων αποτελούνται από το σύμβολο KEGG που υποδηλώνει ένα γονίδιο KO. Οι έντονες μέσες διαφορές CLR υποδεικνύουν σημαντικά διαφορετικές αφθονίες. Μια παύλα (-) υποδεικνύει ότι δεν υπάρχει σύμβολο για το γονίδιο στη βάση δεδομένων KEGG.
Τα ταξινομικά είδη με γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό και/ή την παραγωγή PPA ταυτοποιήθηκαν αντιστοιχίζοντας την ταξινομική ταυτότητα των contigs με το contig ID του γονιδίου. Σε επίπεδο γένους, βρέθηκαν 130 γένη που είχαν γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του PPA και 61 γένη που είχαν γονίδια που σχετίζονται με την παραγωγή PPA (Συμπληρωματικός Πίνακας 4). Ωστόσο, κανένα γένη δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές στην αφθονία (p > 0,05).
Σε επίπεδο είδους, βρέθηκαν 144 βακτηριακά είδη που έχουν γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του PPA και 68 βακτηριακά είδη που έχουν γονίδια που σχετίζονται με την παραγωγή PPA (Συμπληρωματικός Πίνακας 5). Μεταξύ των μεταβολιστών του PPA, οκτώ βακτήρια εμφάνισαν σημαντικές αυξήσεις στην αφθονία μεταξύ των τύπων δειγμάτων και όλα εμφάνισαν σημαντικές αλλαγές στην αποτελεσματικότητα (Συμπληρωματικός Πίνακας 6). Όλοι οι ταυτοποιημένοι μεταβολιστές του PPA με σημαντικές διαφορές στην αφθονία ήταν πιο άφθονοι στα δείγματα PPA. Η ταξινόμηση σε επίπεδο είδους αποκάλυψε εκπροσώπους γενών που δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των τύπων δειγμάτων, συμπεριλαμβανομένων αρκετών ειδών Bacteroides και Ruminococcus, καθώς και Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinylyticus και Alcaligenes polymorpha. Μεταξύ των βακτηρίων που παράγουν PPA, τέσσερα βακτήρια εμφάνισαν σημαντικές διαφορές στην αφθονία μεταξύ των τύπων δειγμάτων. Είδη με σημαντικές διαφορές στην αφθονία περιελάμβαναν τα Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis και Ruminococcus bovis.
Σε αυτήν τη μελέτη, εξετάσαμε τις επιδράσεις της έκθεσης σε PPA στο εντερικό μικροβίωμα ποντικών. Το PPA μπορεί να προκαλέσει διαφορετικές αντιδράσεις στα βακτήρια επειδή παράγεται από ορισμένα είδη, χρησιμοποιείται ως πηγή τροφής από άλλα είδη ή έχει αντιμικροβιακές επιδράσεις. Επομένως, η προσθήκη του στο εντερικό περιβάλλον μέσω διαιτητικών συμπληρωμάτων μπορεί να έχει διαφορετικές επιδράσεις ανάλογα με την ανοχή, την ευαισθησία και την ικανότητα αξιοποίησής του ως πηγή θρεπτικών συστατικών. Τα ευαίσθητα βακτηριακά είδη μπορούν να εξαλειφθούν και να αντικατασταθούν από εκείνα που είναι πιο ανθεκτικά στο PPA ή είναι σε θέση να το χρησιμοποιήσουν ως πηγή τροφής, οδηγώντας σε αλλαγές στη σύνθεση του εντερικού μικροβιώματος. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν σημαντικές διαφορές στη μικροβιακή σύνθεση, αλλά καμία επίδραση στη συνολική μικροβιακή ποικιλομορφία. Οι μεγαλύτερες επιδράσεις παρατηρήθηκαν σε επίπεδο είδους, με πάνω από 70 taxa να διαφέρουν σημαντικά σε αφθονία μεταξύ του PPA και των δειγμάτων ελέγχου (Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Περαιτέρω αξιολόγηση της σύνθεσης των δειγμάτων που εκτέθηκαν σε PPA αποκάλυψε μεγαλύτερη ετερογένεια των μικροβιακών ειδών σε σύγκριση με τα μη εκτεθειμένα δείγματα, υποδηλώνοντας ότι το PPA μπορεί να ενισχύσει τα χαρακτηριστικά βακτηριακής ανάπτυξης και να περιορίσει τους βακτηριακούς πληθυσμούς που μπορούν να επιβιώσουν σε περιβάλλοντα πλούσια σε PPA. Έτσι, το PPA μπορεί να προκαλέσει επιλεκτικά αλλαγές αντί να προκαλέσει εκτεταμένη διαταραχή της ποικιλομορφίας της μικροχλωρίδας του εντέρου.
