Οι ανοσοτροποποιητικοί μεταβολίτες αποτελούν βασικό χαρακτηριστικό του μικροπεριβάλλοντος του όγκου (TME), αλλά με λίγες εξαιρέσεις, η ταυτότητά τους παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Εδώ, αναλύσαμε όγκους και Τ κύτταρα από τους όγκους και τον ασκίτη ασθενών με υψηλού βαθμού ορώδες καρκίνωμα (HGSC) για να αποκαλύψουμε το μεταβολικό σύνολο αυτών των διαφορετικών διαμερισμάτων TME. Ο ασκίτης και τα καρκινικά κύτταρα έχουν εκτεταμένες διαφορές μεταβολιτών. Σε σύγκριση με τον ασκίτη, τα Τ κύτταρα που διηθούν τον όγκο είναι σημαντικά εμπλουτισμένα σε 1-μεθυλονικοτιναμίδιο (MNA). Αν και το επίπεδο MNA στα Τ κύτταρα είναι αυξημένο, η έκφραση της νικοτιναμιδικής Ν-μεθυλοτρανσφεράσης (ένα ένζυμο που καταλύει τη μεταφορά μεθυλομάδων από την S-αδενοσυλομεθειονίνη στο νικοτιναμίδιο) περιορίζεται στους ινοβλάστες και τα καρκινικά κύτταρα. Λειτουργικά, η MNA προκαλεί τα Τ κύτταρα να εκκρίνουν την κυτοκίνη παράγοντα νέκρωσης όγκου άλφα, η οποία προάγει τον όγκο. Επομένως, η MNA που προέρχεται από TME συμβάλλει στην ανοσολογική ρύθμιση των Τ κυττάρων και αντιπροσωπεύει έναν πιθανό στόχο ανοσοθεραπείας για τη θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου.
Οι μεταβολίτες που προέρχονται από όγκους μπορούν να έχουν μια βαθιά ανασταλτική επίδραση στην αντικαρκινική ανοσία και όλο και περισσότερα στοιχεία δείχνουν ότι μπορούν επίσης να χρησιμεύσουν ως βασική κινητήρια δύναμη για την εξέλιξη της νόσου (1). Εκτός από το φαινόμενο Warburg, πρόσφατη εργασία έχει αρχίσει να χαρακτηρίζει την μεταβολική κατάσταση των καρκινικών κυττάρων και τη σχέση της με την ανοσολογική κατάσταση του μικροπεριβάλλοντος του όγκου (TME). Μελέτες σε μοντέλα ποντικών και ανθρώπινα Τ κύτταρα έχουν δείξει ότι ο μεταβολισμός της γλουταμίνης (2), ο οξειδωτικός μεταβολισμός (3) και ο μεταβολισμός της γλυκόζης (4) μπορούν να δράσουν ανεξάρτητα σε διάφορες υποομάδες ανοσοκυττάρων. Αρκετοί μεταβολίτες σε αυτές τις οδούς αναστέλλουν την αντικαρκινική λειτουργία των Τ κυττάρων. Έχει αποδειχθεί ότι ο αποκλεισμός του συνενζύμου τετραϋδροβιοπτερίνη (BH4) μπορεί να βλάψει τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων και η αύξηση της BH4 στο σώμα μπορεί να ενισχύσει την αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση που προκαλείται από τα CD4 και CD8. Επιπλέον, η ανοσοκατασταλτική δράση της κυνουρενίνης μπορεί να ανακουφιστεί με τη χορήγηση BH4 (5). Στο μεταλλαγμένο γλοιοβλάστωμα της ισοκιτρικής αφυδρογονάσης (IDH), η έκκριση εναντιομεταβολικού (R)-2-υδροξυγλουταρικού (R-2-HG) αναστέλλει την ενεργοποίηση, τον πολλαπλασιασμό και την κυτταρόλυση των Τ κυττάρων (6). Πρόσφατα, έχει αποδειχθεί ότι η μεθυλογλυοξάλη, ένα υποπροϊόν της γλυκόλυσης, παράγεται από κατασταλτικά κύτταρα μυελοειδούς προέλευσης και η μεταφορά μεθυλογλυοξάλης από τα Τ κύτταρα μπορεί να αναστείλει τη λειτουργία των τελεστικών Τ κυττάρων. Στη θεραπεία, η εξουδετέρωση της μεθυλογλυοξάλης μπορεί να υπερνικήσει τη δραστηριότητα των μυελοειδών κατασταλτικών κυττάρων (MDSC) και να ενισχύσει συνεργιστικά τη θεραπεία αποκλεισμού σημείων ελέγχου σε μοντέλα ποντικών (7). Αυτές οι μελέτες συλλογικά τονίζουν τον βασικό ρόλο των μεταβολιτών που προέρχονται από TME στη ρύθμιση της λειτουργίας και της δραστηριότητας των Τ κυττάρων.
Η δυσλειτουργία των Τ κυττάρων έχει αναφερθεί ευρέως στον καρκίνο των ωοθηκών (8). Αυτό οφείλεται εν μέρει στα μεταβολικά χαρακτηριστικά που είναι εγγενή στην υποξία και την ανώμαλη αγγείωση του όγκου (9), η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή της γλυκόζης και της τρυπτοφάνης σε υποπροϊόντα όπως το γαλακτικό οξύ και η κυνουρενίνη. Η υπερβολική εξωκυτταρική γαλακτική μειώνει την παραγωγή ιντερφερόνης-γ (IFN-γ) και οδηγεί στη διαφοροποίηση των μυελοκατασταλτικών υποομάδων (10, 11). Η κατανάλωση τρυπτοφάνης αναστέλλει άμεσα τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων και αναστέλλει την σηματοδότηση των υποδοχέων των Τ κυττάρων (12-14). Παρά τις παρατηρήσεις αυτές, πολλή εργασία γύρω από τον ανοσοποιητικό μεταβολισμό πραγματοποιήθηκε σε in vitro καλλιέργεια Τ κυττάρων χρησιμοποιώντας βελτιστοποιημένα μέσα ή περιορίστηκε σε ομόλογα μοντέλα ποντικών in vivo, κανένα από τα οποία δεν αντανακλά πλήρως την ετερογένεια των ανθρώπινων καρκίνων και του φυσιολογικού μακρο και μικροπεριβάλλοντος.
Ένα κοινό χαρακτηριστικό του καρκίνου των ωοθηκών είναι η περιτοναϊκή εξάπλωση και η εμφάνιση ασκίτη. Η συσσώρευση κυτταρικού υγρού στον ασκίτη σχετίζεται με προχωρημένη νόσο και κακή πρόγνωση (15). Σύμφωνα με αναφορές, αυτό το μοναδικό διαμέρισμα είναι υποξικό, έχει υψηλά επίπεδα αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και ινδολαμινικής 2,3-διοξυγενάσης (IDO) και διηθείται από Τ ρυθμιστικά κύτταρα και μυελοειδή ανασταλτικά κύτταρα (15-18). Το μεταβολικό περιβάλλον του ασκίτη μπορεί να είναι διαφορετικό από αυτό του ίδιου του όγκου, επομένως ο επαναπρογραμματισμός των Τ κυττάρων στον περιτοναϊκό χώρο είναι ασαφής. Επιπλέον, οι βασικές διαφορές και η ετερογένεια μεταξύ ασκίτη και μεταβολιτών που υπάρχουν στο περιβάλλον του όγκου μπορεί να εμποδίζουν τη διείσδυση ανοσοκυττάρων και τη λειτουργία τους στους όγκους και απαιτείται περαιτέρω έρευνα.
Για να λύσουμε αυτά τα προβλήματα, σχεδιάσαμε μια ευαίσθητη μέθοδο διαχωρισμού κυττάρων και υγρής χρωματογραφίας, φασματομετρίας μάζας σε σειρά (LC-MS/MS), για να μελετήσουμε διαφορετικούς τύπους κυττάρων (συμπεριλαμβανομένων των CD4 + και CD8 + Τ κυττάρων), καθώς και εντός και μεταξύ όγκων. Οι μεταβολίτες της εκτείνονται σε κύτταρα στο ίδιο ασκιτικό και καρκινικό περιβάλλον του ασθενούς. Χρησιμοποιούμε αυτήν τη μέθοδο σε συνδυασμό με κυτταρομετρία ροής υψηλής διάστασης και αλληλούχιση RNA ενός κυττάρου (scRNA-seq) για να παρέχουμε ένα υψηλής ανάλυσης πορτρέτο της μεταβολικής κατάστασης αυτών των βασικών πληθυσμών. Αυτή η μέθοδος αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση στο επίπεδο του 1-μεθυλονικοτιναμιδίου (MNA) στα Τ κύτταρα του όγκου, και τα πειράματα in vitro έδειξαν ότι η ανοσοτροποποιητική επίδραση του MNA στη λειτουργία των Τ κυττάρων ήταν προηγουμένως άγνωστη. Γενικά, αυτή η μέθοδος αποκαλύπτει τις αμοιβαίες μεταβολικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ όγκων και ανοσοκυττάρων και παρέχει μοναδικές πληροφορίες για τους μεταβολίτες της ανοσολογικής ρύθμισης, οι οποίες μπορεί να είναι χρήσιμες για τη θεραπεία της ανοσοθεραπείας του καρκίνου των ωοθηκών με βάση τα Τ κύτταρα. Ευκαιρίες θεραπείας.
Χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής υψηλής διάστασης για να ποσοτικοποιήσουμε ταυτόχρονα την πρόσληψη γλυκόζης [2-(N-(7-νιτροφαινυλ-2-οξα-1,3-διαζα-4-υλ)αμινο)-2-δεοξυγλυκόζη (2-NBDG) και τη μιτοχονδριακή δραστηριότητα [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) που είναι τυπικοί δείκτες που διακρίνουν τα ανοσοκύτταρα από τους πληθυσμούς των καρκινικών κυττάρων (Πίνακας S2 και Σχήμα S1A). Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι σε σύγκριση με τα Τ κύτταρα, ο ασκίτης και τα καρκινικά κύτταρα έχουν υψηλότερα επίπεδα πρόσληψης γλυκόζης, αλλά έχουν μικρότερες διαφορές στη μιτοχονδριακή δραστηριότητα. Η μέση πρόσληψη γλυκόζης από τα καρκινικά κύτταρα [CD45-EpCAM (EpCAM)+] είναι τρεις έως τέσσερις φορές μεγαλύτερη από αυτή των Τ κυττάρων, και η μέση πρόσληψη γλυκόζης από τα CD4+ Τ κύτταρα είναι 1,2 φορές μεγαλύτερη από αυτή των CD8+ Τ κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα διηθητικά λεμφοκύτταρα του όγκου (TIL) έχουν διαφορετικές μεταβολικές απαιτήσεις ακόμη και στην ίδια TME (Σχήμα 1Α). Αντίθετα, η μιτοχονδριακή δραστηριότητα στα καρκινικά κύτταρα είναι παρόμοια με αυτή των CD4 + Τ κυττάρων, και η μιτοχονδριακή δραστηριότητα και των δύο κυτταρικών τύπων είναι υψηλότερη από αυτή των CD8 + Τ κυττάρων (Σχήμα 1Β). Γενικά, αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν το μεταβολικό επίπεδο. Η μεταβολική δραστηριότητα των καρκινικών κυττάρων είναι υψηλότερη από αυτή των CD4 + Τ κυττάρων, και η μεταβολική δραστηριότητα των CD4 + Τ κυττάρων είναι υψηλότερη από αυτή των CD8 + Τ κυττάρων. Παρά αυτές τις επιδράσεις μεταξύ των κυτταρικών τύπων, δεν υπάρχει συνεπής διαφορά στην μεταβολική κατάσταση των CD4 + και CD8 + Τ κυττάρων ή στις σχετικές αναλογίες τους στον ασκίτη σε σύγκριση με τους όγκους (Σχήμα 1Γ). Αντίθετα, στο κλάσμα των CD45-κυττάρων, η αναλογία των EpCAM+ κυττάρων στον όγκο αυξήθηκε σε σύγκριση με τον ασκίτη (Σχήμα 1Δ). Παρατηρήσαμε επίσης μια σαφή μεταβολική διαφορά μεταξύ των συστατικών των κυττάρων EpCAM+ και EpCAM-. Τα κύτταρα EpCAM+ (όγκου) έχουν υψηλότερη πρόσληψη γλυκόζης και μιτοχονδριακή δραστηριότητα από τα κύτταρα EpCAM-, η οποία είναι πολύ υψηλότερη από τη μεταβολική δραστηριότητα των ινοβλαστών σε καρκινικά κύτταρα σε TME (Σχήμα 1, Ε και ΣΤ).
(A και B) Διάμεση ένταση φθορισμού (MFI) πρόσληψης γλυκόζης (2-NBDG) (A) και μιτοχονδριακή δραστηριότητα των CD4 + Τ κυττάρων (MitoTracker σκούρο κόκκινο) (B) Αντιπροσωπευτικά γραφήματα (αριστερά) και δεδομένα σε πίνακες (Δεξιά), CD8 + Τ κύτταρα και EpCAM + CD45-καρκινικά κύτταρα από ασκίτη και όγκο. (C) Η αναλογία των CD4 + και CD8 + κυττάρων (των CD3 + Τ κυττάρων) σε ασκίτη και όγκο. (D) Ποσοστό των EpCAM + καρκινικών κυττάρων σε ασκίτη και όγκο (CD45−). (E και F) EpCAM + CD45-όγκος και πρόσληψη γλυκόζης από μήτρα EpCAM-CD45 (2-NBDG) (E) και μιτοχονδριακή δραστηριότητα (MitoTracker σκούρο κόκκινο) (F) αντιπροσωπευτικά γραφήματα (αριστερά) και δεδομένα σε πίνακες (Δεξιά) Ασκίτες και καρκινικά κύτταρα. (G) Αντιπροσωπευτικά γραφήματα έκφρασης CD25, CD137 και PD1 με κυτταρομετρία ροής. (H και I) Έκφραση CD25, CD137 και PD1 σε CD4 + Τ κύτταρα (H) και CD8 + Τ κύτταρα (I). (J και K) Φαινότυποι αφελούς, κεντρικής μνήμης (Tcm), τελεστή (Teff) και τελεστή μνήμης (Tem) με βάση την έκφραση των CCR7 και CD45RO. Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερά) και δεδομένα πίνακα (δεξιά) CD4 + Τ κυττάρων (J) και CD8 + Τ κυττάρων (K) σε ασκίτη και όγκους. Οι τιμές P ​​προσδιορίστηκαν με ζευγαρωμένο t-test (*P<0,05, **P<0,01 και ***P<0,001). Η γραμμή αντιπροσωπεύει τους αντίστοιχους ασθενείς (n = 6). FMO, φθορισμός μείον ένα. MFI, διάμεση ένταση φθορισμού.
Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε άλλες σημαντικές διαφορές μεταξύ της φαινοτυπικής κατάστασης των Τ κυττάρων με υψηλή ανάλυση. Η ενεργοποιημένη (Σχήμα 1, G έως I) και η ενεργοποιημένη μνήμη (Σχήμα 1, J και K) σε όγκους είναι πολύ πιο συχνές από τον ασκίτη (ποσοστό CD3 + Τ κυττάρων). Ομοίως, η ανάλυση του φαινοτύπου με βάση την έκφραση δεικτών ενεργοποίησης (CD25 και CD137) και δεικτών εξάντλησης [πρωτεΐνη προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου 1 (PD1)] έδειξε ότι, αν και τα μεταβολικά χαρακτηριστικά αυτών των πληθυσμών είναι διαφορετικά (Σχήμα S1, B έως E), δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολικές διαφορές μεταξύ υποσυνόλων αφελών, ενεργών ή μνήμης (Σχήμα S1, F έως I). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με τη χρήση μεθόδων μηχανικής μάθησης για την αυτόματη αντιστοίχιση κυτταρικών φαινοτύπων (21), οι οποίες αποκάλυψαν περαιτέρω την παρουσία μεγάλου αριθμού κυττάρων μυελού των οστών (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) στον ασκίτη του ασθενούς (Σχήμα S2A). Μεταξύ όλων των ταυτοποιημένων κυτταρικών τύπων, αυτός ο πληθυσμός μυελοειδών κυττάρων εμφάνισε την υψηλότερη πρόσληψη γλυκόζης και μιτοχονδριακή δραστηριότητα (Σχήμα S2, B έως G). Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τις ισχυρές μεταβολικές διαφορές μεταξύ των πολλαπλών κυτταρικών τύπων που εντοπίζονται σε ασκίτη και όγκους σε ασθενείς με HGSC.
Η κύρια πρόκληση στην κατανόηση των μεταβιονομικών χαρακτηριστικών της TIL είναι η ανάγκη απομόνωσης δειγμάτων Τ κυττάρων επαρκούς καθαρότητας, ποιότητας και ποσότητας από όγκους. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι μέθοδοι διαλογής και εμπλουτισμού με σφαιρίδια που βασίζονται στην κυτταρομετρία ροής μπορούν να οδηγήσουν σε αλλαγές στα προφίλ των κυτταρικών μεταβολιτών (22-24). Για να ξεπεράσουμε αυτό το πρόβλημα, βελτιστοποιήσαμε τη μέθοδο εμπλουτισμού με σφαιρίδια για την απομόνωση και απομόνωση TIL από χειρουργικά αφαιρεμένο καρκίνο των ωοθηκών στον άνθρωπο πριν από την ανάλυση με LC-MS/MS (βλ. Υλικά και Μέθοδοι· Σχήμα 2Α). Προκειμένου να αξιολογήσουμε τη συνολική επίδραση αυτού του πρωτοκόλλου στις αλλαγές των μεταβολιτών, συγκρίναμε τα προφίλ μεταβολιτών των Τ κυττάρων που ενεργοποιήθηκαν από υγιείς δότες μετά το παραπάνω βήμα διαχωρισμού των σφαιριδίων με κύτταρα που δεν διαχωρίστηκαν με σφαιρίδια αλλά παρέμειναν στον πάγο. Αυτή η ανάλυση ποιοτικού ελέγχου διαπίστωσε ότι υπάρχει υψηλή συσχέτιση μεταξύ αυτών των δύο συνθηκών (r = 0,77) και η τεχνική επαναληψιμότητα της ομάδας των 86 μεταβολιτών έχει υψηλή επαναληψιμότητα (Σχήμα 2Β). Επομένως, αυτές οι μέθοδοι μπορούν να εκτελέσουν ακριβή ανάλυση μεταβολιτών σε κύτταρα που υποβάλλονται σε εμπλουτισμό κυτταρικού τύπου, παρέχοντας έτσι την πρώτη πλατφόρμα υψηλής ανάλυσης για την αναγνώριση συγκεκριμένων μεταβολιτών στο HGSC, επιτρέποντας έτσι στους ανθρώπους να αποκτήσουν μια βαθύτερη κατανόηση της κυτταρικής εξειδίκευσης στο πρόγραμμα σεξουαλικού μεταβολισμού.
(Α) Σχηματικό διάγραμμα εμπλουτισμού με μαγνητικά σφαιρίδια. Πριν από την ανάλυση με LC-MS/MS, τα κύτταρα θα υποβληθούν σε τρεις διαδοχικούς γύρους εμπλουτισμού με μαγνητικά σφαιρίδια ή θα παραμείνουν σε πάγο. (Β) Η επίδραση του τύπου εμπλουτισμού στην αφθονία των μεταβολιτών. Ο μέσος όρος τριών μετρήσεων για κάθε τύπο εμπλουτισμού ± SE. Η γκρίζα γραμμή αντιπροσωπεύει μια σχέση 1:1. Η ενδοκλασική συσχέτιση (ICC) επαναλαμβανόμενων μετρήσεων που φαίνεται στην ετικέτα του άξονα. NAD, νικοτιναμίδιο αδενίνη δινουκλεοτίδιο. (Γ) Σχηματικό διάγραμμα της ροής εργασίας της ανάλυσης μεταβολιτών ασθενών. Ασκίτες ή όγκοι συλλέγονται από ασθενείς και κρυοσυντηρούνται. Ένα μικρό μέρος κάθε δείγματος αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής, ενώ τα υπόλοιπα δείγματα υποβλήθηκαν σε τρεις γύρους εμπλουτισμού για κύτταρα CD4+, CD8+ και CD45-. Αυτά τα κλάσματα κυττάρων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας LC-MS/MS. (Δ) Θερμικός χάρτης τυποποιημένης αφθονίας μεταβολιτών. Το δενδρογράφημα αντιπροσωπεύει την ομαδοποίηση του Ward των Ευκλείδειων αποστάσεων μεταξύ των δειγμάτων. (Ε) Ανάλυση κύριων συστατικών (PCA) του χάρτη μεταβολιτών του δείγματος, που δείχνει τρία αντίγραφα κάθε δείγματος, δείγματα από τον ίδιο ασθενή συνδέονται με μια γραμμή. (ΣΤ) Η PCA του προφίλ μεταβολιτών του δείγματος που εξαρτάται από τον ασθενή (δηλαδή, χρησιμοποιώντας μερικό πλεονασμό). ο τύπος δείγματος περιορίζεται από το κυρτό περίβλημα. PC1, κύριο συστατικό 1· PC2, κύριο συστατικό 2.
Στη συνέχεια, εφαρμόσαμε αυτήν τη μέθοδο εμπλουτισμού για να αναλύσουμε 99 μεταβολίτες στα κλάσματα κυττάρων CD4+, CD8+ και CD45 στον πρωτοπαθή ασκίτη και τους όγκους έξι ασθενών με HGSC (Σχήμα 2C, Σχήμα S3A και Πίνακας S3 και S4). Ο πληθυσμός ενδιαφέροντος αντιπροσωπεύει το 2% έως 70% του αρχικού μεγάλου δείγματος ζωντανών κυττάρων και η αναλογία των κυττάρων ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των ασθενών. Μετά τον διαχωρισμό των σφαιριδίων, το εμπλουτισμένο κλάσμα ενδιαφέροντος (CD4+, CD8+ ή CD45-) αντιπροσωπεύει κατά μέσο όρο περισσότερο από το 85% όλων των ζωντανών κυττάρων στο δείγμα. Αυτή η μέθοδος εμπλουτισμού μας επιτρέπει να αναλύσουμε κυτταρικούς πληθυσμούς από τον μεταβολισμό των ιστών ανθρώπινου όγκου, κάτι που είναι αδύνατο να γίνει από μεγάλα δείγματα. Χρησιμοποιώντας αυτό το πρωτόκολλο, προσδιορίσαμε ότι η l-κυνουρενίνη και η αδενοσίνη, αυτοί οι δύο καλά χαρακτηρισμένοι ανοσοκατασταλτικοί μεταβολίτες, ήταν αυξημένοι σε καρκινικά Τ κύτταρα ή καρκινικά κύτταρα (Σχήμα S3, Β και C). Επομένως, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν την πιστότητα και την ικανότητα της τεχνολογίας διαχωρισμού κυττάρων και φασματομετρίας μάζας να βρίσκει βιολογικά σημαντικούς μεταβολίτες στους ιστούς των ασθενών.