Τα συντηρητικά τροφίμων όπως το PPA έχουν αποδειχθεί προηγουμένως ότι μεταβάλλουν την αφθονία των συστατικών του μικροβιώματος του εντέρου χωρίς να επηρεάζουν τη συνολική ποικιλομορφία (Nagpal et al., 2021). Εδώ, παρατηρήσαμε τις πιο εντυπωσιακές διαφορές μεταξύ των ειδών Bacteroidetes εντός του φύλου Bacteroidetes (παλαιότερα γνωστό ως Bacteroidetes), τα οποία ήταν σημαντικά εμπλουτισμένα σε ποντίκια που εκτέθηκαν σε PPA. Η αυξημένη αφθονία των ειδών Bacteroides σχετίζεται με αυξημένη αποικοδόμηση βλέννας, η οποία μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο μόλυνσης και να προάγει τη φλεγμονή (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Μία μελέτη διαπίστωσε ότι τα νεογνά αρσενικά ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Bacteroides fragilis εμφάνισαν κοινωνικές συμπεριφορές που θυμίζουν διαταραχή του φάσματος του αυτισμού (ASD) (Carmel et al., 2023), και άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι τα είδη Bacteroides μπορούν να μεταβάλουν την ανοσολογική δραστηριότητα και να οδηγήσουν σε αυτοάνοση φλεγμονώδη καρδιομυοπάθεια (Gil-Cruz et al., 2019). Είδη που ανήκουν στα γένη Ruminococcus, Prevotella και Parabacteroides αυξήθηκαν επίσης σημαντικά σε ποντίκια που εκτέθηκαν σε PPA (Coretti et al., 2018). Ορισμένα είδη Ruminococcus σχετίζονται με ασθένειες όπως η νόσος του Crohn μέσω της παραγωγής προφλεγμονωδών κυτοκινών (Henke et al., 2019), ενώ είδη Prevotella όπως η Prevotella humani σχετίζονται με μεταβολικές ασθένειες όπως η υπέρταση και η ευαισθησία στην ινσουλίνη (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Τέλος, διαπιστώσαμε ότι η αναλογία Bacteroidetes (παλαιότερα γνωστά ως Firmicutes) προς Bacteroidetes ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ποντίκια που εκτέθηκαν σε PPA σε σχέση με τα ποντίκια ελέγχου λόγω της μεγαλύτερης συνολικής αφθονίας ειδών Bacteroidetes. Αυτή η αναλογία έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι αποτελεί σημαντικό δείκτη της εντερικής ομοιόστασης και οι διαταραχές σε αυτήν την αναλογία έχουν συσχετιστεί με διάφορες παθήσεις (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), συμπεριλαμβανομένων των φλεγμονωδών παθήσεων του εντέρου (Stojanov et al., 2020). Συλλογικά, τα είδη του φύλου Bacteroidetes φαίνεται να επηρεάζονται περισσότερο από την αυξημένη διαιτητική PPA. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε υψηλότερη ανοχή στην PPA ή στην ικανότητα αξιοποίησης της PPA ως πηγή ενέργειας, κάτι που έχει αποδειχθεί ότι ισχύει για τουλάχιστον ένα είδος, την Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Εναλλακτικά, η έκθεση της μητέρας σε PPA μπορεί να ενισχύσει την ανάπτυξη του εμβρύου καθιστώντας το έντερο των απογόνων ποντικών πιο ευάλωτο στον αποικισμό από Bacteroidetes. Ωστόσο, ο σχεδιασμός της μελέτης μας δεν επέτρεψε μια τέτοια αξιολόγηση.