Η ανάλυσή μας αποκάλυψε επίσης έναν ισχυρό μεταβολικό διαχωρισμό των κυτταρικών τύπων εντός και μεταξύ των ασθενών (Σχήμα 2D και Σχήμα S4A). Συγκεκριμένα, σε σύγκριση με άλλους ασθενείς, ο ασθενής 70 εμφάνισε διαφορετικά μεταβολικά χαρακτηριστικά (Σχήμα 2E και Σχήμα S4B), υποδεικνύοντας ότι μπορεί να υπάρχει σημαντική μεταβολική ετερογένεια μεταξύ των ασθενών. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε σύγκριση με άλλους ασθενείς (1,2 έως 2 λίτρα· Πίνακας S1), η συνολική ποσότητα ασκίτη που συλλέχθηκε στον ασθενή 70 (80 ml) ήταν μικρότερη. Ο έλεγχος της ετερογένειας μεταξύ των ασθενών κατά την ανάλυση κύριων συστατικών (για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας ανάλυση μερικής πλεονασματικότητας) δείχνει συνεπείς αλλαγές μεταξύ των κυτταρικών τύπων και οι κυτταρικοί τύποι ή/και το μικροπεριβάλλον είναι σαφώς συγκεντρωτικά σύμφωνα με το προφίλ μεταβολιτών (Σχήμα 2F). Η ανάλυση των μεμονωμένων μεταβολιτών τόνισε αυτές τις επιδράσεις και αποκάλυψε σημαντικές διαφορές μεταξύ των κυτταρικών τύπων και του μικροπεριβάλλοντος. Αξίζει να σημειωθεί ότι η πιο ακραία διαφορά που παρατηρήθηκε είναι η MNA, η οποία συνήθως είναι εμπλουτισμένη σε κύτταρα CD45- και σε κύτταρα CD4+ και CD8+ που διεισδύουν στον όγκο (Σχήμα 3Α). Για τα κύτταρα CD4+, αυτή η επίδραση είναι πιο εμφανής, και η MNA στα κύτταρα CD8+ φαίνεται επίσης να επηρεάζεται έντονα από το περιβάλλον. Ωστόσο, αυτό δεν είναι σημαντικό, επειδή μόνο τρεις από τους έξι ασθενείς μπορούν να αξιολογηθούν για βαθμολογίες CD8+ όγκου. Εκτός από την MNA, σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων σε ασκίτη και όγκους, άλλοι μεταβολίτες που δεν χαρακτηρίζονται επαρκώς σε TIL είναι επίσης διαφορικά πλούσιοι (Σχήματα S3 και S4). Επομένως, αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ένα πολλά υποσχόμενο σύνολο ανοσοτροποποιητικών μεταβολιτών για περαιτέρω έρευνα.
(Α) Κανονικοποιημένη περιεκτικότητα MNA σε κύτταρα CD4+, CD8+ και CD45- από ασκίτη και όγκο. Το διάγραμμα πλαισίου δείχνει τη διάμεση τιμή (γραμμή), το διατεταρτημοριακό εύρος (άρθρωση πλαισίου) και το εύρος δεδομένων, έως και 1,5 φορές το διατεταρτημοριακό εύρος (μουστάκι πλαισίου). Όπως περιγράφεται στο Υλικό και Μέθοδοι Ασθενούς, χρησιμοποιήστε την τιμή limma του ασθενούς για να προσδιορίσετε την τιμή P (*P<0,05 και **P<0,01). (Β) Σχηματικό διάγραμμα του μεταβολισμού του MNA (60). Μεταβολίτες: S-αδενοσυλο-1-μεθειονίνη· SAH, S-αδενοσίνη-1-ομοκυστεΐνη· NA, νικοτιναμίδιο· MNA, 1-μεθυλονικοτιναμίδιο· 2-PY, 1-μεθυλο-2-πυριδόνη-5-καρβοξαμίδιο· 4-PY, 1-μεθυλο-4-πυριδόνη-5-καρβοξαμίδιο· NR, νικοτιναμιδική ριβόζη· NMN, νικοτιναμιδικό μονονουκλεοτίδιο. Ένζυμα (πράσινο): NNMT, νικοτιναμιδική Ν-μεθυλοτρανσφεράση· SIRT, σιρτουίνες· NAMPT, νικοτιναμιδική φωσφοριβοσυλτρανσφεράση· AOX1, αλδεϋδική οξειδάση 1· NRK, νικοτιναμιδική ριβοζιτική κινάση· NMNAT, μονονουκλεοτιδική αδενυλική τρανσφεράση νικοτιναμιδίου· Pnp1, πουρινική νουκλεοζιτική φωσφορυλάση. (C) t-SNE της scRNA-seq ασκίτη (γκρι) και όγκου (κόκκινο· n = 3 ασθενείς). (D) Έκφραση NNMT σε διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς που αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας scRNA-seq. (E) Έκφραση NNMT και AOX1 σε SK-OV-3, ανθρώπινο εμβρυϊκό νεφρό (HEK) 293T, Τ κύτταρα και Τ κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με MNA. Η διπλωμένη έκφραση φαίνεται σε σχέση με την SK-OV-3. Φαίνεται το πρότυπο έκφρασης με SEM (n = 6 υγιείς δότες). Τιμές Ct μεγαλύτερες από 35 θεωρούνται μη ανιχνεύσιμες (UD). (F) Έκφραση των SLC22A1 και SLC22A2 σε SK-OV-3, HEK293T, Τ κύτταρα και Τ κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 8mM MNA. Η διπλωμένη έκφραση εμφανίζεται σε σχέση με το SK-OV-3. Εμφανίζεται το πρότυπο έκφρασης με SEM (n = 6 υγιείς δότες). Οι τιμές Ct μεγαλύτερες από 35 θεωρούνται μη ανιχνεύσιμες (UD). (G) Περιεκτικότητα σε MNA κυττάρων σε ενεργοποιημένα υγιή Τ κύτταρα δότη μετά από 72 ώρες επώασης με MNA. Εμφανίζεται το πρότυπο έκφρασης με SEM (n = 4 υγιείς δότες).
Το MNA παράγεται με μεταφορά της μεθυλομάδας από την S-αδενοσυλο-1-μεθειονίνη (SAM) σε νικοτιναμίδιο (NA) από την νικοτιναμιδική Ν-μεθυλοτρανσφεράση (NNMT· Σχήμα 3Β). Το NNMT υπερεκφράζεται σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων και σχετίζεται με πολλαπλασιασμό, εισβολή και μετάσταση (25-27). Για να κατανοήσουμε καλύτερα την πηγή του MNA στα Τ κύτταρα σε TME, χρησιμοποιήσαμε scRNA-seq για να χαρακτηρίσουμε την έκφραση του NNMT σε διάφορους κυτταρικούς τύπους στον ασκίτη και τους όγκους τριών ασθενών με HGSC (Πίνακας S5). Η ανάλυση περίπου 6.500 κυττάρων έδειξε ότι σε ασκίτη και περιβάλλοντα όγκων, η έκφραση του NNMT περιορίστηκε στους υποτιθέμενους πληθυσμούς ινοβλαστών και καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 3, C και D). Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχει εμφανής έκφραση NNMT σε κανέναν πληθυσμό που εκφράζει PTPRC (CD45 +) (Σχήμα 3D και Σχήμα S5A), γεγονός που υποδηλώνει ότι το MNA που ανιχνεύεται στο φάσμα μεταβολιτών έχει εισαχθεί στα Τ κύτταρα. Η έκφραση της αλδεϋδοοξειδάσης 1 (AOX1) μετατρέπει το MNA σε 1-μεθυλο-2-πυριδόνη-5-καρβοξαμίδιο (2-PYR) ή 1-μεθυλο-4-πυριδόνη-5-καρβοξαμίδιο (4-PYR). Το Σχήμα 3Β περιορίζεται επίσης στον πληθυσμό των ινοβλαστών που εκφράζουν COL1A1 (Σχήμα S5A), τα οποία συνολικά υποδεικνύουν ότι τα Τ κύτταρα δεν έχουν την ικανότητα του συμβατικού μεταβολισμού του MNA. Το πρότυπο έκφρασης αυτών των γονιδίων που σχετίζονται με το MNA επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας ένα δεύτερο ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων κυττάρων από ασκίτη από ασθενείς με HGSC (Σχήμα S5B· n = 6) (16). Επιπλέον, η ποσοτική ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR) υγιών Τ κυττάρων δότη που έλαβαν MNA έδειξε ότι σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SK-OV-3 ωοθηκικού όγκου, το NNMT ή το AOX1 σχεδόν δεν εκφράζονταν (Σχήμα 3Ε). Αυτά τα απροσδόκητα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το MNA μπορεί να εκκρίνεται από ινοβλάστες ή όγκους σε γειτονικά Τ κύτταρα σε TME.
Παρόλο που οι υποψήφιοι περιλαμβάνουν την οικογένεια των οργανικών μεταφορέων κατιόντων 1 έως 3 (OCT1, OCT2 και OCT3) που κωδικοποιούνται από την οικογένεια διαλυτών φορέων 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 και SLC22A3), οι πιθανοί μεταφορείς του MNA εξακολουθούν να μην έχουν προσδιοριστεί (28). Η QPCR του mRNA από υγιή Τ κύτταρα δότη έδειξε χαμηλά επίπεδα έκφρασης του SLC22A1 αλλά μη ανιχνεύσιμα επίπεδα του SLC22A2, γεγονός που επιβεβαίωσε ότι είχε αναφερθεί προηγουμένως στη βιβλιογραφία (Σχήμα 3F) (29). Αντίθετα, η κυτταρική σειρά όγκων ωοθηκών SK-OV-3 εξέφρασε υψηλά επίπεδα και των δύο μεταφορέων (Σχήμα 3F).
Προκειμένου να ελεγχθεί η πιθανότητα τα Τ κύτταρα να έχουν την ικανότητα να απορροφούν ξένο MNA, υγιή Τ κύτταρα-δότες καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων MNA. Ελλείψει εξωγενούς MNA, η κυτταρική περιεκτικότητα σε MNA δεν μπορεί να ανιχνευθεί (Σχήμα 3G). Ωστόσο, τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με εξωγενές MNA έδειξαν μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην περιεκτικότητα σε MNA στα κύτταρα, έως και 6 mM MNA (Σχήμα 3G). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι παρά το χαμηλό επίπεδο έκφρασης μεταφορέα και την έλλειψη του κύριου ενζύμου που είναι υπεύθυνο για τον ενδοκυτταρικό μεταβολισμό του MNA, το TIL μπορεί ακόμα να προσλάβει MNA.
Το φάσμα των μεταβολιτών στα Τ κύτταρα των ασθενών και τα πειράματα απορρόφησης MNA in vitro αυξάνουν την πιθανότητα οι ινοβλάστες που σχετίζονται με τον καρκίνο (CAF) να εκκρίνουν MNA και τα καρκινικά κύτταρα να ρυθμίζουν τον φαινότυπο και τη λειτουργία της TIL. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της MNA στα Τ κύτταρα, τα υγιή Τ κύτταρα-δότες ενεργοποιήθηκαν in vitro παρουσία ή απουσία MNA και αξιολογήθηκε ο πολλαπλασιασμός και η παραγωγή κυτοκινών τους. Μετά από 7 ημέρες προσθήκης MNA στην υψηλότερη δόση, ο αριθμός διπλασιασμού του πληθυσμού μειώθηκε μέτρια, ενώ η ζωντάνια διατηρήθηκε σε όλες τις δόσεις (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, η θεραπεία με εξωγενές MNA είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της αναλογίας των CD4+ και CD8+ Τ κυττάρων που εκφράζουν παράγοντα νέκρωσης όγκων-α (TNFα· Σχήμα 4Β). Αντίθετα, η ενδοκυτταρική παραγωγή IFN-γ μειώθηκε σημαντικά στα CD4+ Τ κύτταρα, αλλά όχι στα CD8+ Τ κύτταρα, και δεν υπήρξε σημαντική αλλαγή στην ιντερλευκίνη 2 (IL-2· Σχήμα 4, C και D). Συνεπώς, η ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) υπερκείμενων υγρών από αυτές τις καλλιέργειες Τ κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με MNA έδειξε σημαντική αύξηση του TNFα, μείωση της IFN-γ και καμία αλλαγή στην IL-2 (Σχήμα 4, E έως G). Η μείωση της IFN-γ υποδεικνύει ότι το MNA μπορεί να παίζει ρόλο στην αναστολή της αντικαρκινικής δράσης των Τ κυττάρων. Προκειμένου να προσομοιωθεί η επίδραση του MNA στην κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από τα Τ κύτταρα, τα χιμαιρικά κύτταρα υποδοχέα αντιγόνου Τ (FRα-CAR-T) που στοχεύουν τον υποδοχέα φυλλικού οξέος α και τα κύτταρα CAR-T (GFP) που ρυθμίζονται από την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) -CAR-T) παράγονται από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) υγιών δοτών. Τα κύτταρα CAR-T καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες παρουσία MNA και στη συνέχεια συνκαλλιεργήθηκαν με ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ωοθηκών SK-OV-3 που εκφράζουν τον υποδοχέα φυλλικού οξέος α σε αναλογία τελεστή προς στόχο 10:1. Η θεραπεία με MNA είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση της δραστικότητας θανάτωσης των κυττάρων FRα-CAR-T, η οποία ήταν παρόμοια με τα κύτταρα FRα-CAR-T που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αδενοσίνη (Σχήμα 4H).
(Α) Συνολικός αριθμός βιώσιμων κυττάρων και διπλασιασμός πληθυσμού (PD) απευθείας από καλλιέργεια την 7η ημέρα. Το ραβδόγραμμα αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο + SEM έξι υγιών δοτών. Αντιπροσωπεύει δεδομένα από τουλάχιστον n = 3 ανεξάρτητα πειράματα. (Β έως Δ) Τα CD3/CD28 και IL-2 χρησιμοποιήθηκαν για την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις MNA για 7 ημέρες. Πριν από την ανάλυση, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με PMA/ιονομυκίνη με GolgiStop για 4 ώρες. Έκφραση TNFα (Β) σε Τ κύτταρα. Παράδειγμα εικόνας (αριστερά) και δεδομένα πίνακα (δεξιά) έκφρασης TNFα σε ζωντανά κύτταρα. Έκφραση IFN-γ (C) και IL-2 (D) σε Τ κύτταρα. Η έκφραση των κυτοκινών μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Το ραβδόγραμμα αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο (n = 6 υγιείς δότες) + SEM. Χρησιμοποιήστε μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης και επαναλαμβανόμενες μετρήσεις (*P<0,05 και **P<0,01) για να προσδιορίσετε την τιμή P. Αντιπροσωπεύει δεδομένα από τουλάχιστον n = 3 ανεξάρτητα πειράματα. (E έως G) Τα CD3/CD28 και IL-2 χρησιμοποιήθηκαν για την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις MNA για 7 ημέρες. Το μέσο συλλέχθηκε πριν και μετά από 4 ώρες διέγερσης με PMA/ιονομυκίνη. Οι συγκεντρώσεις TNFα (E), IFN-γ (F) και IL-2 (G) μετρήθηκαν με ELISA. Το ραβδόγραμμα αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο (n = 5 υγιείς δότες) + SEM. Η τιμή P προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης και επαναλαμβανόμενες μετρήσεις (*P<0,05). Η διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει το όριο ανίχνευσης της ανίχνευσης. (H) Δοκιμασία κυτταρικής λύσης. Τα κύτταρα FRα-CAR-T ή GFP-CAR-T ρυθμίστηκαν με αδενοσίνη (250μM) ή MNA (10 mM) για 24 ώρες ή αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (Ctrl). Μετρήθηκε το ποσοστό θανάτωσης των κυττάρων SK-OV-3. Η τιμή P προσδιορίστηκε με δοκιμασία Welch t (*P<0,5 και **P<0,01).
Προκειμένου να κατανοηθεί μηχανιστικά η ρύθμιση της έκφρασης του TNFα που εξαρτάται από το MNA, αξιολογήθηκαν οι αλλαγές στο mRNA του TNFα των Τ κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με MNA (Σχήμα 5Α). Τα υγιή Τ κύτταρα-δότες που υποβλήθηκαν σε αγωγή με MNA έδειξαν διπλάσια αύξηση στα επίπεδα μεταγραφής του TNFα, υποδεικνύοντας ότι το MNA εξαρτάται από τη μεταγραφική ρύθμιση του TNFα. Για να διερευνηθεί αυτός ο πιθανός ρυθμιστικός μηχανισμός, αξιολογήθηκαν δύο γνωστοί παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν τον TNFα, δηλαδή ο πυρηνικός παράγοντας των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων (NFAT) και η ειδική πρωτεΐνη 1 (Sp1), σε απόκριση στη σύνδεση του MNA με τον εγγύς υποκινητή TNFα (30). Ο υποκινητής TNFα περιέχει 6 ταυτοποιημένες θέσεις σύνδεσης NFAT και 2 θέσεις σύνδεσης Sp1, που επικαλύπτονται σε μία θέση [-55 ζεύγη βάσεων (bp) από το 5'cap] (30). Η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP) έδειξε ότι όταν υποβλήθηκε σε αγωγή με MNA, η σύνδεση του Sp1 με τον υποκινητή TNFα αυξήθηκε τρεις φορές. Η ενσωμάτωση του NFAT επίσης αυξήθηκε και πλησίασε τη σημασία (Σχήμα 5Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το MNA ρυθμίζει την έκφραση του TNFα μέσω της μεταγραφής Sp1 και, σε μικρότερο βαθμό, την έκφραση του NFAT.
(Α) Σε σύγκριση με τα Τ κύτταρα που καλλιεργήθηκαν χωρίς MNA, η διπλάσια αλλαγή στην έκφραση του TNFα σε Τ κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με MNA. Το πρότυπο έκφρασης με SEM φαίνεται (n = 5 υγιείς δότες). Αντιπροσωπεύει δεδομένα από τουλάχιστον n = 3 ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Ο υποκινητής TNFα των Τ κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς 8 mM MNA μετά από NFAT και Sp1 συνδυάστηκε με (Ctrl) και διέγερση με PMA/ιονομυκίνη για 4 ώρες. Η ανοσοσφαιρίνη G (IgG) και η H3 χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί και θετικοί έλεγχοι για ανοσοκαθίζηση, αντίστοιχα. Η ποσοτικοποίηση του ChIP έδειξε ότι η σύνδεση του Sp1 και του NFAT στον υποκινητή TNFα σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με MNA αυξήθηκε αρκετές φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο. Αντιπροσωπεύει δεδομένα από τουλάχιστον n = 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η τιμή P προσδιορίστηκε με πολλαπλές t-δοκιμές (*** P <0,01). (Γ) Σε σύγκριση με τον ασκίτη του HGSC, τα Τ κύτταρα (μη κυτταροτοξικά) έδειξαν αυξημένη έκφραση TNF στον όγκο. Τα χρώματα αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς ασθενείς. Τα εμφανιζόμενα κύτταρα έχουν τυχαιοποιηθεί ως προς τα 300 και έχουν υποστεί διακύμανση για τον περιορισμό της υπερέκκρισης (** Padj = 0,0076). (D) Προτεινόμενο μοντέλο MNA για τον καρκίνο των ωοθηκών. Η MNA παράγεται σε καρκινικά κύτταρα και ινοβλάστες σε TME και προσλαμβάνεται από τα Τ κύτταρα. Η MNA αυξάνει τη σύνδεση του Sp1 με τον υποκινητή TNFα, οδηγώντας σε αυξημένη μεταγραφή του TNFα και παραγωγή κυτοκινών TNFα. Η MNA προκαλεί επίσης μείωση της IFN-γ. Η αναστολή της λειτουργίας των Τ κυττάρων οδηγεί σε μειωμένη ικανότητα θανάτωσης και επιταχυνόμενη ανάπτυξη του όγκου.
Σύμφωνα με αναφορές, ο TNFα έχει αντικαρκινικές και αντικαρκινικές επιδράσεις που εξαρτώνται από το πρόσθιο και το οπίσθιο μέρος, αλλά έχει έναν γνωστό ρόλο στην προώθηση της ανάπτυξης και της μετάστασης του καρκίνου των ωοθηκών (31-33). Σύμφωνα με αναφορές, η συγκέντρωση του TNFα στον ασκίτη και τους καρκινικούς ιστούς σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών είναι υψηλότερη από αυτή στους καλοήθεις ιστούς (34-36). Όσον αφορά τον μηχανισμό, ο TNFα μπορεί να ρυθμίσει την ενεργοποίηση, τη λειτουργία και τον πολλαπλασιασμό των λευκών αιμοσφαιρίων και να αλλάξει τον φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων (37, 38). Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, η ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης έδειξε ότι ο TNF ήταν σημαντικά αυξημένος στα Τ κύτταρα σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τον ασκίτη (Σχήμα 5C). Η αύξηση στην έκφραση του TNF ήταν εμφανής μόνο σε πληθυσμούς Τ κυττάρων με μη κυτταροτοξικό φαινότυπο (Σχήμα S5A). Συνοψίζοντας, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την άποψη ότι το MNA έχει διπλές ανοσοκατασταλτικές και προαγωγικές του όγκου επιδράσεις στο HGSC.