Η αξιολόγηση του μεταγονιδιωματικού περιεχομένου αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στην αφθονία των γονιδίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό και την παραγωγή PPA, με τα ποντίκια που εκτέθηκαν σε PPA να εμφανίζουν μεγαλύτερη αφθονία γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή PPA, ενώ τα ποντίκια που δεν εκτέθηκαν σε PPA εμφάνισαν μεγαλύτερη αφθονία γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τον μεταβολισμό του PAA (Σχήμα 6). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η επίδραση του PPA στη μικροβιακή σύνθεση μπορεί να μην οφείλεται αποκλειστικά στη χρήση του, διαφορετικά η αφθονία των γονιδίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του PPA θα έπρεπε να είχε δείξει μεγαλύτερη αφθονία στο μικροβίωμα του εντέρου των ποντικών που εκτέθηκαν σε PPA. Μια εξήγηση είναι ότι το PPA προκαλεί την βακτηριακή αφθονία κυρίως μέσω των αντιμικροβιακών του επιδράσεων και όχι μέσω της χρήσης του από τα βακτήρια ως θρεπτικό συστατικό. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το PPA αναστέλλει την ανάπτυξη του Salmonella Typhimurium με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Jacobson et al., 2018). Η έκθεση σε υψηλότερες συγκεντρώσεις PPA μπορεί να επιλέξει βακτήρια που είναι ανθεκτικά στις αντιμικροβιακές του ιδιότητες και μπορεί να μην είναι απαραίτητα σε θέση να το μεταβολίσουν ή να το παράγουν. Για παράδειγμα, αρκετά είδη Parabacteroides εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη αφθονία σε δείγματα PPA, αλλά δεν ανιχνεύθηκαν γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό ή την παραγωγή PPA (Συμπληρωματικοί Πίνακες 2, 4 και 5). Επιπλέον, η παραγωγή PPA ως υποπροϊόν ζύμωσης κατανέμεται ευρέως μεταξύ διαφόρων βακτηρίων (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Η υψηλότερη βακτηριακή ποικιλομορφία μπορεί να είναι ο λόγος για την υψηλότερη αφθονία γονιδίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του PPA σε δείγματα ελέγχου (Averina et al., 2020). Επιπλέον, μόνο 27 (2,14%) από τα 1332 γονίδια προβλεπόταν να είναι γονίδια που σχετίζονται αποκλειστικά με τον μεταβολισμό του PPA. Πολλά γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του PPA εμπλέκονται επίσης σε άλλες μεταβολικές οδούς. Αυτό καταδεικνύει περαιτέρω ότι η αφθονία γονιδίων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του PPA ήταν υψηλότερη στα δείγματα ελέγχου. Αυτά τα γονίδια μπορεί να λειτουργούν σε οδούς που δεν οδηγούν σε χρήση ή σχηματισμό PPA ως υποπροϊόν. Σε αυτήν την περίπτωση, μόνο ένα γονίδιο που σχετίζεται με την παραγωγή PPA έδειξε σημαντικές διαφορές στην αφθονία μεταξύ των τύπων δειγμάτων. Σε αντίθεση με τα γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του PPA, τα γονίδια-δείκτες για την παραγωγή PPA επιλέχθηκαν επειδή εμπλέκονται άμεσα στην βακτηριακή οδό για την παραγωγή PPA. Σε ποντίκια που εκτέθηκαν σε PPA, όλα τα είδη βρέθηκαν να έχουν σημαντικά αυξημένη αφθονία και ικανότητα παραγωγής PPA. Αυτό υποστηρίζει την πρόβλεψη ότι τα PPA θα επέλεγαν παραγωγούς PPA και επομένως προβλέπουν ότι η ικανότητα παραγωγής PPA θα αυξανόταν. Ωστόσο, η αφθονία των γονιδίων δεν συσχετίζεται απαραίτητα με την έκφραση γονιδίων. Έτσι, αν και η αφθονία των γονιδίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του PPA είναι υψηλότερη στα δείγματα ελέγχου, ο ρυθμός έκφρασης μπορεί να είναι διαφορετικός (Shi et al., 2014). Για να επιβεβαιωθεί η σχέση μεταξύ της επικράτησης των γονιδίων που παράγουν PPA και της παραγωγής PPA, απαιτούνται μελέτες για την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην παραγωγή PPA.