Η φθορίζουσα σήμανση με βάση την κυτταρομετρία ροής έχει γίνει η κύρια μέθοδος για τη μελέτη του μεταβολισμού των TIL. Αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι σε σύγκριση με τα λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος ή τα Τ κύτταρα από δευτερογενή λεμφικά όργανα, τα TIL ποντικού και ανθρώπου έχουν μεγαλύτερη τάση να προσλαμβάνουν γλυκόζη (4, 39) και σταδιακή απώλεια της μιτοχονδριακής λειτουργίας (19, 40). Παρόλο που έχουμε παρατηρήσει παρόμοια αποτελέσματα σε αυτή τη μελέτη, η βασική εξέλιξη είναι η σύγκριση του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων και των TIL από τον ίδιο αφαιρεμένο καρκινικό ιστό. Σύμφωνα με ορισμένες από αυτές τις προηγούμενες αναφορές, τα καρκινικά κύτταρα (CD45-EpCAM +) από ασκίτη και όγκους έχουν υψηλότερη πρόσληψη γλυκόζης από τα CD8 + και CD4 + Τ κύτταρα, υποστηρίζοντας ότι η υψηλή πρόσληψη γλυκόζης από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να συγκριθεί με τα Τ κύτταρα. Η έννοια του ανταγωνισμού των Τ κυττάρων. TME. Ωστόσο, η μιτοχονδριακή δραστηριότητα των καρκινικών κυττάρων είναι υψηλότερη από αυτή των CD8 + Τ κυττάρων, αλλά η μιτοχονδριακή δραστηριότητα είναι παρόμοια με αυτή των CD4 + Τ κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα ενισχύουν το αναδυόμενο θέμα ότι ο οξειδωτικός μεταβολισμός είναι σημαντικός για τα καρκινικά κύτταρα (41, 42). Υποδεικνύουν επίσης ότι τα CD8+ Τ κύτταρα μπορεί να είναι πιο ευάλωτα σε οξειδωτική δυσλειτουργία από τα CD4+ Τ κύτταρα ή ότι τα CD4+ Τ κύτταρα μπορεί να χρησιμοποιούν πηγές άνθρακα εκτός από τη γλυκόζη για να διατηρήσουν τη μιτοχονδριακή δραστηριότητα (43, 44). Πρέπει να σημειωθεί ότι δεν παρατηρήσαμε καμία διαφορά στην πρόσληψη γλυκόζης ή στη μιτοχονδριακή δραστηριότητα μεταξύ των CD4+ Τ τελεστών, της μνήμης Τ τελεστών και των Τ κεντρικών μνήμης σε ασκίτη. Ομοίως, η κατάσταση διαφοροποίησης των CD8+ Τ κυττάρων σε όγκους δεν έχει καμία σχέση με τις αλλαγές στην πρόσληψη γλυκόζης, υπογραμμίζοντας τη σημαντική διαφορά μεταξύ των Τ κυττάρων που καλλιεργήθηκαν in vitro και των ανθρώπινων TIL in vivo (22). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν επίσης από τη χρήση αμερόληπτης αυτόματης κατανομής κυτταρικού πληθυσμού, η οποία αποκάλυψε περαιτέρω ότι τα κύτταρα CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ με υψηλότερη πρόσληψη γλυκόζης και μιτοχονδριακή δραστηριότητα από τα καρκινικά κύτταρα είναι διαδεδομένα, αλλά έχουν μεταβολικά ενεργό κυτταρικό πληθυσμό. Αυτός ο πληθυσμός μπορεί να αντιπροσωπεύει τον υποτιθέμενο υποπληθυσμό των μυελοειδών κατασταλτικών κυττάρων ή των πλασματοκυτταροειδών δενδριτικών κυττάρων που εντοπίστηκαν στην ανάλυση scRNA-seq. Παρόλο που και τα δύο αυτά έχουν αναφερθεί σε όγκους ωοθηκών ανθρώπων [45], χρειάζονται περαιτέρω εργασία για να περιγραφεί αυτός ο μυελοειδής υποπληθυσμός.
Παρόλο που οι μέθοδοι που βασίζονται στην κυτταρομετρία ροής μπορούν να διευκρινίσουν τις γενικές διαφορές στον μεταβολισμό της γλυκόζης και τον οξειδωτικό μεταβολισμό μεταξύ των κυτταρικών τύπων, οι ακριβείς μεταβολίτες που παράγονται από τη γλυκόζη ή άλλες πηγές άνθρακα για τον μιτοχονδριακό μεταβολισμό στην TME δεν έχουν ακόμη προσδιοριστεί. Η αντιστοίχιση της παρουσίας ή απουσίας μεταβολιτών σε ένα δεδομένο υποσύνολο TIL απαιτεί καθαρισμό του κυτταρικού πληθυσμού από τον ιστό που έχει αφαιρεθεί. Επομένως, η μέθοδος εμπλουτισμού κυττάρων μας σε συνδυασμό με τη φασματομετρία μάζας μπορεί να παρέχει πληροφορίες για τους μεταβολίτες που είναι διαφορετικά εμπλουτισμένοι σε πληθυσμούς Τ κυττάρων και καρκινικών κυττάρων σε αντίστοιχα δείγματα ασθενών. Παρόλο που αυτή η μέθοδος έχει πλεονεκτήματα έναντι της διαλογής κυττάρων που ενεργοποιείται με φθορισμό, ορισμένες βιβλιοθήκες μεταβολιτών μπορεί να επηρεαστούν λόγω της εγγενούς σταθερότητας ή/και του γρήγορου ρυθμού ανανέωσης (22). Παρ' όλα αυτά, η μέθοδός μας ήταν σε θέση να εντοπίσει δύο αναγνωρισμένους ανοσοκατασταλτικούς μεταβολίτες, την αδενοσίνη και την κυνουρενίνη, επειδή ποικίλλουν σημαντικά μεταξύ των τύπων δειγμάτων.
Η μεταβιονομική μας ανάλυση των όγκων και των υποτύπων TIL παρέχει περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τον ρόλο των μεταβολιτών στην ωοθηκική TME. Πρώτον, χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, διαπιστώσαμε ότι δεν υπήρχε διαφορά στη μιτοχονδριακή δραστηριότητα μεταξύ των όγκων και των CD4 + Τ κυττάρων. Ωστόσο, η ανάλυση LC-MS/MS αποκάλυψε σημαντικές αλλαγές στην αφθονία των μεταβολιτών μεταξύ αυτών των πληθυσμών, υποδεικνύοντας ότι τα συμπεράσματα σχετικά με τον μεταβολισμό του TIL και τη συνολική μεταβολική του δραστηριότητα απαιτούν προσεκτική ερμηνεία. Δεύτερον, το MNA είναι ο μεταβολίτης με τη μεγαλύτερη διαφορά μεταξύ των CD45-κυττάρων και των Τ κυττάρων στον ασκίτη, όχι στους όγκους. Επομένως, η διαμερισματοποίηση και η θέση του όγκου μπορεί να έχουν διαφορετικές επιδράσεις στον μεταβολισμό του TIL, γεγονός που υπογραμμίζει την πιθανή ετερογένεια σε ένα δεδομένο μικροπεριβάλλον. Τρίτον, η έκφραση του ενζύμου NNMT που παράγει MNA περιορίζεται κυρίως στο CAF, το οποίο είναι σε μικρότερο βαθμό καρκινικά κύτταρα, αλλά παρατηρούνται ανιχνεύσιμα επίπεδα MNA σε Τ κύτταρα που προέρχονται από όγκους. Η υπερέκφραση του NNMT στο CAF των ωοθηκών έχει μια γνωστή επίδραση στην προαγωγή του καρκίνου, εν μέρει λόγω της προαγωγής του μεταβολισμού του CAF, της εισβολής του όγκου και της μετάστασης (27). Αν και το συνολικό επίπεδο TIL είναι μέτριο, η έκφραση του NNMT στο CAF σχετίζεται στενά με τον μεσεγχυματικό υποτύπο του Cancer Genome Atlas (TCGA), ο οποίος σχετίζεται με κακή πρόγνωση (27, 46, 47). Τέλος, η έκφραση του ενζύμου AOX1 που είναι υπεύθυνο για την αποικοδόμηση του MNA περιορίζεται επίσης στον πληθυσμό CAF, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα Τ κύτταρα δεν έχουν την ικανότητα να μεταβολίζουν το MNA. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την ιδέα ότι, αν και απαιτείται περαιτέρω εργασία για την επαλήθευση αυτού του ευρήματος, τα υψηλά επίπεδα MNA στα Τ κύτταρα μπορεί να υποδηλώνουν την παρουσία ενός ανοσοκατασταλτικού μικροπεριβάλλοντος CAF.
Δεδομένου του χαμηλού επιπέδου έκφρασης των μεταφορέων MNA και των μη ανιχνεύσιμων επιπέδων βασικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του MNA, η παρουσία MNA στα Τ κύτταρα είναι απροσδόκητη. Ούτε το NNMT ούτε το AOX1 μπορούσαν να ανιχνευθούν με ανάλυση scRNA-seq και στοχευμένη qPCR δύο ανεξάρτητων κοορτών. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το MNA δεν συντίθεται από τα Τ κύτταρα, αλλά απορροφάται από το περιβάλλον TME. Πειράματα in vitro δείχνουν ότι τα Τ κύτταρα τείνουν να συσσωρεύουν εξωγενές MNA.
Οι μελέτες μας in vitro έχουν δείξει ότι η εξωγενής MNA επάγει την έκφραση του TNFα στα Τ κύτταρα και ενισχύει τη σύνδεση του Sp1 με τον υποκινητή TNFα. Αν και ο TNFα έχει τόσο αντικαρκινικές όσο και αντικαρκινικές λειτουργίες, στον καρκίνο των ωοθηκών, ο TNFα μπορεί να προάγει την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών (31-33). Η εξουδετέρωση του TNFα σε καλλιέργεια κυττάρων όγκου ωοθηκών ή η εξάλειψη του σήματος TNFα σε μοντέλα ποντικών μπορεί να βελτιώσει την παραγωγή φλεγμονωδών κυτοκινών που προκαλείται από τον TNFα και να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου (32, 35). Επομένως, σε αυτήν την περίπτωση, η MNA που προέρχεται από TME μπορεί να δράσει ως προφλεγμονώδης μεταβολίτης μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από τον TNFα μέσω του αυτοκρινούς βρόχου, προάγοντας έτσι την εμφάνιση και την εξάπλωση του καρκίνου των ωοθηκών (31). Με βάση αυτή την πιθανότητα, ο αποκλεισμός του TNFα μελετάται ως πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για τον καρκίνο των ωοθηκών (37, 48, 49). Επιπλέον, η MNA επηρεάζει αρνητικά την κυτταροτοξικότητα των κυττάρων CAR-T σε κύτταρα όγκου ωοθηκών, παρέχοντας περαιτέρω στοιχεία για την ανοσοκαταστολή που προκαλείται από MNA. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ένα μοντέλο στο οποίο οι όγκοι και τα κύτταρα CAF εκκρίνουν MNA σε εξωκυτταρικό TME. Μέσω (i) της διέγερσης ανάπτυξης καρκίνου των ωοθηκών που προκαλείται από TNF και (ii) της αναστολής της κυτταροτοξικής δράσης των Τ κυττάρων που προκαλείται από MNA, αυτό μπορεί να έχει διπλή επίδραση στον όγκο (Σχήμα 5D).
Συμπερασματικά, εφαρμόζοντας έναν συνδυασμό ταχέος εμπλουτισμού κυττάρων, αλληλούχισης ενός κυττάρου και μεταβολικού προφίλ, η παρούσα μελέτη αποκάλυψε τις τεράστιες ανοσομεταβολομικές διαφορές μεταξύ των όγκων και των ασκιτικών κυττάρων σε ασθενείς με HGSC. Αυτή η ολοκληρωμένη ανάλυση έδειξε ότι υπάρχουν διαφορές στην πρόσληψη γλυκόζης και στη μιτοχονδριακή δραστηριότητα μεταξύ των Τ κυττάρων και προσδιόρισε το MNA ως έναν μη κυτταρικό αυτόνομο ανοσορυθμιστικό μεταβολίτη. Αυτά τα δεδομένα έχουν αντίκτυπο στον τρόπο με τον οποίο η TME επηρεάζει τον μεταβολισμό των Τ κυττάρων σε ανθρώπινους καρκίνους. Παρόλο που έχει αναφερθεί άμεσος ανταγωνισμός για θρεπτικά συστατικά μεταξύ Τ κυττάρων και καρκινικών κυττάρων, οι μεταβολίτες μπορούν επίσης να λειτουργήσουν ως έμμεσοι ρυθμιστές για την προώθηση της εξέλιξης του όγκου και πιθανώς την καταστολή των ενδογενών ανοσολογικών αποκρίσεων. Η περαιτέρω περιγραφή του λειτουργικού ρόλου αυτών των ρυθμιστικών μεταβολιτών μπορεί να ανοίξει εναλλακτικές στρατηγικές για την ενίσχυση της αντικαρκινικής ανοσολογικής απόκρισης.
Τα δείγματα ασθενών και τα κλινικά δεδομένα ελήφθησαν μέσω του αποθετηρίου ιστών καρκινικών όγκων της Βρετανικής Κολομβίας, το οποίο είναι πιστοποιημένο από το Καναδικό Δίκτυο Αποθετηρίων Ιστών. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο που έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Δεοντολογίας Έρευνας για τον Καρκίνο της Βρετανικής Κολομβίας και το Πανεπιστήμιο της Βρετανικής Κολομβίας (H07-00463), όλα τα δείγματα και τα κλινικά δεδομένα των ασθενών έλαβαν ενημερωμένη γραπτή συγκατάθεση ή παραιτήθηκαν επίσημα από τη συγκατάθεσή τους. Τα δείγματα φυλάσσονται στην πιστοποιημένη BioBank (BRC-00290). Τα λεπτομερή χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στους Πίνακες S1 και S5. Για την κρυοσυντήρηση, χρησιμοποιείται νυστέρι για τη μηχανική αποσύνθεση του δείγματος όγκου του ασθενούς και στη συνέχεια την ώθησή του μέσω φίλτρου 100 μικρών για να ληφθεί ένα εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων. Ο ασκίτης του ασθενούς φυγοκεντρήθηκε στις 1500 στροφές ανά λεπτό για 10 λεπτά στους 4°C για τη σφαιροποίηση των κυττάρων και την απομάκρυνση του υπερκείμενου υγρού. Τα κύτταρα που ελήφθησαν από όγκο και ασκίτη κρυοσυντηρήθηκαν σε 50% θερμικά απενεργοποιημένο ανθρώπινο ορό AB (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) και 10% διμεθυλοσουλφοξείδιο. Αυτά τα διατηρημένα εναιωρήματα μεμονωμένων κυττάρων αποψύχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για μεταβολομική και προσδιορισμό μεταβολιτών που περιγράφεται παρακάτω.
Το πλήρες μέσο αποτελείται από 0,22 μm φιλτραρισμένο 50:50 συμπληρωμένο με RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-γλουταμίνη (Thermo Fisher Scientific) συμπληρωμένο με 10% θερμικά απενεργοποιημένο ανθρώπινο ορό AB (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-γλουταμίνη (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x διάλυμα πενικιλίνης στρεπτομυκίνης (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) και 50 μMB-μερκαπτοαιθανόλη. Το AimV (Invitrogen) συμπληρωμένο με 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) και 2 mM l-γλουταμίνη (Thermo Fisher Scientific). Το ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης του κυτταρομετρητή ροής αποτελούνταν από φιλτραρισμένο φυσιολογικό ορό φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος 0,22 μm (PBS· Invitrogen) συμπληρωμένο με 3% θερμικά απενεργοποιημένο ανθρώπινο ορό AB (Sigma). Το ρυθμιστικό διάλυμα εμπλουτισμού κυττάρων αποτελείται από φιλτραρισμένο PBS 0,22 μm και συμπληρώνεται με 0,5% θερμικά απενεργοποιημένο ανθρώπινο ορό AB (Sigma-Aldrich).
Σε πλήρες μέσο στους 37°C, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 10 nM MT DR και 100 μM 2-NBDG για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με χρωστική βιωσιμότητας eF506 στους 4°C για 15 λεπτά. Επαναιωρήστε τα κύτταρα σε FC Block (eBioscience) και Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), αραιώστε σε ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης κυτταρομετρίας ροής (σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή) και επωάστε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Χρωματίστε τα κύτταρα με ένα σύνολο αντισωμάτων (Πίνακας S2) σε ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης κυτταρομετρίας ροής στους 4°C για 20 λεπτά. Επαναιωρήστε τα κύτταρα σε ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης κυτταρομετρίας ροής (Cytek Aurora· διαμόρφωση 3L-16V-14B-8R) πριν από την ανάλυση. Χρησιμοποιήστε SpectroFlo και FlowJo V10 για να αναλύσετε τα δεδομένα καταμέτρησης κυττάρων και χρησιμοποιήστε το GraphPad Prism 8 για να δημιουργήσετε τα δεδομένα. Η διάμεση ένταση φθορισμού (MFI) της 2-NBDG και της MT DR κανονικοποιήθηκε λογαριθμικά και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ένα ζευγαρωμένο t-test για στατιστική ανάλυση για να ληφθούν υπόψη οι αντίστοιχοι ασθενείς. Αφαιρέστε όλους τους πληθυσμούς με λιγότερα από 40 συμβάντα από την ανάλυση. Εισαγάγετε μια τιμή MFI 1 για τυχόν αρνητικές τιμές πριν από την εκτέλεση στατιστικής ανάλυσης και οπτικοποίησης δεδομένων.
Προκειμένου να συμπληρώσουμε τη στρατηγική χειροκίνητης πύλης του παραπάνω πίνακα διεργασιών, χρησιμοποιήσαμε την πλήρη σχολίαση από το δέντρο περιορισμού σχήματος (FAUST) (21) για να αντιστοιχίσουμε αυτόματα κύτταρα στον πληθυσμό μετά την εξάλειψη των νεκρών κυττάρων στο FlowJo. Διαχειριζόμαστε χειροκίνητα την έξοδο για να συγχωνεύσουμε πληθυσμούς που φαίνεται να έχουν κατανεμηθεί λανθασμένα (συνδυάζοντας PD1+ με PD1-καρκινικά κύτταρα) και διατηρημένους πληθυσμούς. Κάθε δείγμα περιέχει κατά μέσο όρο περισσότερα από 2% κύτταρα, για συνολικά 11 πληθυσμούς.
Για τον διαχωρισμό των PBMC από τα προϊόντα διαχωρισμού λευκοκυττάρων χρησιμοποιήθηκε φυγοκέντρηση με βαθμιδωτή πυκνότητα Ficoll (STEMCELL Technologies). Τα CD8+ Τ κύτταρα απομονώθηκαν από τα PBMC χρησιμοποιώντας CD8 MicroBeads (Miltenyi) και επεκτάθηκαν σε πλήρες μέσο χρησιμοποιώντας TransAct (Miltenyi) για 2 εβδομάδες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα αφέθηκαν να σταθούν για 5 ημέρες σε πλήρες μέσο που περιείχε IL-7 (10 ng/ml· PeproTech) και στη συνέχεια διεγέρθηκαν εκ νέου με TransAct. Την 7η ημέρα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινα CD45 MicroBeads (Miltenyi) για τον εμπλουτισμό των κυττάρων σε τρεις διαδοχικούς γύρους. Τα κύτταρα υποδιαιρέθηκαν για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (όπως περιγράφεται παραπάνω) και ένα εκατομμύριο κύτταρα υποδιαιρέθηκαν τρεις φορές για ανάλυση LC-MS/MS. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LC-MS/MS όπως περιγράφεται παρακάτω. Εκτιμήσαμε την τιμή του ελλείποντος μεταβολίτη με αριθμό ιόντων 1.000. Κάθε δείγμα κανονικοποιείται με βάση τον συνολικό αριθμό ιόντων (TIC), μετατρέπεται λογαριθμικά και κανονικοποιείται αυτόματα στο MetaboAnalystR πριν από την ανάλυση.
Το εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων κάθε ασθενούς αποψύχθηκε και διηθήθηκε μέσω φίλτρου 40 μm σε πλήρες μέσο (όπως περιγράφεται παραπάνω). Σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαδοχικοί γύροι θετικής επιλογής με διαχωρισμό μαγνητικών σφαιριδίων χρησιμοποιώντας MicroBeads (Miltenyi) για τον εμπλουτισμό των δειγμάτων για κύτταρα CD8+, CD4+ και CD45- (σε πάγο). Εν ολίγοις, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα εμπλουτισμού κυττάρων (όπως περιγράφεται παραπάνω) και καταμετρήθηκαν. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ανθρώπινα σφαιρίδια CD8, ανθρώπινα σφαιρίδια CD4 ή ανθρώπινα σφαιρίδια CD45 (Miltenyi) στους 4°C για 15 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα εμπλουτισμού κυττάρων. Το δείγμα διέρχεται από τη στήλη LS (Miltenyi) και συλλέγονται τα θετικά και αρνητικά κλάσματα. Προκειμένου να μειωθεί η διάρκεια και να μεγιστοποιηθεί το βήμα ανάκτησης κυττάρων, το κλάσμα CD8 χρησιμοποιείται στη συνέχεια για τον δεύτερο γύρο εμπλουτισμού CD4+ και το κλάσμα CD4 χρησιμοποιείται για τον επόμενο εμπλουτισμό CD45. Διατηρήστε το διάλυμα σε πάγο καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας διαχωρισμού.
Για την προετοιμασία δειγμάτων για ανάλυση μεταβολιτών, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με παγωμένο διάλυμα άλατος και προστέθηκε 1 ml μεθανόλης 80% σε κάθε δείγμα, στη συνέχεια στροβιλίστηκαν και καταψύχθηκαν ακαριαία σε υγρό άζωτο. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε τρεις κύκλους κατάψυξης-απόψυξης και φυγοκεντρήθηκαν στις 14.000 στροφές/λεπτό για 15 λεπτά στους 4°C. Το υπερκείμενο υγρό που περιείχε τους μεταβολίτες εξατμίστηκε μέχρι να στεγνώσει. Οι μεταβολίτες επαναδιαλύθηκαν σε 50 μl μυρμηκικού οξέος 0,03%, στροβιλίστηκαν για ανάμειξη και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για την απομάκρυνση των υπολειμμάτων.