Η λειτουργική σχολιασμός των μεταγονιδιωμάτων PPA και ελέγχου αποκάλυψε ορισμένες διαφορές. Η ανάλυση PCA του περιεχομένου γονιδίων αποκάλυψε διακριτές συστάδες μεταξύ των δειγμάτων PPA και ελέγχου (Σχήμα 5). Η συσταδοποίηση εντός του δείγματος αποκάλυψε ότι το περιεχόμενο των γονιδίων ελέγχου ήταν πιο ποικιλόμορφο, ενώ τα δείγματα PPA συσταδοποιήθηκαν μαζί. Η συσταδοποίηση ανά περιεχόμενο γονιδίων ήταν συγκρίσιμη με την συσταδοποίηση ανά σύνθεση είδους. Έτσι, οι διαφορές στην αφθονία των οδών είναι συνεπείς με τις αλλαγές στην αφθονία συγκεκριμένων ειδών και στελεχών εντός αυτών. Σε δείγματα PPA, δύο οδοί με σημαντικά υψηλότερη αφθονία σχετίζονταν με τον μεταβολισμό αμινοσακχάρων/νουκλεοτιδίων (ko:K21279) και πολλαπλές οδούς μεταβολισμού λιπιδίων (ko:K00647, ko:K03801· Συμπληρωματικός Πίνακας 3). Τα γονίδια που σχετίζονται με το ko:K21279 είναι γνωστό ότι σχετίζονται με το γένος Bacteroides, ένα από τα γένη με σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό ειδών στα δείγματα PPA. Αυτό το ένζυμο μπορεί να αποφύγει την ανοσολογική απόκριση εκφράζοντας καψικούς πολυσακχαρίτες (Wang et al., 2008). Αυτό μπορεί να εξηγήσει την αύξηση των Bacteroidetes που παρατηρήθηκε σε ποντίκια που εκτέθηκαν σε PPA. Αυτό συμπληρώνει την αυξημένη σύνθεση λιπαρών οξέων που παρατηρείται στο μικροβίωμα PPA. Τα βακτήρια χρησιμοποιούν την οδό FASIIko:K00647 (fabB) για την παραγωγή λιπαρών οξέων, τα οποία μπορεί να επηρεάσουν τις μεταβολικές οδούς του ξενιστή (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), και οι αλλαγές στον μεταβολισμό των λιπιδίων μπορεί να παίζουν ρόλο στη νευροανάπτυξη (Yu et al., 2020). Μια άλλη οδός που παρουσιάζει αυξημένη αφθονία σε δείγματα PPA ήταν η βιοσύνθεση στεροειδών ορμονών (ko:K12343). Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι υπάρχει μια αντίστροφη σχέση μεταξύ της ικανότητας του εντερικού μικροβιώματος να επηρεάζει τα επίπεδα ορμονών και να επηρεάζεται από τις ορμόνες, έτσι ώστε τα αυξημένα επίπεδα στεροειδών μπορεί να έχουν συνέπειες για την υγεία (Tetel et al., 2018).
Αυτή η μελέτη δεν είναι χωρίς περιορισμούς και σκέψεις. Μια σημαντική διάκριση είναι ότι δεν πραγματοποιήσαμε φυσιολογικές αξιολογήσεις των ζώων. Επομένως, δεν είναι δυνατόν να συμπεράνουμε άμεσα εάν οι αλλαγές στο μικροβίωμα σχετίζονται με κάποια ασθένεια. Μια άλλη παράμετρος είναι ότι τα ποντίκια σε αυτή τη μελέτη τρέφονταν με την ίδια διατροφή με τις μητέρες τους. Μελλοντικές μελέτες μπορεί να καθορίσουν εάν η μετάβαση από μια δίαιτα πλούσια σε PPA σε μια δίαιτα χωρίς PPA βελτιώνει τις επιδράσεις της στο μικροβίωμα. Ένας περιορισμός της μελέτης μας, όπως και πολλών άλλων, είναι το περιορισμένο μέγεθος του δείγματος. Αν και μπορούν να εξαχθούν έγκυρα συμπεράσματα, ένα μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος θα παρείχε μεγαλύτερη στατιστική ισχύ κατά την ανάλυση των αποτελεσμάτων. Είμαστε επίσης επιφυλακτικοί όσον αφορά την εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με μια συσχέτιση μεταξύ των αλλαγών στο μικροβίωμα του εντέρου και οποιασδήποτε ασθένειας (Yap et al., 2021). Παράγοντες σύγχυσης, όπως η ηλικία, το φύλο και η διατροφή, μπορούν να επηρεάσουν σημαντικά τη σύνθεση των μικροοργανισμών. Αυτοί οι παράγοντες μπορεί να εξηγήσουν τις ασυνέπειες που παρατηρούνται στη βιβλιογραφία σχετικά με τη συσχέτιση του μικροβιώματος του εντέρου με σύνθετες ασθένειες (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). Για παράδειγμα, έχει αποδειχθεί ότι τα μέλη του γένους Bacteroidetes είναι είτε αυξημένα είτε μειωμένα σε ζώα και ανθρώπους με ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Ομοίως, μελέτες για τη σύνθεση του εντέρου σε ασθενείς με φλεγμονώδεις παθήσεις του εντέρου έχουν βρει τόσο αυξήσεις όσο και μειώσεις στα ίδια taxa (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Για να περιορίσουμε τον αντίκτυπο της προκατάληψης λόγω φύλου, προσπαθήσαμε να διασφαλίσουμε την ισότιμη εκπροσώπηση των φύλων, έτσι ώστε οι διαφορές πιθανότατα να οφείλονται στη διατροφή. Μία πρόκληση της λειτουργικής σχολίασης είναι η αφαίρεση των περιττών αλληλουχιών γονιδίων. Η μέθοδος ομαδοποίησης γονιδίων που χρησιμοποιούμε απαιτεί 95% ταυτότητα αλληλουχίας και 85% ομοιότητα μήκους, καθώς και 90% κάλυψη ευθυγράμμισης για την εξάλειψη της ψευδούς ομαδοποίησης. Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις, παρατηρήσαμε COG με τις ίδιες σχολιασμούς (π.χ., MUT) (Εικ. 6). Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να προσδιοριστεί εάν αυτά τα ορθόλογα είναι διακριτά, σχετίζονται με συγκεκριμένα γένη ή εάν αυτό αποτελεί περιορισμό της προσέγγισης ομαδοποίησης γονιδίων. Ένας άλλος περιορισμός της λειτουργικής σχολίασης είναι η πιθανή λανθασμένη ταξινόμηση. Το βακτηριακό γονίδιο mmdA είναι ένα γνωστό ένζυμο που εμπλέκεται στη σύνθεση προπιονικού, αλλά το KEGG δεν το συνδέει με την μεταβολική οδό του προπιονικού. Αντίθετα, τα ορθόλογα scpB και mmcD σχετίζονται. Ο μεγάλος αριθμός γονιδίων χωρίς καθορισμένα knockouts μπορεί να οδηγήσει σε αδυναμία ταυτοποίησης γονιδίων που σχετίζονται με το PPA κατά την αξιολόγηση της αφθονίας γονιδίων. Οι μελλοντικές μελέτες θα επωφεληθούν από την ανάλυση μεταμεταγραφώματος, η οποία μπορεί να παρέχει μια βαθύτερη κατανόηση των λειτουργικών χαρακτηριστικών του μικροβιώματος του εντέρου και να συνδέσει την έκφραση γονιδίων με πιθανές κατάντη επιδράσεις. Για μελέτες που αφορούν συγκεκριμένες νευροαναπτυξιακές διαταραχές ή φλεγμονώδεις παθήσεις του εντέρου, απαιτούνται φυσιολογικές και συμπεριφορικές αξιολογήσεις των ζώων για τη σύνδεση των αλλαγών στη σύνθεση του μικροβιώματος με αυτές τις διαταραχές. Πρόσθετες μελέτες που μεταμοσχεύουν το μικροβίωμα του εντέρου σε ποντίκια χωρίς μικρόβια θα ήταν επίσης χρήσιμες για να προσδιοριστεί εάν το μικροβίωμα είναι ένας παράγοντας που οδηγεί ή ένα χαρακτηριστικό μιας ασθένειας.
Συνοπτικά, καταδείξαμε ότι το διαιτητικό PPA δρα ως παράγοντας μεταβολής της σύνθεσης του εντερικού μικροβιώματος. Το PPA είναι ένα συντηρητικό εγκεκριμένο από τον FDA που βρίσκεται ευρέως σε διάφορα τρόφιμα και, μετά από μακροχρόνια έκθεση, μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας. Διαπιστώσαμε αλλαγές στην αφθονία αρκετών βακτηρίων, γεγονός που υποδηλώνει ότι το PPA μπορεί να επηρεάσει τη σύνθεση του εντερικού μικροβιώματος. Οι αλλαγές στο μικροβίωμα μπορούν να οδηγήσουν σε αλλαγές στα επίπεδα ορισμένων μεταβολικών οδών, οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν σε φυσιολογικές αλλαγές που σχετίζονται με την υγεία του ξενιστή. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να προσδιοριστεί εάν οι επιδράσεις του διαιτητικού PPA στη μικροβιακή σύνθεση μπορούν να οδηγήσουν σε δυσβίωση ή άλλες ασθένειες. Αυτή η μελέτη θέτει τα θεμέλια για μελλοντικές μελέτες σχετικά με το πώς οι επιδράσεις του PPA στη σύνθεση του εντέρου μπορούν να επηρεάσουν την ανθρώπινη υγεία.