Εκχυλίστε τους μεταβολίτες όπως περιγράφεται παραπάνω. Μεταφέρετε το υπερκείμενο υγρό σε φιάλη υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης για μεταβολομική έρευνα. Χρησιμοποιήστε ένα πρωτόκολλο τυχαίας επεξεργασίας για την επεξεργασία κάθε δείγματος με παρόμοιο αριθμό κυττάρων για την αποφυγή φαινομένων παρτίδας. Πραγματοποιήσαμε μια ποιοτική αξιολόγηση των συνολικών μεταβολιτών που είχε δημοσιευτεί προηγουμένως στο AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Η χρωματογραφική ανάλυση και η ολοκλήρωση της επιφάνειας κορυφής πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό MultiQuant έκδοση 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Χρησιμοποιήθηκε ένας αριθμός ιόντων 1000 για την εκτίμηση της τιμής του ελλείποντος μεταβολίτη και ο TIC κάθε δείγματος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της κανονικοποιημένης περιοχής κορυφής κάθε ανιχνευμένου μεταβολίτη για τη διόρθωση των αλλαγών που εισήχθησαν από την ενόργανη ανάλυση από την επεξεργασία του δείγματος. Μετά την κανονικοποίηση του TIC, χρησιμοποιείται το MetaboAnalystR(51) (προεπιλεγμένη παράμετρος) για λογαριθμική μετατροπή και αυτόματη κλιμάκωση γραμμής κανονικότητας. Χρησιμοποιήσαμε PCA με πακέτο vegan R για να πραγματοποιήσουμε διερευνητική ανάλυση των διαφορών μεταβολιτών μεταξύ των τύπων δειγμάτων και χρησιμοποιήσαμε ανάλυση μερικής πλεονασμού για την ανάλυση ασθενών. Χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο Ward για να κατασκευάσουμε ένα δενδρογράφημα θερμικού χάρτη για να ομαδοποιήσουμε την Ευκλείδεια απόσταση μεταξύ των δειγμάτων. Χρησιμοποιήσαμε το limma (52) για την τυποποιημένη αφθονία μεταβολιτών για να εντοπίσουμε διαφορικά άφθονους μεταβολίτες σε ολόκληρο τον κυτταρικό τύπο και το μικροπεριβάλλον. Για να απλοποιήσουμε την εξήγηση, χρησιμοποιούμε την παράμετρο μέσου όρου ομάδας για να καθορίσουμε το μοντέλο και λαμβάνουμε υπόψη τους κυτταρικούς τύπους στο μικροπεριβάλλον ως κάθε ομάδα (n = 6 ομάδες). Για τη δοκιμή σημαντικότητας, πραγματοποιήσαμε τρεις επαναλαμβανόμενες μετρήσεις για κάθε μεταβολίτη. Προκειμένου να αποφευχθεί η ψευδής αναπαραγωγή, ο ασθενής συμπεριλήφθηκε ως εμπόδιο στο σχεδιασμό του λίμματος. Προκειμένου να ελεγχθούν οι διαφορές στους μεταβολίτες μεταξύ διαφορετικών ασθενών, προσαρμόσαμε το μοντέλο λίμματος συμπεριλαμβάνοντας τους ασθενείς με σταθερό τρόπο. Αναφέρουμε τη σημαντικότητα της προκαθορισμένης αντίθεσης μεταξύ του κυτταρικού τύπου και του μικροπεριβάλλοντος Padj <0,05 (διόρθωση Benjamini-Hochberg).
Μετά από εμπλουτισμό με ζωηρό τρόπο χρησιμοποιώντας το Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% βιωσιμότητα), πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση μεταγραφώματος ενός κυττάρου στο σύνολο των ζωντανών κατεψυγμένων ασκιτών και δειγμάτων όγκων χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο έκφρασης γονιδίου 10x 5'. Αναλύθηκαν πέντε περιπτώσεις με αντίστοιχους όγκους και ασκίτες, αν και η χαμηλή βιωσιμότητα από ένα δείγμα όγκου εμπόδισε την ένταξή του. Προκειμένου να επιτευχθούν πολλαπλές επιλογές ασθενών, συνδυάσαμε τα δείγματα κάθε ασθενούς στις λωρίδες του ελεγκτή χρωμίου 10x και αναλύσαμε ξεχωριστά τους ασκίτες και τις θέσεις του όγκου. Μετά την αλληλούχιση [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp ζευγαρωμένο άκρο (PE), γονιδίωμα του Κεμπέκ; Με μέσο όρο 73.488 και 41.378 αναγνώσεις ανά κύτταρο για όγκο και ασκίτη αντίστοιχα]], χρησιμοποιήσαμε το CellSNP και το Vireo (53) (με βάση το CellSNP ως). Στο κοινό ανθρώπινο SNP (VCF) που παρέχεται από το GRCh38 έχει εκχωρηθεί μια ταυτότητα δότη. Χρησιμοποιούμε το SNPRelate για να συμπεράνουμε την πλησιέστερη ταυτότητα (IBS) της κατάστασης γονότυπου του ασθενούς (IBS), εξαιρώντας τα μη εκχωρημένα κύτταρα και τα κύτταρα που αναγνωρίστηκαν ως διπλά κύτταρα και τους αντίστοιχους δότες μεταξύ ασκίτη και δειγμάτων όγκου (54). Με βάση αυτήν την εργασία, διατηρήσαμε τρεις περιπτώσεις με άφθονη κυτταρική αναπαράσταση στον όγκο και τον ασκίτη για ανάλυση κατάντη. Αφού εκτελέσαμε ένα βήμα μαζικής διήθησης στη συσκευασία BioConductor scater (55) και scran (56), αυτό απέδωσε 6975 κύτταρα (2792 και 4183 κύτταρα από όγκο και ασκίτη, αντίστοιχα) για ανάλυση. Χρησιμοποιούμε την ομαδοποίηση Louvain του κοινόχρηστου δικτύου πλησιέστερων γειτόνων (SNN) του igraph (57) με βάση την απόσταση Jaccard από τα κύτταρα ομαδοποίησης με βάση την έκφραση. Οι συστάδες σχολιάστηκαν χειροκίνητα σε πιθανούς κυτταρικούς τύπους με βάση την έκφραση γονιδίων δεικτών και απεικονίστηκαν με t-SNE. Τα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα ορίζονται από την έκφραση CD8A και GZMA, εξαιρουμένων των υποσυστάδων με χαμηλή έκφραση ριβοσωμικής πρωτεΐνης. Αποκτήσαμε πρόσβαση στα δημοσιευμένα δεδομένα των Izar et al. (16), συμπεριλαμβανομένης της ενσωμάτωσης t-SNE, που μπορεί να ελέγξει την επικάλυψη έκφρασης μεταξύ δεικτών ανοσοκυττάρων και έκφρασης NNMT.
Τα PBMC διαχωρίστηκαν από τα προϊόντα διαχωρισμού λευκοκυττάρων (STEMCELL Technologies) με φυγοκέντρηση βαθμιδωτής πυκνότητας Ficoll. Τα κύτταρα CD3+ απομονώθηκαν από τα PBMC χρησιμοποιώντας σφαιρίδια CD3 (Miltenyi). Παρουσία ή απουσία MNA, τα κύτταρα CD3+ ενεργοποιήθηκαν με CD3 συνδεδεμένο στην πλάκα (5μg/ml), διαλυτό CD28 (3μg/ml) και IL-2 (300 U/ml· Proleukin). Την τελευταία ημέρα της επέκτασης, η βιωσιμότητα (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) και ο πολλαπλασιασμός (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Αξιολογήστε τη λειτουργία του τελεστή διεγείροντας τα κύτταρα με PMA (20 ng/ml) και ιονομυκίνη (1 μg/ml) με GolgiStop για 4 ώρες και παρακολουθήστε τα CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) και ισοθειοκυανικό TNFα-φλουορεσκεΐνης (FITC) (MAb11, BD). Διεγείρετε τα κύτταρα qPCR και ChIP με PMA (20 ng/ml) και ιονομυκίνη (1 μg/ml) για 4 ώρες. Το υπερκείμενο υγρό ELISA συλλέχθηκε πριν και μετά τη διέγερση με PMA (20 ng/ml) και ιονομυκίνη (1 μg/ml) για 4 ώρες.
Ακολουθήστε το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για να απομονώσετε το RNA χρησιμοποιώντας το RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Χρησιμοποιήστε το QIAshredder (QIAGEN) για να ομογενοποιήσετε το δείγμα. Χρησιμοποιήστε το κιτ υψηλής χωρητικότητας RNA προς cDNA (Thermo Fisher Scientific) για να συνθέσετε συμπληρωματικό DNA (cDNA). Χρησιμοποιήστε το TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) για να ποσοτικοποιήσετε την έκφραση γονιδίων (σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή) με τους ακόλουθους ανιχνευτές: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [γλυκεραλδεΰδη-3-φωσφορική εκτός υδρογόνου (GAPDH)] και Hs01010726_m1 (SLC22A2). Τα δείγματα αναλύθηκαν στο σύστημα PCR πραγματικού χρόνου StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) στην πλάκα γρήγορης οπτικής αντίδρασης 96 φρεατίων MicroAmp (Applied Biosystems) με οπτική μεμβράνη MicroAmp. Οποιαδήποτε τιμή Ct που υπερβαίνει το 35 θεωρείται ότι είναι πάνω από το όριο ανίχνευσης και χαρακτηρίζεται ως μη ανιχνεύσιμη.
Εκτελέστε την ChIP όπως περιγράφηκε προηγουμένως (58). Εν ολίγοις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φορμαλδεΰδη (τελική συγκέντρωση 1,42%) και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Χρησιμοποιήστε συμπληρωμένο ρυθμιστικό διάλυμα διόγκωσης (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl και 0,1% NP-40) σε πάγο για 10 λεπτά και στη συνέχεια επαναιωρήστε σε ρυθμιστικό διάλυμα ανοσοκαθίζησης όπως περιγράφεται (58). Το δείγμα στη συνέχεια υποβλήθηκε σε υπερήχους με τους ακόλουθους κύκλους: 10 κύκλοι (20 παλμοί του 1 δευτερολέπτου) και στατικό χρόνο 40 δευτερολέπτων. Επωάστε αντισώματα ανοσοσφαιρίνης G (Cell Signaling Technology· 1μl), ιστόνης H3 (Cell Signaling Technology· 3μl), NFAT (Invitrogen· 3μl) και SP1 (Cell Signaling Technology· 3μl) βαθμού ChIP με το δείγμα στους 4°CC, ανακινήστε όλη τη νύχτα. Επωάστε τα σφαιρίδια πρωτεΐνης Α (Thermo Fisher Scientific) με το δείγμα στους 4°C με απαλή ανακίνηση για 1 ώρα, στη συνέχεια χρησιμοποιήστε σφαιρίδια chelex (Bio-Rad) για να εμπλουτίσετε το DNA και χρησιμοποιήστε πρωτεϊνάση Κ (Thermo Fisher) για την πέψη των πρωτεϊνών. Ο υποκινητής TNFα ανιχνεύθηκε με PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT· αντίθετα, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (προϊόν 207 bp). Οι εικόνες δημιουργήθηκαν από το Image Lab (Bio-Rad) και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.
Το υπερκείμενο υγρό της κυτταροκαλλιέργειας συλλέχθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Ο προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις διαδικασίες του κατασκευαστή για το κιτ ELISA ανθρώπινου TNFα (Invitrogen), το κιτ ELISA ανθρώπινης IL-2 (Invitrogen) και το κιτ ELISA ανθρώπινης IFN-γ (Abcam). Σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, το υπερκείμενο υγρό αραιώθηκε σε αναλογία 1:100 για την ανίχνευση TNFα και IL-2 και σε αναλογία 1:3 για την ανίχνευση IFN-γ. Χρησιμοποιήστε το EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) για τη μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm.
Τα PBMC διαχωρίστηκαν από τα προϊόντα διαχωρισμού λευκοκυττάρων (STEMCELL Technologies) με φυγοκέντρηση βαθμιδωτής πυκνότητας Ficoll. Τα κύτταρα CD3+ απομονώθηκαν από τα PBMC χρησιμοποιώντας σφαιρίδια CD3 (Miltenyi). Παρουσία ή απουσία MNA, τα κύτταρα CD3+ ενεργοποιήθηκαν με CD3 συνδεδεμένο στην πλάκα (5μg/ml), διαλυτό CD28 (3μg/ml) και IL-2 (300 U/ml· Proleukin) για 3 ημέρες. Μετά από 3 ημέρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με 0,9% αλατούχο διάλυμα και το ίζημα καταψύχθηκε ακαριαία. Η καταμέτρηση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Cytek Aurora· διαμόρφωση 3L-16V-14B-8R) χρησιμοποιώντας 123count eBeads.
Εκχυλίστε τους μεταβολίτες όπως περιγράφεται παραπάνω. Το ξηρό εκχύλισμα ανασυστάθηκε σε συγκέντρωση 4000 κυτταρικών ισοδυνάμων/μl. Αναλύστε το δείγμα με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) και στήλη CORTECS T3 (2,1×150 mm, μέγεθος σωματιδίων 1,6 μm, μέγεθος πόρων 120 Å; #186008500, Waters). Φασματόμετρο πολικής μάζας (6470, Agilent), στο οποίο ο ιονισμός ηλεκτροψεκασμού λειτουργεί σε θετική λειτουργία. Η κινητή φάση Α είναι 0,1% μυρμηκικό οξύ (σε H2O), η κινητή φάση Β είναι 90% ακετονιτρίλιο, 0,1% μυρμηκικό οξύ. Η διαβάθμιση LC είναι 0 έως 2 λεπτά για το 100% A, 2 έως 7,1 λεπτά για το 99% B και 7,1 έως 8 λεπτά για το 99% B. Στη συνέχεια, επαναφέρετε τη στήλη σε ισορροπία με την κινητή φάση A με ρυθμό ροής 0,6 ml/min για 3 λεπτά. Ο ρυθμός ροής είναι 0,4 ml/min και ο θάλαμος της στήλης θερμαίνεται στους 50°C. Χρησιμοποιήστε το καθαρό χημικό πρότυπο της MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Καναδάς) για να καθορίσετε τον χρόνο κατακράτησης (RT) και τον μετασχηματισμό (RT = 0,882 λεπτά, μετασχηματισμός 1 = 137→94,1, μετασχηματισμός 2 = 137→92, Μετατροπή 3 = 137→78). Όταν και οι τρεις μεταβάσεις συμβούν στον σωστό χρόνο κατακράτησης, η μετάβαση 1 χρησιμοποιείται για ποσοτικοποίηση για να διασφαλιστεί η εξειδίκευση. Η πρότυπη καμπύλη της MNA (Toronto Research Chemical Company) δημιουργήθηκε με έξι διαδοχικές αραιώσεις του αρχικού διαλύματος (1 mg/ml) για να ληφθούν πρότυπα 0,1, 1,0, 10 και 100 ng/ml και 1,0 και 10μg/ml αντίστοιχα σε υγρό. Το όριο ανίχνευσης είναι 1 ng/ml και η γραμμική απόκριση κυμαίνεται μεταξύ 10 ng/ml και 10μg/ml. Κάθε ένεση δύο μικρολίτρων δείγματος και προτύπου χρησιμοποιείται για ανάλυση LC/MS και ένα μεικτό δείγμα ποιοτικού ελέγχου διενεργείται κάθε οκτώ ενέσεις για να διασφαλιστεί η σταθερότητα της πλατφόρμας ανάλυσης. Οι αποκρίσεις MNA όλων των δειγμάτων κυττάρων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MNA ήταν εντός του γραμμικού εύρους της δοκιμασίας. Η ανάλυση δεδομένων έγινε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ποσοτικής ανάλυσης MassHunter (v9.0, Agilent).
Το κατασκεύασμα αFR-CAR δεύτερης γενιάς ελήφθη από τους Song et al. (59). Εν ολίγοις, το κατασκεύασμα περιέχει τα ακόλουθα περιεχόμενα: αλληλουχία οδηγό CD8a, ανθρώπινο αFR-ειδικό μεταβλητό θραύσμα μονής αλυσίδας, περιοχή άρθρωσης και διαμεμβράνης CD8a, ενδοκυτταρική περιοχή CD27 και ενδοκυτταρική περιοχή CD3z. Η πλήρης αλληλουχία CAR συντέθηκε από την GenScript και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στον φορέα έκφρασης λεντοϊού δεύτερης γενιάς ανοδικά της κασέτας έκφρασης GFP που χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας μεταγωγής.
Ο φακοϊός παράγεται με μεταμόσχευση κυττάρων HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC)]. Αναπτύχθηκε σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco's Eagle που περιείχε 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδών (FBS) και 1% PenStrep, και χρησιμοποιήθηκε φορέας CAR-GFP. Τα πλασμίδια συσκευασίας (psPAX2 και pMD2.G, Addgene) χρησιμοποίησαν αμίνη λιπομετατροπής (Sigma-Aldrich). Το υπερκείμενο που περιείχε τον ιό συλλέχθηκε 48 και 72 ώρες μετά τη μεταμόσχευση, διηθήθηκε και συμπυκνώθηκε με υπερφυγοκέντρηση. Φυλάξτε το συμπυκνωμένο ιικό υπερκείμενο στους -80°C μέχρι τη μεταμόσχευση.
Τα PBMC διαχωρίζονται από τα προϊόντα διαχωρισμού λευκοκυττάρων υγιών δοτών (STEMCELL Technologies) με φυγοκέντρηση βαθμιδωτής πυκνότητας Ficoll. Χρησιμοποιήστε μικροσφαιρίδια CD8 θετικής επιλογής (Miltenyi) για την απομόνωση κυττάρων CD8+ από PBMC. Διεγείρετε τα Τ κύτταρα με TransAct (Miltenyi) και σε μέσο TexMACS [Miltenyi· συμπληρωμένο με 3% θερμικά απενεργοποιημένο ανθρώπινο ορό, 1% PenStrep και IL-2 (300 U/ml)]. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη διέγερση, τα Τ κύτταρα μεταλλάχθηκαν με φακοϊό (10 μl συμπυκνωμένου υπερκείμενου ιού ανά 106 κύτταρα). 1 έως 3 ημέρες μετά τη μεταγωγή σε Cytek Aurora (σε FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), αξιολογήστε την έκφραση GFP των κυττάρων για να καταδείξετε αποτελεσματικότητα μεταγωγής τουλάχιστον 30%.
Τα κύτταρα CAR-T καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε Immunocult (STEMCELL Technologies, συμπληρωμένο με 1% PenStrep) υπό τις ακόλουθες συνθήκες: χωρίς αγωγή, υποβλήθηκαν σε αγωγή με 250 μM αδενοσίνη ή 10 mM MNA. Μετά την προεπεξεργασία, τα κύτταρα CAR-T πλύθηκαν με PBS και συνδυάστηκαν με 20.000 κύτταρα SK-OV-3 [ATCC, σε μέσο McCoy 5A (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% PenStrep στους 10°C: Η αναλογία τελεστή προς στόχο 1 ενισχύθηκε εις τριπλούν σε συμπληρωμένο μέσο Immunocult. Τα κύτταρα SK-OV-3 και τα κύτταρα SK-OV-3 που λύθηκαν με σαπωνίνη δακτυλίτιδας (0,5mg/ml, Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες, αντίστοιχα. Μετά από 24 ώρες συγκαλλιέργειας, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και η γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Το υπερκείμενο LDH αραιώθηκε 1:50 σε ρυθμιστικό διάλυμα LDH. Το ποσοστό θανάτωσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: ποσοστό θανάτωσης = ποσοστό διόρθωσης / μέγιστο ποσοστό θανάτωσης x 100%, όπου ποσοστό διόρθωσης = συγκαλλιέργεια μόνο Τ κύτταρα και μέγιστο ποσοστό θανάτωσης = θετικός έλεγχος-αρνητικός έλεγχος.
Όπως περιγράφεται στο κείμενο ή στα υλικά και τις μεθόδους, χρησιμοποιήστε το GraphPad Prism 8, το Microsoft Excel ή το R v3.6.0 για στατιστική ανάλυση. Εάν συλλεχθούν πολλά δείγματα από τον ίδιο ασθενή (όπως ασκίτης και όγκος), χρησιμοποιούμε ένα ζευγαρωμένο t-test ή συμπεριλαμβάνουμε τον ασθενή ως τυχαίο αποτέλεσμα σε ένα γραμμικό ή γενικευμένο μοντέλο, ανάλογα με την περίπτωση. Για τη μεταβολομική ανάλυση, το test σημαντικότητας εκτελείται εις τριπλούν.
Για συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο, ανατρέξτε στη διεύθυνση http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης που διανέμεται σύμφωνα με τους όρους της Άδειας Creative Commons Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση, η οποία επιτρέπει τη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​εφόσον η τελική χρήση δεν αποσκοπεί σε εμπορικό κέρδος και η προϋπόθεση είναι ότι το πρωτότυπο έργο είναι σωστό. Αναφορά.
Σημείωση: Σας ζητάμε μόνο να δώσετε τη διεύθυνση email σας, ώστε το άτομο που προτείνετε στη σελίδα να γνωρίζει ότι θέλετε να δει το email και ότι δεν είναι ανεπιθύμητο. Δεν θα καταγράψουμε καμία διεύθυνση email.
Αυτή η ερώτηση χρησιμοποιείται για να ελεγχθεί εάν είστε επισκέπτης και να αποτραπεί η αυτόματη υποβολή ανεπιθύμητων μηνυμάτων.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson (Brad H.NelsonR. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Η MNA συμβάλλει στην ανοσοκαταστολή των Τ κυττάρων και αποτελεί έναν πιθανό στόχο ανοσοθεραπείας για τη θεραπεία του καρκίνου στον άνθρωπο.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson (Brad H.NelsonR. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Η MNA συμβάλλει στην ανοσοκαταστολή των Τ κυττάρων και αποτελεί έναν πιθανό στόχο ανοσοθεραπείας για τη θεραπεία του καρκίνου στον άνθρωπο.
©2021 American Association for the Advancement of Science. διατηρούνται όλα τα δικαιώματα. Η AAAS είναι συνεργάτης των HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef και COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.