Τα σύνολα δεδομένων που παρουσιάζονται σε αυτήν τη μελέτη είναι διαθέσιμα σε ηλεκτρονικά αποθετήρια. Το όνομα και ο αριθμός πρόσβασης του αποθετηρίου είναι: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Αυτή η μελέτη σε ζώα εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Θεσμικών Ζώων του Πανεπιστημίου της Κεντρικής Φλόριντα (UCF-IACUC) (Αριθμός Άδειας Χρήσης Ζώων: PROTO202000002). Η παρούσα μελέτη συμμορφώνεται με τους τοπικούς νόμους, κανονισμούς και τις θεσμικές απαιτήσεις.
Γενική Επιστήμη (NG): Σύλληψη Σύλληψης, Επιμέλεια Δεδομένων, Τυπική Ανάλυση, Διερεύνηση, Μεθοδολογία, Λογισμικό, Οπτικοποίηση, Συγγραφή (πρωτότυπο προσχέδιο), Συγγραφή (ανασκόπηση & επεξεργασία). LA: Σύλληψη Σύλληψης, Επιμέλεια Δεδομένων, Μεθοδολογία, Πόροι, Συγγραφή (ανασκόπηση & επεξεργασία). SH: Τυπική Ανάλυση, Λογισμικό, Συγγραφή (ανασκόπηση & επεξεργασία). SA: Διερεύνηση, Συγγραφή (ανασκόπηση & επεξεργασία). Chief Judge: Διερεύνηση, Συγγραφή (ανασκόπηση & επεξεργασία). SN: Σύλληψη Σύλληψης, Διαχείριση Έργου, Πόροι, Επίβλεψη, Συγγραφή (ανασκόπηση & επεξεργασία). TA: Σύλληψη Σύλληψης, Διαχείριση Έργου, Επίβλεψη, Συγγραφή (ανασκόπηση & επεξεργασία).
Οι συγγραφείς δήλωσαν ότι δεν έλαβαν καμία οικονομική υποστήριξη για την έρευνα, τη συγγραφή ή/και τη δημοσίευση αυτού του άρθρου.
Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη ελλείψει οποιωνδήποτε εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων. Δεν ισχύει.
Όλες οι απόψεις που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αποκλειστικά των συγγραφέων και δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα τις απόψεις των ιδρυμάτων, των εκδοτών, των συντακτών ή των κριτικών τους. Οποιαδήποτε προϊόντα αξιολογούνται σε αυτό το άρθρο ή οποιοιδήποτε ισχυρισμοί των κατασκευαστών τους δεν είναι εγγυημένα ούτε υποστηρίζονται από τον εκδότη.
Συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο μπορείτε να βρείτε στο διαδίκτυο: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Το προπιονικό οξύ προκαλεί γλοίωση και νευροφλεγμονή ρυθμίζοντας την οδό PTEN/AKT σε διαταραχές του φάσματος του αυτισμού. Επιστημονικές αναφορές 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Στατιστική ανάλυση δεδομένων σύνθεσης. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Η αναλογία Firmicutes/Bacteroidetes ως παράγοντας κινδύνου για καρκίνο του μαστού. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Ανάλυση διαφορικής έκφρασης δεδομένων καταμέτρησης αλληλουχιών. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Μικροβίωμα κοπράνων και μεταβολισμός σε παιδιά με αυτισμό και διάχυτη αναπτυξιακή διαταραχή που δεν προσδιορίζεται διαφορετικά. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Βακτηριακά νευρομεταβολικά χαρακτηριστικά της εντερικής μικροχλωρίδας σε μικρά παιδιά με διαταραχές του φάσματος του αυτισμού. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Το μικροβίωμα ως ανθρώπινο όργανο. Κλινική Μικροβιολογία και Λοιμώξεις 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Νέες γνώσεις σχετικά με τη φυσιολογία των βακτηρίων που παράγουν προπιονικό οξύ: Anaerotignum propionicum και Anaerotignum neopropionicum (πρώην Clostridium propionicum και Clostridium neopropionicum). Μικροοργανισμοί 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Μητρική διατροφή και ανάπτυξη εμβρύου. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., και Hochberg, J. (1995). Έλεγχος του ποσοστού ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων: Μια πρακτική και αποτελεσματική προσέγγιση στις πολλαπλές εξετάσεις. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Ώρα δημοσίευσης: 18 Απριλίου 2025